从脂肪组织血管前体细胞分化出白色和米色脂肪细胞在改善肥胖相关代谢方面具有潜在价值。本文描述了从人类脂肪组织中分离CD34+CD31+内皮细胞以及后续的分化方案 体外 扩增及向白色和米色脂肪细胞的分化。文中讨论了多种下游应用。
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摘要
摘要
肥胖伴随着脂肪组织的广泛重塑，主要通过脂肪细胞肥大实现。脂肪细胞的过度生长会导致对胰岛素反应不良、局部缺氧和炎症。通过促进前体细胞分化为功能性白色脂肪细胞，可防止脂肪细胞群体的极端肥大，从而改善脂肪组织的代谢健康，并减轻炎症。此外，通过促进米色/棕色脂肪细胞的分化，可增加机体总能量消耗，进而导致体重减轻。这一策略有望预防肥胖相关合并症的发生，例如2型糖尿病和心血管疾病。
本文描述了从共表达 CD31 和 CD34 标志物的人类脂肪组织内皮细胞亚群中分离、扩增和诱导白色及米色脂肪细胞分化的方法。该方法成本相对较低，且不需耗费大量人力。该技术需要获取人类脂肪组织，皮下脂肪库适用于取样。在本实验方案中，于减重手术过程中收集病态肥胖受试者[体重指数（BMI）>35]的新鲜脂肪组织样本。通过从基质血管组分进行连续免疫分离，仅需 2–3 克脂肪即可获得足够数量的细胞。这些细胞可在体外培养中扩增 10–14 天，可进行冷冻保存，并在传代至第 5–6 代时仍保持其成脂分化能力。细胞使用含人胰岛素和 PPARγ 激动剂罗格列酮的成脂诱导剂混合物处理 14 天。
该方法可用于获得脂肪组织内皮细胞中驱动成脂反应的分子机制的概念验证实验，或用于筛选能够增强定向分化为白色或米色/棕色脂肪细胞的成脂反应的新药。利用小的皮下活检样本，该方法可用于在旨在刺激米色/棕色和白色脂肪细胞以治疗肥胖及其合并症的临床试验中，筛选出无反应的受试者。
引言
最近的证据表明，在小鼠和人类中，存在于脂肪组织血管中的一类细胞可分化为白色或米色/棕色脂肪细胞1,2,3。这类细胞的表型尚存争议，有研究支持其为内皮细胞、平滑肌/周细胞，或一系列中间表型4,5,6,7。本方法的开发旨在检测从肥胖个体不同脂肪库中分离出的CD34+CD31+内皮细胞的脂肪生成潜能。文献中其他研究主要关注整个基质血管组分或已知脂肪细胞前体细胞的脂肪生成能力2,8,9。由于目前已有技术可特异性地将药物递送至脂肪组织内皮细胞10，因此了解这些细胞向白色或米色脂肪细胞诱导分化的潜能，对未来实现靶向治疗具有重要意义。
不同研究团队已报道将 CD31 与 CD34 标记物的组合用作从人脂肪组织中分离内皮细....
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方案
东弗吉尼亚医学院的机构审查委员会批准了本研究及所用人体脂肪组织样本的采集。已从患者处获得知情书面同意。
1. 缓冲液、培养基和仪器的准备
- 配制克雷布斯-林格碳酸氢盐缓冲液（KRBBS）：135 mM 氯化钠、5 mM 氯化钾、1 mM 硫酸镁、0.4 mM 磷酸氢二钾、5.5 mM 葡萄糖、1 mM 腺苷、0.01% 抗生素/抗真菌素混合液（含青霉素 50 µg/mL、链霉素 50 µg/mL、庆大霉素 30 µg/mL、两性霉素 15 ng/mL）以及 10 mM HEPES（pH = 7.4）。该溶液每次组织采集和消化前均需新鲜配制。
- 配制新鲜的胶原酶溶液：将 1 型胶原酶以 1 mg/mL 的浓度溶于 KRBSS 中，每克脂肪组织使用 3 mL。在组织消化前，将胶原酶溶液置于 37 °C 水浴中预热。
- 配制 CD34 细胞分离缓冲液：在无菌磷酸盐缓冲液（PBS）中加入 2% 胎牛血清（FBS）和 1 mM EDTA。
- 配制脂肪生成培养基：DMEM/F12 培养基，添加 5% FBS、50 µg/mL 青霉素/链霉素、1.25 µL/mL 人胰岛素（终浓度为 5 µg/mL 或 144 mU/mL）以及 0.36 µL/mL 的 2.8 mM 罗格列酮溶液（终浓度为 1 µM）。
- 配制 0.3% 油红 O（ORO）储备液（质量/体积）：将 0.3 g 油红 O 溶解于 ....
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结果
我们的方案旨在提供一种 体外 评估不同部位人脂肪组织中CD34+CD31+血管细胞成脂潜能的方法。简化流程图如图所示。 图1A. 通过正向筛选表达 CD34 的细胞，第一步可获得 > 95% 的 CD34+ 细胞存在于新鲜分离细胞群体中（图1A）。重要的是，这些细胞在传代培养几次后该标志物即会丢失。由于CD34是多种造血和非造血前体细胞的共同标志物，因此接下来分离内皮前体细胞所需的步骤是从CD34+细胞群体中通过阳性选择富集CD31+细胞（图1A）。尽管CD31是内皮细胞的标志物，但也可能存在于某些造血细胞亚群中。我们通过流式细胞术分析了来自大网膜和皮下脂肪的多个样本， consistently 发现CD34+CD31+细胞不表达CD45标志物（图1B，上图面板）。通常情况下， <总细胞群中仅有1%的细胞呈.......
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讨论
本文的重点是提供一种从人体内脏和皮下脂肪组织库中分离、扩增和诱导CD34+CD31+内皮细胞脂肪生成的方法。
已有文献报道了从啮齿类动物或人类不同血管床中分离内皮细胞的方法，这些方法主要采用荧光标记或磁珠偶联的CD31抗体18,19,20,21,22,23。这些分离技术在普遍应用中的主要挑战在于不同血管床内皮细胞群体的异质性，以及易受成纤维细胞和血管壁细胞污染的高风险。然而，已有研究报道对分离技术进行了优化，以避免此类污染24。使用这些技术通常从组织中分离出的是成熟内皮细胞。脂肪组织是干细胞/前体细胞的重要储存库，其中包括内皮前体细胞
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者希望感谢Sentara减重中心的临床协调员Becky Marquez，她在患者筛选和知情同意过程中提供了帮助。本研究由Anca D. Dobrian获得R15HL114062基金支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 大型设备 | |||
| 生物安全柜 | Nuaire | nu-425-400 | |
| 细胞培养箱 | Thermo-Fisher Scientific | 800 DH | |
| 水浴 | Forma Scientific | 2568 | 双向振荡器 |
| RT-PCR仪 | BIO-RAD | CFX96-C1000 | |
| 电泳槽 | BIO-RAD | Mini PROTEAN 3 电泳槽 | |
| 转膜电泳槽 | BIO-RAD | Mini Trans-Blot 细胞转移装置 | |
| 电泳电源 | BIO-RAD | PowerPac Basic | |
| ELISA 阅读仪 | Molecular Devices | SpectraMax M5 | |
| 印迹读取器 | LI-COR | 奥德赛 | 近红外 |
| 冷藏离心机 | Eppendorf | 5810 R | |
| 台式离心机 | Eppendorf | MiniSpin Plus | |
| 荧光显微镜 | Olympus | BX50 | |
| 倒置显微镜 | 尼康 | 经颅磁刺激 | |
| KRBSS 缓冲液 | |||
| HEPES | 研究产品国际公司 | H75030 | |
| 碳酸氢钠 | Sigma-Aldrich | 792519 | |
| 二水合氯化钙 | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| 磷酸二氢钾 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| 硫酸镁 | Sigma-Aldrich | M2643 | |
| 氯化钠 | Sigma-Aldrich | 746398 | |
| 磷酸二氢钠一水合物 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| 氯化钾 | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| 葡萄糖 | Acros Organics | 410950010 | |
| 腺苷 | Acros Organics | 164040250 | |
| 牛血清白蛋白 | GE Healthcare Bio-Sciences | SH30574.02 | |
| 青霉素/链霉素 | 赛默飞世尔科技 | 15070063 | |
| 组织消化 | |||
| 20 mL 注射器 | 全球医学 | 67-2020 | |
| 尼龙筛网，250 µm | Sefar | 03-250/50 | |
| 移液针头 | Popper | 7934 | |
| 精细剪刀 | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| 组织镊 | George Tiemann &和公司 | 160-20 | |
| I型胶原酶 | 沃辛顿生化 | LS004196 | |
| 培养皿，100 mm | USA Scientific | 5666-4160 | TC 处理组 |
| Eppendorf 管，1.5 mL | USA Scientific | 1615-5500 | |
| 锥形管，15 mL | Nest Scientific | 601052 | |
| 50 mL 锥形管 | Nalgene | 3119-0050 | |
| 闪烁瓶 | Kimble | 74505-20 | 组织切碎 |
| 细胞分离 | |||
| Cellometer | Nexcelom | Auto 2000 | |
| Cellometer 载玻片 | Nexcelom | CHT4-SD100-002 | |
| Cellometer 活率染色剂 | Nexcelom | CS2-0106-5mL | 吖啶橙/碘化丙啶 |
| 抗CD34磁珠 | StemCell Technologies | 18056 | 试剂盒 |
| EasySep 磁铁 | StemCell Technologies | 18000 | |
| 抗 CD31 塑料微珠 | pluriSelect USA | 19-03100-10 | |
| pluriSelect 10x 洗涤缓冲液 | pluriSelect USA | 60-00080-10 | |
| pluriSelect 连接环 | pluriSelect USA | 41-50000-03 | |
| pluriSelect 解离缓冲液 | pluriSelect USA | 60-00046-12 | |
| pluriSelect 孵育缓冲液 | pluriSelect USA | 60-00060-12 | |
| pluriSelect S 细胞筛 | pluriSelect USA | 43-50030-03 | |
| 细胞培养 | |||
| 6孔板 | USA Scientific | CC7682-7506 | TC 处理 |
| 4孔板腔载玻片 | 康宁生命科学 | 354559 | 纤维连接蛋白包被 |
| 4孔板载玻片 | Thermo-Fisher Scientific | 154526PK | 未包被玻璃 |
| 人脂肪微血管内皮细胞（HAMVEC） | Sciencell 研究实验室 | 7200 | 原代细胞系 |
| 内皮细胞培养基（ECM） | ScienCell 研究实验室 | 1001 | 完整试剂盒 |
| DMEM/F12 基础培养基 | Thermo-Fisher Scientific | 11320082 | |
| 胎牛血清（FBS） | Rocky Mountain Biologicals | FBS-BBT | |
| 胰岛素 | Lilly | U-100 | 优泌乐 |
| 罗格列酮 | Sigma-Aldrich | R2408 | |
| 细胞分析 | |||
| 油红O染料 | Sigma-Aldrich | O0625 | 在异丙醇中配制 |
| 96 孔板 | USA Scientific | 1837-9600 | |
| 96孔PCR板 | Genesee Scientific | 24-300 | |
| RNA提取 | Zymo Research | R2072 | 试剂盒 |
| cDNA合成 | BIO-RAD | 1708841 | Supermix |
| JumpStart PCR聚合酶 | Sigma-Aldrich | D9307-250UN | 热启动，使用 PCR Buffer N |
| 氯化镁溶液 | Sigma-Aldrich | M8787-5ML | PCR 反应中终浓度为 3 mM |
| dNTPs | Promega | U1515 | |
| TaqMan AdipoQ | Thermo-Fisher Scientific | Hs00605917_m1 | |
| TaqMan CIDEA | Thermo-Fisher Scientific | Hs00154455_m1 | |
| TaqMan RPL27 | 赛默飞世尔科技 | Hs03044961_g1 | |
| TaqMan UCP1 | Thermo-Fisher Scientific | Hs00222453_m1 | |
| BCA 法测定 | Sigma-Aldrich | QPBCA-1KT | 试剂盒 |
| 双丙烯酰胺 | BIO-RAD | 1610146 | 40% 储备液 |
| 过硫酸铵 | BIO-RAD | 1610700 | |
| TEMED | BIO-RAD | 1610800 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| 甘氨酸 | BIO-RAD | 1610718 | |
| 十二烷基硫酸钠 | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| EDTA | Fisher Scientific | S311-100 | |
| 溴酚蓝 | Sigma-Aldrich | B8026 | |
| 转膜 | EMD Millipore | IPFL00010 | |
| 甲醇 | Fisher Scientific | A452-SK4 | |
| Odyssey封闭缓冲液，Tris | LI-COR | 927-50000 | |
| 抗AKT抗体 | Cell Signaling Technology | 2920S | 小鼠单克隆 |
| 抗pAKT抗体 | Cell Signaling Technology | 9271S | 兔多克隆 |
| 抗UCP1抗体 | Abcam | ab10983 | 兔多克隆 |
| 抗小鼠 IgG 抗体 | LI-COR | 926-68070 | 山羊多克隆，IRDye 680RD |
| 抗兔IgG抗体 | LI-COR | 926-32211 | 山羊多克隆，IRDye 800CW |
| 抗兔IgG抗体 | Jackson ImmunoResearch | 111-025-003 | 山羊多克隆，TRITC |
| 磷酸盐缓冲液 | 赛默飞世尔科技 | 10010049 | |
| 37% 甲醛溶液 | Electron Microscopy Sciences | 15686 | 用于细胞固定的4%溶液 |
| 正常山羊血清 | Vector Laboratories | S-1000 | 10% 封闭液 |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X-100 | 0.1% 透化溶液 |
| DAPI | Thermo-Fisher Scientific | D1306 | |
| Calcein AM | 赛默飞世尔科技 | 65-0853-39 | 细胞荧光成像 |
| Matrigel 基底膜基质 | 康宁生命科学 | 356231 | 生长因子减少 |
| DiI 标记的乙酰化低密度脂蛋白 | Thermo-Fisher Scientific | L3484 |
参考文献
- Tang, W., et al. White fat progenitor cells reside in the adipose vasculature. Science. 322 (5901), 583-586 (2008).
- Lee, Y. H., Petkova, A. P., Granneman, J. G. Identification of an adipogenic niche for adipose tissue remodeling and restoration. Cell Metaboli....
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