生物体在其生命周期中面临的最具挑战性的应激条件之一是氧化剂的积累。在氧化应激过程中，细胞高度依赖分子伴侣。本文介绍了用于研究氧化还原调控的抗聚集活性的方法，以及利用氢氘交换质谱（HDX-MS）监测调控伴侣功能的结构变化的方法。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
方法文章
利用氢氘交换质谱法定义Hsp33的氧化还原调控型分子伴侣活性并绘制其构象变化
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
生物体在其生命周期中经常需要应对不断变化的环境，包括温度、pH值的变化以及活性氧物质的积累等。这些波动可能导致蛋白质广泛去折叠、聚集，甚至引发细胞死亡。因此，细胞在进化过程中形成了一套动态且应激特异性的分子伴侣网络，以在应激条件下维持“健康”的蛋白质组。非ATP依赖型分子伴侣是分子伴侣的一大类别，作为一线防御分子，在应激依赖的方式下防止蛋白质聚集。这类分子伴侣的共同特征之一是能够利用结构可塑性来实现其在特定应激条件下的激活、对错误折叠底物蛋白的识别以及后续释放。
本文中，我们聚焦于一种内在无序分子伴侣——细菌氧化还原调控型Hsp33的功能与结构分析，该分子伴侣可在氧化应激期间保护蛋白质免于聚集。本文提供了一套多样化的技术工具，用于研究氧化还原调控型分子伴侣的活性，并绘制其活性所依赖的构象变化图谱。具体而言，我们描述了一个工作流程，包括制备完全还原态和完全氧化态的蛋白质，随后分析分子伴侣的抗聚集活性。 体外 利用光散射技术，重点关注抗聚集活性的程度及其动力学特征。为克服在聚集实验中频繁出现的异常值累积问题，我们描述了以下方法的使用： Kfits一种新型的图形化工具，可轻松处理动力学测量数据。该工具可便捷地应用于其他类型的动力学测量，用于剔除异常值并拟合动力学参数。为了将功能与蛋白质结构相关联，我们介绍了结构质谱技术——氢氘交换质谱（hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry）的实验设置与工作流程，该技术可用于绘制Hsp33在不同活性阶段下分子伴侣及其底物的构象变化图谱。相同的方法也可应用于其他蛋白质-蛋白质及蛋白质-配体相互作用的研究。
引言
细胞经常遇到呼吸作用1,2、蛋白质和脂质氧化3,4以及其他过程5,6,7所产生的活性氧（ROS）的积累。尽管ROS在细胞信号传导8,9和免疫反应10等多种生物学过程中具有有益作用，但ROS的产生与其解毒之间的失衡仍可能发生，从而导致氧化应激7。ROS的生物学靶标包括蛋白质、脂质和核酸，它们的氧化会影响自身的结构与功能。因此，细胞内氧化剂的积累与多种病理状态密切相关，包括癌症9,11、炎症12,13和衰老14,
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
1. 完全还原和完全氧化蛋白质的制备
- 完全还原蛋白质的制备
注意：此处我们描述一种含锌蛋白质的还原过程，并使用 ZnCl₂2 溶液以恢复掺入锌的还原态蛋白。ZnCl2 溶液可更换或弃去。需要注意的是，还原过程的时间和温度取决于蛋白质的稳定性和功能，因此针对不同蛋白质具有特异性。- 将蛋白样品在冰上解冻，并离心去除聚集体。将样品孵育至少1.5小时 h，37 °C，5 mM DTT，20 µM ZnCl₂2 （蛋白质浓度最高可达70%）。
注意：此步骤的温度取决于蛋白质种类，应根据蛋白质的稳定性进行调整。 - 使用脱盐柱去除DTT。
注意：市面上有多种不同的脱盐柱可供选择。以下方案描述的是使用特定脱盐柱的操作步骤（参见 材料表在使用其他脱盐柱之前，我们建议检测其去除DTT的效率以及目标蛋白的回收率，因为某些脱盐柱可能会部分吸附目标蛋白。- 用磷酸钾（KPi）缓冲液（40 mM，pH 7.5）平衡层析柱：将缓冲液完全充满层析柱，使其自然滴出。重复此过程2次。
- 用镊子轻轻向下推动并移除柱中的白色圆盘滤膜；在柱内充满KPi缓冲液时移除最为容易。用KPi缓冲液重新填充柱子，并在1,000 × g下离心3分钟。
- 将层析柱转....
- 将蛋白样品在冰上解冻，并离心去除聚集体。将样品孵育至少1.5小时 h，37 °C，5 mM DTT，20 µM ZnCl₂2 （蛋白质浓度最高可达70%）。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
本文介绍的两种方法可用于追踪分子伴侣与其底物之间蛋白质相互作用的动力学活性和动态过程。此外，氧化还原实验方案可制备完全还原态和完全氧化态的分子伴侣，有助于更深入地理解依赖氧化还原的无序分子伴侣的激活机制。
首先，我们利用光散射来检测伴侣蛋白的氧化还原依赖性活性。在氧化态（有活性）或还原态（无活性）伴侣蛋白存在下，对化学变性和热变性的CS蛋白进行光散射实验（图1）。化学变性是在不利的缓冲条件下，由完全变性的蛋白复性所引发的CS蛋白快速聚集。而热诱导聚集则是由于天然折叠底物发生相对缓慢的去折叠所致。因此，这两种不同的聚集过程在动力学参数上存在差异。此外，不同的伴侣蛋白在抑制同一底物以不同模式发生聚集方面的能力也可能有所不同。
在这两种变性形式中，以1:4（CS:Hsp33）的摩.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
本文提供了分析氧化还原依赖性分子伴侣活性以及表征客户蛋白结合后结构变化的实验方案。这些方法相互补充，可用于确定潜在的分子伴侣-底物复合物并分析其可能的相互作用位点。
在此，我们应用这些方案对氧化还原调控的分子伴侣Hsp33与一种被广泛研究的伴侣底物CS之间的复合物进行了表征。我们展示了两种不同类型的蛋白质聚集分析方法，它们在动力学和初始状态上有所不同：在化学变性过程中，底物从变性状态开始其去折叠过程；而在热诱导聚集过程中，去折叠则从底物的天然状态开始。
光散射测量是监测蛋白质聚集相对量的有效工具。虽然我们使用该方法来确定分子伴侣的活性状态，但它还可用于研究一般的聚集条件、比较不同蛋白质的稳定性，或研究底物和分子伴侣中导致不稳定性的突变。
尽管光散射方法较为简单，但可能产生带有多个异常值的噪声数据。为解决这一问题，我们开发了上述Kfits软件。 Kfits软件能够快速、简便地去除大量噪声数据，并可.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢Meytal Radzinski对本文的有益讨论和审阅，感谢Patrick Griffin及其实验室成员在建立HDX分析平台过程中提供的全力协助。作者感谢德国-以色列基金会（I-2332-1149.9/2012）、美国-以色列两国科学基金会（2015056）、玛丽·居里整合资助（618806）、以色列科学基金会（1765/13 和 2629/16）以及人类前沿科学计划（CDA00064/2014）提供的经费支持。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| <强>化学品，试剂 | |||
| 乙腈 HPLC 级 | Sigma Aldrich | 34998-2.5L | 溶剂 |
| Optima LC/MS 级甲酸 | Fisher Chemicals | A117-50 | 溶剂补充剂 |
| 异丙醇，HPLC 级 | Fisher Chemicals | P750717 | 溶剂 |
| 甲醇 | Fisher Chemicals | A456-212 | 溶剂 |
| 三(羟甲基)氨基甲烷 | Sigma Aldrich | 252859 | 缓冲液 |
| 三氟乙酸 | Sigma Aldrich | 76-05-1 | 溶剂 |
| 高效液相色谱用水 | Sigma Aldrich | 270733-2.5L-M | 溶剂 |
| ZnCl2，氯化锌 | 默克 | B0755416 308 | 试剂 |
| DTT | goldbio | 27565-41-9 | 还原剂 |
| PD mini trap G-25 色谱柱，GE healthcare | GE 医疗集团 | 29-9180-07 | 脱盐柱 |
| 磷酸钾 | 美国生物化学公司 | 20274 | 缓冲液 |
| 过氧化氢 30% | 默克 | K46809910526 | 氧化剂 |
| 柠檬酸合酶 | sigma aldrich | C3260 | 底物 |
| HEPES 无酸形式 | sigma aldrich | 7365-45-9 | 缓冲液 |
| Gndcl | sigma aldrich | G3272-500G | 变性剂 |
| 氯化氘溶液 | Sigma-Aldrich | 543047-10G | 缓冲液 |
| 氘代水 99% | sigma aldrich | 151882-100G | 溶剂 |
| TCEP | bioworld | 42000058-2 | 还原剂 |
| 带芯轴内衬的150微升微型插件 &和聚合物脚垫，29*5毫米 | La-Pha-Pack -Thermo Fischer Scientific | ||
| 1.5 mL 透明短螺纹瓶，9 mm 螺口，11.6*32 mm | La-Pha-Pack - Thermo Fischer Scientific | ||
| 石英比色皿 | Hellma 101-QS | ||
| <强>仪器 | |||
| Jasco FP-8500 荧光分光光度计 | Jasco | ||
| Thermomixer Comfort | Eppendorf | 13058/0 | |
| Heraeus Megafuge 16R 台式离心机 | 赛默飞世尔科技 | ||
| pH计，PB-11 Sartorius | 赛多利斯 | 13119/0 | |
| AffiPro 固定化胃蛋白酶柱（20 mm 长，2.0 mm 直径）。 | AffiPro | ||
| Waters 预柱（ACQUITY UPLC BEH C18 VanGuard 130） Å，1.7 µm，2.1 mm × 5 mm | 沃特斯 | ||
| C18 分析柱（ACQUITY UPLC Peptide BEH C18 柱，130 Å，1.7微米，2.1毫米×50毫米） | |||
| 带气闸门的乙烯厌氧箱 | COY | ||
| Q-exactive-Orbitrap 质谱仪 | 赛默飞世尔科技 | ||
| PAL系统LHX——用于处理HDX样品的机器人系统 | PAL系统 | https://www.palsystem.com/index.php?id=840 | |
| Dionex Ultimate 3000，XRS 泵 | 赛默飞世尔科技 | ||
| Dionex AXP-MS 辅助泵 | 赛默飞世尔科技 | ||
| <强>软件，软件工具，数据库搜索 | |||
| Kfits：拟合聚集数据 | http://kfits.reichmannlab.com/fitter/ | ||
| 赛默飞世尔科技 Xcalibur 软件 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/OPTON-30487 | ||
| Q Exactive MS 系列调谐界面（Tune） | https://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/WS-MS-Q-Exactive-Calibration-Maintenance-iQuan2016-EN.pdf | ||
| Chronos 软件（Axel Semrau） | http://www.axel-semrau.de/en/Software/Software+Solutions/Chronos-p-966.html | ||
| Proteome Discoverer V1.4 软件 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/OPTON-30795 | ||
| HDX Workbench 软件 | http://hdx.florida.scripps.edu/hdx_workbench/Home.html |
参考文献
- Wong, H. S., Dighe, P. A., Mezera, V., Monternier, P. A., Brand, M. D. Production of superoxide and hydrogen peroxide from specific mitochondrial sites under different bioenergetic conditions. Journal of Biological Chemistry. 292 (41), 16804-16809 (2017).
- Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. <....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
