方法文章

利用氢氘交换质谱法定义Hsp33的氧化还原调控型分子伴侣活性并绘制其构象变化

DOI：

10.3791/57806

⸱

2018年6月7日

 ,  ,  , 
1Department of Biological Chemistry, The Alexander Silberman Institute of Life Sciences, Safra Campus Givat Ram, The Hebrew University of Jerusalem

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

生物体在其生命周期中面临的最具挑战性的应激条件之一是氧化剂的积累。在氧化应激过程中，细胞高度依赖分子伴侣。本文介绍了用于研究氧化还原调控的抗聚集活性的方法，以及利用氢氘交换质谱（HDX-MS）监测调控伴侣功能的结构变化的方法。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

生物体在其生命周期中经常需要应对不断变化的环境，包括温度、pH值的变化以及活性氧物质的积累等。这些波动可能导致蛋白质广泛去折叠、聚集，甚至引发细胞死亡。因此，细胞在进化过程中形成了一套动态且应激特异性的分子伴侣网络，以在应激条件下维持“健康”的蛋白质组。非ATP依赖型分子伴侣是分子伴侣的一大类别，作为一线防御分子，在应激依赖的方式下防止蛋白质聚集。这类分子伴侣的共同特征之一是能够利用结构可塑性来实现其在特定应激条件下的激活、对错误折叠底物蛋白的识别以及后续释放。

本文中，我们聚焦于一种内在无序分子伴侣——细菌氧化还原调控型Hsp33的功能与结构分析，该分子伴侣可在氧化应激期间保护蛋白质免于聚集。本文提供了一套多样化的技术工具，用于研究氧化还原调控型分子伴侣的活性，并绘制其活性所依赖的构象变化图谱。具体而言，我们描述了一个工作流程，包括制备完全还原态和完全氧化态的蛋白质，随后分析分子伴侣的抗聚集活性。 体外 利用光散射技术，重点关注抗聚集活性的程度及其动力学特征。为克服在聚集实验中频繁出现的异常值累积问题，我们描述了以下方法的使用： Kfits一种新型的图形化工具，可轻松处理动力学测量数据。该工具可便捷地应用于其他类型的动力学测量，用于剔除异常值并拟合动力学参数。为了将功能与蛋白质结构相关联，我们介绍了结构质谱技术——氢氘交换质谱（hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry）的实验设置与工作流程，该技术可用于绘制Hsp33在不同活性阶段下分子伴侣及其底物的构象变化图谱。相同的方法也可应用于其他蛋白质-蛋白质及蛋白质-配体相互作用的研究。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

细胞经常遇到呼吸作用1,2、蛋白质和脂质氧化3,4以及其他过程5,6,7所产生的活性氧（ROS）的积累。尽管ROS在细胞信号传导8,9和免疫反应10等多种生物学过程中具有有益作用，但ROS的产生与其解毒之间的失衡仍可能发生，从而导致氧化应激7。ROS的生物学靶标包括蛋白质、脂质和核酸，它们的氧化会影响自身的结构与功能。因此，细胞内氧化剂的积累与多种病理状态密切相关，包括癌症9,11、炎症12,13和衰老14,15，并已被发现参与阿尔茨海默病、帕金森病和肌萎缩侧索硬化症（ALS）等神经退行性疾病的起始与进展16,17,18。

新合成的和成熟的蛋白质均对氧化高度敏感，因其侧链可能发生有害修饰，而这些修饰会影响蛋白质的结构与功能19,20因此，氧化应激通常会导致广泛的蛋白质失活、错误折叠和聚集，最终引发细胞死亡。细胞应对蛋白质氧化潜在损伤的一种精巧策略是利用氧化还原依赖性分子伴侣，这类分子伴侣可抑制广泛的蛋白质聚集，而非与错误折叠的客户蛋白形成稳定的复合物。21,22,23这些一线防御型分子伴侣可通过位点特异性氧化（通常发生在半胱氨酸残基上）被迅速激活，从而转化为强效的抗聚集分子24由于氧化应激会导致呼吸作用受抑制以及细胞内ATP水平下降25在氧化应激条件下，经典的ATP依赖性分子伴侣效果较差25,26,27因此，氧化还原激活的非ATP依赖性分子伴侣在细菌和真核生物中氧化剂积累时维持蛋白质稳态方面发挥着至关重要的作用（例如Hsp3328 和 RidA29 在细菌中，Get330 在酵母中，过氧化还原蛋白31 在真核生物中，这些分子伴侣的活性高度依赖于位点特异性氧化所诱导的可逆性结构构象变化，该变化会暴露参与识别错误折叠客户蛋白的疏水区域。

由于分子伴侣与底物之间相互作用具有动态性和异质性，研究分子伴侣抑制聚集的机制及其识别客户蛋白的规律较为困难32,33,34,35,36,37然而，由于应激调控的分子伴侣具有以下能力，它们有望增进我们对其抗聚集功能的理解：1）获得分子伴侣的两种不同形式，即活性形式（例如，氧化的）和非活性的（例如，还原态），通过引入或移除胁迫条件可轻松在两者之间切换（例如，氧化剂和还原剂），2）具有广泛的底物范围，3）能与客户蛋白形成高度稳定的复合物，可通过多种结构研究方法进行分析，以及4）仅专注于由氧化还原依赖性构象变化介导的底物识别与释放，因为这些分子伴侣中的大多数缺乏促进蛋白质折叠的能力。

本文中，我们分析了细菌氧化还原调控型分子伴侣Hsp33的抗聚集活性，该蛋白是细菌抵御氧化诱导蛋白质聚集防御系统中的关键组分28。在还原状态下，Hsp33是一种紧密折叠的锌结合蛋白，不具有分子伴侣活性；然而，当暴露于氧化应激时，Hsp33会发生广泛的构象变化，暴露出其底物结合区域38,39。氧化过程中，C端结构域中四个高度保守的半胱氨酸残基紧密结合的锌离子被释放40。这导致形成两个二硫键，C端结构域展开，并使相邻的连接区发生去稳定化41。C端结构域和连接区具有高度柔性，被定义为内在无序或部分无序区域。当恢复至非应激条件时，半胱氨酸被还原，分子伴侣重新回到其天然折叠状态，失去抗聚集活性。分子伴侣的重折叠会导致已结合的底物蛋白进一步展开和去稳定化，从而促使其转移至经典的分子伴侣系统DnaK/J进行重折叠38。对Hsp33相互作用位点的分析表明，Hsp33利用其带电荷的无序区域以及连接区和N端结构域上的疏水区域来捕获错误折叠的底物蛋白，防止其发生聚集38,42。在折叠状态下，这些区域被折叠的连接区和C端结构域所遮蔽。有趣的是，连接区在Hsp33的折叠且非活性状态中起到“门控”作用"感知"其相邻C端结构域的折叠状态34。一旦通过诱变（无论是点突变还是完整序列扰动）使其发生去稳定化，Hsp33便会转变为持续活化的分子伴侣，而不再依赖其氧化还原敏感型半胱氨酸的氧化还原状态43。

本文所述方案可用于监测 Hsp33 的氧化还原依赖性分子伴侣活性，并绘制其在激活及结合底物蛋白时发生的构象变化。该方法可适用于其他分子伴侣-底物识别模型以及非分子伴侣类蛋白质相互作用的研究。此外，我们还提供了制备完全还原态和氧化态分子伴侣的实验方案，可用于其他氧化还原开关蛋白的研究，揭示蛋白质氧化对其活性的潜在作用。

具体而言，我们描述了一种用于监测分子伴侣活性的实验方法 体外 并利用荧光分光光度计测定的光散射（LS）技术，定义其在不同类型蛋白质聚集（化学或热诱导）条件下的底物特异性44在聚集过程中，由于浊度增加，360 nm 处的光散射迅速增强，因此可在该波长下以时间依赖的方式监测聚集过程。光散射法（LS）是一种快速且灵敏的检测蛋白质聚集及目标蛋白抗聚集活性的方法，仅需纳摩尔浓度即可实现，能够在不同条件下表征与蛋白质聚集相关的动力学参数。此外，本文所述的光散射实验方案无需昂贵仪器，可在任何实验室中轻松建立。

然而，获得 "清洁" 动力学曲线，并从这类光散射实验中推导蛋白质的动力学参数，但由于噪声以及气泡和大聚集体产生的大量离群值，这一过程存在困难。为克服这一障碍，我们提出一种新型的图形化工具， Kfits45，用于降低不同动力学测量中的噪声水平，特别适用于蛋白质聚集动力学数据的拟合。该软件可提供初步的动力学参数，以便对结果进行早期评估，并允许用户 "清洁" 大量数据可快速获取，且不影响其动力学特性。 Kfits 使用 Python 实现，开源代码可在 45.

该领域中一个具有挑战性的问题是绘制分子伴侣与其客户蛋白之间的相互作用位点，并阐明分子伴侣如何识别多种错误折叠的底物。当研究涉及内在无序的分子伴侣和易于聚集的底物所组成的高度动态蛋白复合物时，这一问题变得更加复杂。幸运的是，结构质谱技术在过去十年中取得了显著进展，已成功提供了一系列有效的方法和工具，用于分析结构可塑性并绘制参与蛋白质识别的关键残基46,47,48,49。本文介绍其中一种技术——氢氘交换质谱法（HDX-MS），该方法可用于在蛋白质修饰或蛋白质/配体结合过程中，绘制残基水平上的构象变化35,50,51,52,53,54,55。HDX-MS利用肽骨架氢原子与氘原子之间的持续交换，其交换速率受化学环境、溶剂可及性以及共价键和非共价键的影响56。该方法通过使用氘代溶剂（通常为重水，D2O）追踪这些交换过程，并依据氢氘交换后分子量的变化进行测量。氢氘交换速率减慢可能是由于氢原子参与了氢键形成，或仅仅是由于空间位阻，这反映了局部结构的变化57。配体结合或翻译后修饰所引起的变化也可能导致氢环境的改变，从而在结合发生时表现为氢氘交换（HDX）速率的差异46,53。

我们将该技术应用于：1）绘制Hsp33在氧化后迅速解折叠的区域，从而揭示Hsp33的激活机制；2）确定Hsp33与其全长错误折叠底物柠檬酸合酶（citrate synthase, CS）之间可能的结合界面38。

本文所述方法可用于研究蛋白质的氧化还原依赖性功能 体外，定义抗聚集活性以及结构变化（如果存在）在蛋白质功能中的作用。这些方法可轻松适用于多种生物系统，并可在实验室中应用。

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方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 完全还原和完全氧化蛋白质的制备

  1. 完全还原蛋白质的制备
    注意：此处我们描述一种含锌蛋白质的还原过程，并使用 ZnCl₂2 溶液以恢复掺入锌的还原态蛋白。ZnCl2 溶液可更换或弃去。需要注意的是，还原过程的时间和温度取决于蛋白质的稳定性和功能，因此针对不同蛋白质具有特异性。
    1. 将蛋白样品在冰上解冻，并离心去除聚集体。将样品孵育至少1.5小时 h，37 °C，5 mM DTT，20 µM ZnCl₂2 （蛋白质浓度最高可达70%）。
      注意：此步骤的温度取决于蛋白质种类，应根据蛋白质的稳定性进行调整。
    2. 使用脱盐柱去除DTT。
      注意：市面上有多种不同的脱盐柱可供选择。以下方案描述的是使用特定脱盐柱的操作步骤（参见 材料表在使用其他脱盐柱之前，我们建议检测其去除DTT的效率以及目标蛋白的回收率，因为某些脱盐柱可能会部分吸附目标蛋白。
      1. 用磷酸钾（KPi）缓冲液（40 mM，pH 7.5）平衡层析柱：将缓冲液完全充满层析柱，使其自然滴出。重复此过程2次。
      2. 用镊子轻轻向下推动并移除柱中的白色圆盘滤膜；在柱内充满KPi缓冲液时移除最为容易。用KPi缓冲液重新填充柱子，并在1,000 × g下离心3分钟。
      3. 将层析柱转移至干净的离心管中，缓慢将蛋白样品加入柱子中央，于1,000 × g离心2分钟。不含DTT的蛋白现位于穿流液中。
    3. 检测其浓度（例如，使用紫外/可见光分光光度计在280 nm处测定其吸光度。利用比尔定律计算蛋白质浓度。
    4. 将一半的蛋白质样品分装成等份。在厌氧条件下孵育这些分装样品（例如在厌氧室中孵育20分钟，以彻底去除氧气。用塑料封口膜密封试管，并根据蛋白质种类将样品储存于-20 °C或-80 °C。
      注意：除了使用厌氧室，也可用氩气对试管进行吹扫以去除氧气。
  2. 完全氧化蛋白质的制备
    注意：建议从完全还原的蛋白质（如前所述）制备氧化蛋白质样品，以减少半胱氨酸氧化状态的异质性。可使用不同的氧化试剂；本文重点介绍过氧化氢（H₂O₂）。2O2).
    注意：避免过度氧化，因为这可能导致不需要的分子内二硫键形成，以及包括半胱氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸等在内的多种氨基酸发生不可逆氧化。
    1. 向剩余的蛋白质样品中加入 5 mM H2O2 （新鲜稀释后）在40 °C下振荡孵育3小时。
      注意：此步骤的温度取决于蛋白质种类，应根据蛋白质的稳定性进行调整。
    2. 用KPi缓冲液（40 mM，pH 7.5）平衡层析柱：将缓冲液完全充满层析柱，使其自然滴出。重复此过程2次。
    3. 用镊子轻轻向下推动柱中的白色圆盘滤膜并将其取出；在柱中充满KPi缓冲液时进行此操作最为容易。
    4. 用 KPi 缓冲液重新填充柱子，并在 1,000 x g 条件下离心 3 分钟。
    5. 将层析柱转移至干净的离心管中，缓慢将氧化后的蛋白质样品加至柱子中央，于1,000 × g离心2 min；此时氧化后的蛋白质位于穿流液中。
    6. 按照步骤1.2.5检测蛋白浓度，将氧化后的蛋白分装成等份，根据蛋白性质在-20 °C或-80 °C保存。

2. 光散射聚集分析

注意：本实验中所有浓度均依赖于分子伴侣和底物的特异性，需进行校准。所有缓冲液均应使用0.22 µm滤膜过滤，确保缓冲液中无任何颗粒或气泡，且比色皿洁净无尘，这一点极为重要。必须使用置于石英比色皿中的搅拌子进行搅拌。应测试不同尺寸和形状的搅拌子，以确保溶液充分混合且不产生不必要的气泡。此外，实验室和科研机构中配备的荧光分光光度计型号各异。此处使用的是特定型号的荧光分光光度计（见 材料表) 被使用。不同仪器具有不同的灵敏度、测量速度和采样参数。因此，具体的测量参数（例如，发射和激发带宽、灵敏度等参数应使用已知易聚集的蛋白质及其相应条件进行优化。建议使用柠檬酸合酶（CS）和/或荧光素酶作为初始底物，浓度为纳摩尔级别。

  1. 化学聚集实验
    1. 通过将12 µM CS在40 mM HEPES（pH 7.5）和4.5 M GdnCl中过夜孵育，制备变性底物。为保持pH值，需将GdnCl溶解于40 mM HEPES（pH 7.5）中。
    2. 打开荧光分光光度计软件，进入时间进程测量界面。设置参数如下：温度：25 °C；λem: 360；发射带宽：5 nm；λex: 360；激发带宽：2.5 nm；数据采集间隔：0.5 s。
    3. 向石英比色皿中加入1,600 µL的40 mM HEPES，制备样品。将比色皿插入样品槽中，并使样品达到设定温度。
    4. 将搅拌速度设为600 rpm，开始测量直至基线稳定。整个测量过程中保持持续搅拌。
    5. 在无分子伴侣存在下测量CS聚集时，于测量开始后120 s，加入（轻柔但迅速）10 µL变性CS（终浓度为75 nM）。继续测量1,200 s。
    6. 在有Hsp33存在下测量CS聚集时，于测量开始后60 s加入Hsp33（终浓度为300 nM）。再经过60 s后，加入10 µL变性CS（终浓度为75 nM）。继续测量1,200 s。
      注意：添加底物或分子伴侣时，为避免引入气泡，请使用10-µL移液器。
  2. 热诱导聚集实验
    注意：热诱导聚集实验的温度取决于目标蛋白的稳定性，应根据每种蛋白的特性单独调整。
    1. 打开荧光分光光度计软件，进入时间进程测量界面。设置参数如下：温度：43 °C；λem: 360；发射带宽：5 nm；λex: 360；激发带宽：2.5 nm；数据采集间隔：0.5 s。
    2. 向石英比色皿中加入1,600 µL预热的40 mM HEPES，制备样品。将比色皿插入样品槽中，并使样品温度升至43 °C。
    3. 将搅拌速度设为600 rpm，开始测量直至基线稳定。整个测量过程中保持持续搅拌。
    4. 在无分子伴侣存在下测量CS聚集时，于测量开始后120 s，轻柔加入CS（终浓度为125 nM），并继续测量1,200 s。
    5. 在有Hsp33存在下测量CS聚集时，于测量开始后60 s加入Hsp33（终浓度为600 nM）。再经过60 s后，加入CS（终浓度为125 nM）。继续测量1,200 s。
      注意：添加底物或分子伴侣时，应避免引入气泡。
  3. 使用Kfits进行数据分析与去噪
    注意：Kfits 可从获取，Kfits的使用方法此前已在Rimon et al.45中描述。
    1. 上传数据文件。
      注意：输入文件应为光散射测量的原始数据，格式为文本型的逗号分隔或制表符分隔文件。
    2. 为去除噪声，选择分析参数。建议使用自动最优模型，并勾选噪声始终高于信号选项。
    3. 使用绿色和红色可调节线条手动去除明显异常值；此步骤将滤除绿色线上方和红色线下方的噪声。
    4. 设定基线与拟合曲线。应用噪声阈值后，下载处理后的数据。

3. 氢氘交换质谱法

  1. 缓冲液和蛋白质样品（Hsp33 和 Hsp33-CS 复合物）的制备
    1. 将蛋白质样品用 pH 7.5 的 25 mM Tris-HCl 缓冲液稀释至终浓度为 1 mg/mL，并转移至 1.5 mL 离心管中。
    2. 通过在 43 °C 下以 1:1.5 的比例孵育 Hsp33 与 CS 来制备蛋白质-底物复合物样品。
      1. 分步加入 CS，以避免快速聚集，并确保 Hsp33 与热变性的 CS 之间有效结合。
      2. 至少分四步进行（即每次加入最终体积的四分之一），每次添加后孵育 15 分钟，以允许 Hsp33 对 CS 进行保护。
    3. 在 4 °C 下以 16,000 × g 离心 30 分钟，去除任何聚集物。
      注意：新的蛋白质-底物复合物必须新鲜制备。底物应逐步添加；否则会发生聚集。温度、底物种类及底物浓度均具有蛋白质特异性。
    4. 配制缓冲液 H（25 mM Tris-HCl，pH 7.5），作为氘代对照；以及缓冲液 D（25 mM Tris-DCl，pH 7.09），作为氘代缓冲液。同时配制新鲜的淬灭缓冲液（150 mM TCEP，3 M GdnCl，0.1% 甲酸）。
      注意：应针对目标蛋白质优化淬灭缓冲液，以在胃蛋白酶消化后获得最大的序列覆盖率。
    5. 将所有缓冲液和样品转移至离心管中，并放入相应的样品盘中。将缓冲液 H 和 D 置于 25 °C 的样品盘（25 °C 托盘）；而将样品和淬灭缓冲液置于 0 - 2 °C 的样品盘（0 °C 托盘）。先将样品放入 150 µL 玻璃插件中（见材料表），再转移至离心管中。
  2. 仪器准备
    注意：质谱仪配备两个配套软件程序：一个控制泵，另一个控制质谱仪本身（参见材料表）。以下步骤将使用这两个软件程序进行描述。
    1. 手动开启所有冷却装置。待所有冷却系统达到设定温度后，手动启动高效液相色谱（HPLC）泵和上样泵。
      注意：在本实验中，包括两个冷却浴和一个冷却箱（内含捕集柱和分析柱）。一个冷却装置维持 0 °C 托盘的温度，另一个维持 25 °C 托盘的温度；冷却箱的温度为 1 - 2 °C。
    2. 打开控制两个泵的软件以及控制质谱仪的软件；确保质谱仪处于待机状态。
    3. 断开 HPLC 出口阀与质谱源的连接，首先用"三重清洗液"（1% 甲酸，33% 乙腈，33% 异丙醇，33% 甲醇）清洗系统，然后用缓冲液 B（80% 乙腈，0.1% 甲酸）冲洗，最后用缓冲液 A（0.1% 甲酸，pH 2.25）冲洗，随后将胃蛋白酶柱接入系统。若更换缓冲液，务必在继续操作前对两个泵进行排空。
    4. 确保两个泵的流速均为 0.1 mL/min，且压力稳定。
    5. 在系统以稳定流速和压力完成清洗后，将 HPLC 出口重新连接至质谱源，并启动质谱仪。
  3. 质谱仪参数设置
    1. 将肽段电离方式设为电喷雾电离（ESI），温度为 175 °C，鞘气流速为 17，辅助气流为 2，喷雾电压为 4.5 kV（补充图 1）。
    2. 为非氘代样品设置如下参数。
      1. 设置参数：扫描范围 m/z 为 300 - 1500；分辨率设为 70,000；自动增益控制目标（AGC）设为 106；最大注入时间（IT）为 100 ms。
        注意：将选择强度高于 1.3 × 104、电荷态介于 +2 至 +6 之间的前 5 个最强烈离子，并采用 30 的动态窗口进行隔离。
      2. 通过多级碰撞池中的高能碰撞解离（HCD）进行离子碎裂，归一化碰撞能量（NCE）设为 28。以 35,000 分辨率、AGC 目标值 105、最大 IT 60 ms 和 2.0 m/z 隔离窗口，通过串联质谱检测碎片离子。
    3. 对于氘代样品，仅使用 MS1 模式，分辨率为 140,000，其余参数保持一致。
  4. 运行实验
    1. 按以下方式设置样品托盘。
      1. 将缓冲液 H 和 D 放入 25 °C 托盘，将样品和淬灭缓冲液放入 0 °C 托盘。
      2. 在两个托盘中各放置 X 个空离心管，其中 X = 样品数 × 时间点数。
        注意：在 25 °C 托盘中，空离心管用作反应管；在 0 °C 托盘中，它们用作淬灭管。
      3. 每个空离心管中均含有一个空玻璃插件；每次实验后应丢弃并更换该插件。
        注意：为以最高效且最省时的方式运行氢氘交换（HDX）实验，使用了一款可同时运行多个样品的软件（补充图 2）。以下步骤将基于该软件进行描述。
    2. 打开软件，设置程序参数以执行以下操作。
      1. 将每个样品（5 µL）与 45 µL 缓冲液 D 在 25 °C 下孵育数分钟，孵育时间根据所选时间点而定（例如，1、3、18、40 和 100 分钟）。非氘代样品则使用 45 µL 缓冲液 H 进行孵育。
      2. 孵育结束后立即混合 50 µL 氘代蛋白质与 50 µL 冰冷的淬灭缓冲液，并将其注入固定化胃蛋白酶柱（长度 20 mm，直径 2.0 mm）。
      3. 用缓冲液 A 以 50 µL/min 流速冲洗 6 分钟，将肽段从胃蛋白酶柱洗脱至前柱。缓冲液 A 应保存在 0 °C 的冷却箱中。
      4. 将肽段从前柱洗脱至 C18 分析柱（C18 柱，130 Å，1.7 µm，2.1 mm × 50 mm，保持在 0 °C），并通过以 100 µL/min 流速施加乙腈线性梯度进行分离。使用 100% 乙腈作为缓冲液 B 运行梯度程序：2% 保持 7 分钟，10 - 30% 保持 7 分钟，30 - 90% 保持 2.5 分钟，90% 保持 1.5 分钟，90 - 8% 快速梯度 1 分钟，最后在 2% 条件下平衡 4 分钟。
    3. 建立运行序列（见补充图 2）：输入所有时间点、样品名称及在托盘中的位置，以及缓冲液名称和位置。
      注意：该软件可将不同运行时间对齐，整合为可同时运行多个样品的程序，从而有效缩短总运行时间。
  5. 数据分析
    注意：在数据分析过程中我们使用多种软件程序，包括用于肽段鉴定和序列覆盖率分析的 Proteome Discoverer 和 MaxQuant（免费软件），以及用于分析蛋白质中氘掺入程度并比较不同实验组间 HDX 速率的免费软件 HDX Workbench。以下步骤将基于这些软件进行描述。
    1. 通过运行非氘代对照样品分析样品的肽段覆盖率（补充图 3）。使用以下参数设置软件。
      1. 采用 Sequest HT 方法，设置为无酶（非特异性）裂解。搜索 4 - 144 个氨基酸长度的肽段，前体离子和碎片离子的质量容差分别为 7 ppm 和 0.5 Da。允许甲硫氨酸氧化作为动态修饰。
      2. 创建目标蛋白质的数据库，以便软件确定肽段覆盖率。将鉴定出的肽段以文本格式导出。
    2. 使用免费软件 HDX Workbench58 分析氘代结果。
      1. 打开蛋白质编辑器，输入蛋白质序列和肽段覆盖率文件以定义蛋白质。
      2. 接着打开实验设置向导编辑器，输入程序要求的所有信息。
        注意：程序需要输入样品数量、时间点数量、重复次数、缓冲液 pH 值和温度。
      3. 最后输入所用质谱仪的相关参数，程序将生成检测到的肽段列表。
        注意：该软件可识别"HDX" 肽段，检查同位素簇，并清晰可视化样品中的氘代情况。
  6. 数据呈现
    1. 使用 PyMol 软件或其他可视化软件，在结构上标记具有差异性氘摄取的区域。
    2. 用氘摄取水平替代 B 因子值。
      注意：基础教程可参见 https://pymolwiki.org/index.php/Practical_Pymol_for_Beginners。

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文介绍的两种方法可用于追踪分子伴侣与其底物之间蛋白质相互作用的动力学活性和动态过程。此外，氧化还原实验方案可制备完全还原态和完全氧化态的分子伴侣，有助于更深入地理解依赖氧化还原的无序分子伴侣的激活机制。

首先，我们利用光散射方法来检测伴侣蛋白的氧化还原依赖性活性。实验在化学变性和热变性的CS蛋白存在下进行，同时加入氧化态（有活性）或还原态（无活性）的伴侣蛋白（图1）。化学变性是在不利的缓冲条件下，由完全变性的蛋白质重新折叠所引发的CS蛋白快速聚集。而热诱导聚集则是由于天然折叠底物发生相对缓慢的去折叠所致。因此，这两种不同的聚集过程在动力学参数上存在差异。此外，不同的伴侣蛋白在抑制同一底物以不同模式发生聚集方面的能力也可能有所不同。

在这两种变性形式中，以1:4（CS:Hs...

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文提供了分析氧化还原依赖性分子伴侣活性以及表征客户蛋白结合后结构变化的实验方案。这些方法相互补充，可用于确定潜在的分子伴侣-底物复合物并分析其可能的相互作用位点。

在此，我们应用这些方案对氧化还原调控的分子伴侣Hsp33与一种被广泛研究的伴侣底物CS之间的复合物进行了表征。我们展示了两种不同类型的蛋白质聚集分析方法，它们在动力学和初始状态上有所不同：在化学变性过程中，底物从变性状态开始其去折叠过程；而在热诱导聚集过程中，去折叠则从底物的天然状态开始。

光散射测量是监测蛋白质聚集相对量的有效工具。虽然我们使用该方法来确定分子伴侣的活性状态，但它还可用于研究一般的聚集条件、比较不同蛋白质的稳定性，或研究底物和分子伴侣中导致不稳定性的突变。

尽管光散射方法较为简单，但可能产生带有多个异常值的噪声数据。为解决这一问题，我们开发了上述Kfits软件。 Kfits软件能够快速、简便地去除大量噪声数据，并可...

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披露

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作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

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作者感谢Meytal Radzinski对本文的有益讨论和审阅，感谢Patrick Griffin及其实验室成员在建立HDX分析平台过程中提供的全力协助。作者感谢德国-以色列基金会（I-2332-1149.9/2012）、美国-以色列两国科学基金会（2015056）、玛丽·居里整合资助（618806）、以色列科学基金会（1765/13 和 2629/16）以及人类前沿科学计划（CDA00064/2014）提供的经费支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
<强>化学品，试剂
乙腈 HPLC 级Sigma Aldrich34998-2.5L溶剂
Optima LC/MS 级甲酸Fisher ChemicalsA117-50溶剂补充剂
异丙醇，HPLC 级Fisher ChemicalsP750717溶剂
甲醇Fisher ChemicalsA456-212溶剂
三(羟甲基)氨基甲烷Sigma Aldrich252859缓冲液
三氟乙酸Sigma Aldrich76-05-1溶剂
高效液相色谱用水Sigma Aldrich270733-2.5L-M溶剂
ZnCl2，氯化锌默克B0755416 308试剂
DTTgoldbio27565-41-9还原剂
PD mini trap G-25 色谱柱，GE healthcareGE 医疗集团29-9180-07脱盐柱
磷酸钾美国生物化学公司20274缓冲液
过氧化氢 30%默克K46809910526氧化剂
柠檬酸合酶sigma aldrichC3260底物
HEPES 无酸形式sigma aldrich7365-45-9缓冲液
Gndclsigma aldrichG3272-500G变性剂
氯化氘溶液Sigma-Aldrich543047-10G缓冲液
氘代水 99%sigma aldrich151882-100G溶剂
TCEPbioworld42000058-2还原剂
带芯轴内衬的150微升微型插件 &和聚合物脚垫，29*5毫米La-Pha-Pack -Thermo Fischer Scientific
1.5 mL 透明短螺纹瓶，9 mm 螺口，11.6*32 mmLa-Pha-Pack - Thermo Fischer Scientific
石英比色皿Hellma 101-QS
<强>仪器
Jasco FP-8500 荧光分光光度计Jasco
Thermomixer ComfortEppendorf13058/0
Heraeus Megafuge 16R 台式离心机赛默飞世尔科技
pH计，PB-11 Sartorius赛多利斯13119/0
AffiPro 固定化胃蛋白酶柱（20 mm 长，2.0 mm 直径）。AffiPro
Waters 预柱（ACQUITY UPLC BEH C18 VanGuard 130） Å，1.7 µm，2.1 mm × 5 mm沃特斯
C18 分析柱（ACQUITY UPLC Peptide BEH C18 柱，130 Å，1.7微米，2.1毫米×50毫米）
带气闸门的乙烯厌氧箱COY
Q-exactive-Orbitrap 质谱仪赛默飞世尔科技
PAL系统LHX——用于处理HDX样品的机器人系统PAL系统https://www.palsystem.com/index.php?id=840
Dionex Ultimate 3000，XRS 泵赛默飞世尔科技
Dionex AXP-MS 辅助泵赛默飞世尔科技
<强>软件，软件工具，数据库搜索
Kfits：拟合聚集数据http://kfits.reichmannlab.com/fitter/
赛默飞世尔科技 Xcalibur 软件https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/OPTON-30487
Q Exactive MS 系列调谐界面（Tune）https://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/WS-MS-Q-Exactive-Calibration-Maintenance-iQuan2016-EN.pdf
Chronos 软件（Axel Semrau）http://www.axel-semrau.de/en/Software/Software+Solutions/Chronos-p-966.html
Proteome Discoverer V1.4 软件https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/OPTON-30795
HDX Workbench 软件http://hdx.florida.scripps.edu/hdx_workbench/Home.html

参考文献

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