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方法文章

通过斜扫激光检眼镜（oSLO）与光学相干断层扫描（OCT）实现多模态容积式视网膜成像

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DOI：

10.3791/57814

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2018年8月4日

 ,  , 
1Department of Medicine, Boston University School of Medicine, 2Department of Biomedical Engineering, Boston University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一种利用新型多模态成像平台获取大视野（FOV）三维（3D）荧光与光学相干断层扫描（OCT）视网膜图像的实验方案。我们将阐述系统配置、对准方法及操作流程。 在体 将演示成像过程，并提供代表性结果。

摘要

尽管荧光成像在眼科领域广泛应用，但现有的视网膜成像技术仍难以实现大视野（FOV）三维（3D）荧光视网膜成像，因为这类成像通常需要通过z轴堆叠来构建三维数据集。较新的光学相干断层扫描（OCT）及OCT血管成像（OCTA）系统虽已克服上述限制，可提供三维解剖与血管图像，但OCT无需染料的特性使其无法显示提示血管功能障碍的渗漏现象。本实验方案介绍一种新型斜向扫描激光检眼镜（oSLO）技术，可实现三维容积荧光视网膜成像。该成像系统的装置通过燕尾滑块实现斜向扫描，并将最终成像系统以特定角度对准，以获取荧光横截面图像。该系统采用激光扫描方法，因此可便捷地整合OCT作为互补的三维结构成像模态。 体内 在大鼠视网膜上进行成像。通过静脉注射荧光素溶液，生成容积荧光素血管造影（vFA）。

引言

现代光学成像技术极大地推动了眼科学和视觉科学研究的发展，因为视网膜易于通过光线进行观察。荧光视网膜成像是诊断和管理脉络膜视网膜血管疾病（如糖尿病性视网膜病变（DR）和年龄相关性黄斑变性（AMD））的重要工具，这两种疾病均是美国致盲的主要原因。

然而，利用荧光成像技术获取大视野（FOV）、三维（3D）视网膜图像仍然具有挑战性。眼底照相不具备深度分辨能力，也无法抑制散射光，因此来自不同深度的信号混合会降低图像质量。扫描激光检眼镜（SLO）和共焦SLO（cSLO）可通过共焦门控技术减少散射光的影响1。然而，由于其焦深受限，SLO或cSLO难以获取完整的人类视网膜三维图像。自适应光学SLO（AOSLO）通过校正人眼引入的波前像差，可提供极高的分辨率和对比度。但AOSLO仍需通过z轴堆叠实现容积成像2。光学相干断层扫描（OCT）3及其血管成像技术（OCTA）系统克服了上述限制，能够提供三维（3D）解剖结构和血管图像4,5,6，但OCT无需染料的特性使其无法显示提示血管功能障碍的渗漏现象。

本方案描述了一种用于三维容积荧光视网膜成像的新型多模态平台，即斜向扫描激光检眼镜（oSLO）。在该成像系统中，通过鸽尾滑块产生斜向扫描，最终成像系统以一定角度对准，以获取荧光的横截面图像。该系统采用激光扫描方法，这些技术可方便地与光学相干断层扫描（OCT）结合，作为互补的三维结构成像模态。当前系统在大鼠视网膜中的深度分辨率为约25 µm，视场角为30°。本质上，oSLO实现了OCT的荧光版本，可在大视场范围内与OCT和OCT血管成像（OCTA）同步联合使用。

在本实验方案中，我们将描述光学扫描激光检眼镜（oSLO）的装置设置、校准与构建方法、以及相关方法 体内 大鼠视网膜成像及代表性结果

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方案

本文所述所有方法均已获得波士顿医学中心动物护理与使用委员会（ACUC）的批准。

1. 系统设置

  1. oSLO 系统
    1. 使用超连续谱激光器作为系统的激光光源。
      1. 通过二向色镜（DM1）将可见光范围（450–650 nm）与较长波长范围（650–2000 nm）分离。激光束通过偏振分束器（PBS）后，利用一对色散棱镜展宽光谱。
      2. 放置狭缝以选择激发波长范围（475–495 nm）。使用反射镜将滤波后的光束反射回棱镜对，然后将光耦合进单模光纤（SMF 1）。
      3. 使用光谱仪确认单模光纤输出端的波长选择。
    2. 将单模光纤连接至两个级联的光纤耦合器，如图2所示。第二个光纤耦合器的一个光纤输出端口将光传输至oSLO系统。
    3. 在oSLO系统中首先对激光进行准直。
      1. 通过检流计镜（GM1）偏转激光。使用1:1望远镜系统将激光继而传递至第二个检流计镜（GM2），再通过3:1望远镜系统进一步传递至眼睛瞳孔。
      2. 在3:1望远镜系统内安装二向色镜（DM2），用于反射荧光信号。
    4. 将3:1望远镜系统和二向色镜（DM2）安装在定制的燕尾滑轨上，以偏移光轴并实现如图3所示的斜向扫描照明。使用卡尺精确控制所需的偏移长度。
    5. 荧光成像光路。
      1. 由二向色镜反射荧光，并将其传递至第三个检流计镜，以消除慢轴扫描的偏转。
      2. 通过另一个1:1望远镜系统将光传递至成像物镜。将上述光学元件安装在平移台上。
        注：在第三个检流计镜（GM3）下方安装了两个额外的平移台，以提供自由度冗余，便于优化成像。
    6. 将最终的成像系统安装在一个具有三个自由度（旋转及两个平移轴）的平台上。使用面阵相机采集横截面荧光图像。
  2. 光学相干断层扫描系统
    1. 使用相同的超连续谱激光器作为系统的激光光源。
      1. 通过另一二向色镜（DM3）将近红外（NIR）范围（650–900 nm）与其余光（650–2000 nm）分离。使用长通滤光片进一步将带宽限制在800–900 nm。将光束耦合进单模光纤（SMF 2）。
    2. 将单模光纤连接至两个级联光纤耦合器的另一个输入端口，以与蓝色oSLO激发光合并。将第二个光纤耦合器的第二个输出端口的光导向OCT参考臂，该参考臂包含可变中性密度滤光片（VNDF）、色散补偿板和反射镜。
      注：从参考臂和眼睛返回的光在第二个光纤耦合器处重新组合，并被输送至OCT光谱仪以采集信号。
  3. 数据采集
    1. 使用基于LabVIEW编写并修改自OCTA7,8,9,10扫描协议的数据采集系统软件。对于每个B扫描，模拟输出板（AO1）输出占空比为80%、500步的锯齿波，用于控制x'方向快速扫描镜GM2。
    2. 在每一步触发线扫描相机，仅在镜面处于前向扫描方向时采集OCT数据。将线扫描相机的曝光时间设置为17 µs。
    3. 为获取OCTA信号，在同一B扫描位置重复测量5次。
    4. 将AO输出速率设为100 kHz，OCT A线速率为50 kHz。通过斜坡波形控制y'方向慢速扫描镜GM1。使去扫描镜GM3与GM1同步，以消除慢扫描的偏转。
    5. 通过另一模拟输出板（AO2）触发面阵相机，在每个y'位置采集一幅荧光图像。可根据需要裁剪成像尺寸或合并邻近像素，以提高速度和灵敏度。

2. 系统校准

  1. 调节oSLO光源的狭缝以选择蓝色激发波长。使用光谱仪监测光谱范围，使其保持在约475–490 nm。
  2. 调节鸽尾架滑块，使光轴偏移约5 mm。这将在大鼠瞳孔处产生约1.7 mm的偏移，从而在视网膜上形成约15°的斜入射角。
  3. 将荧光检测光路的平移台同样调节偏移5 mm。
  4. 将最终的荧光成像系统调整至约30°。
  5. 使用功率计测量光功率。确保蓝色oSLO激发光功率不超过0.2 mW，OCT激光功率不超过0.8 mW，以避免对视网膜造成损伤。
    注意：根据ANSI标准，在可见光范围内，视网膜允许的最大辐射暴露（MPE）水平约为2 mW7,8。根据Delori et al.9提出的公式，近红外光的MPE约为可见光的两倍，即约4 mW。

3. 在体 内 动物实验

  1. 将一只12周龄的雄性Long Evans大鼠转移至诱导室中。使用异氟烷蒸发器，以2 L/min的流速将4.5%异氟烷与氧气混合，对大鼠进行10分钟麻醉。
    1. 通过趾间夹捏测试确认麻醉深度，若无回缩反射则表明麻醉充分。
  2. 诱导完成后，将大鼠固定于五轴（x、y、z平移，偏航和俯仰）固定装置上。在长时间实验中，通过加热平台、循环温水毯或其他合适方式提供辅助加热。在实验其余阶段，以1.5%异氟烷、2升/分钟的流速维持麻醉。若未使用带主动排气功能的诱导室，则应将诱导室置于逆流或下吸式工作台面，或置于排风罩下方，以清除异氟烷气体。
  3. 使用1%托吡卡胺滴眼液散瞳，持续2分钟。如有需要，可在大鼠眼部滴加0.5%盐酸丁卡因滴眼液以增强局部麻醉效果。实验过程中至少每分钟使用一次市售人工泪液保持眼球湿润。
  4. 使用1 mL注射器和29G针头，将荧光素钠（10% w/w）或FITC（10% w/w）用无菌生理盐水稀释后（0.1–0.3 mL），经尾静脉注射。
  5. 开启激光光源。在对光过程中，放置中性密度滤光片以衰减蓝光激发光。将OCT光功率调节至约0.8 mW，蓝光功率<0.01 mW，以避免白内障形成。
  6. 启动检流计扫描与对光模式。调节眼球高度，使激光光斑在角膜上保持静止。调整大鼠眼球位置，使瞳孔边缘大致与激光束垂直，并将激光束偏移至眼球顶点中心约1.5 mm处。
  7. 进一步调节动物固定装置，直至OCT图像达到最佳质量。在x'快速扫描方向上，确保横截面B扫描图像呈平坦状态；切换至y'慢速扫描方向时，由于斜向扫描，横截面B扫描图像应呈现倾斜状态。
  8. 移除蓝光激发光的中性密度滤光片，并监控相机的实时图像。横截面荧光图像应显示不同深度的血管结构。
    1. 调节最终荧光成像系统的焦距以达到最佳聚焦状态。允许在横向平面对眼球位置进行微调，以获得最优的oSLO图像质量。
  9. 完成对光后，开始同步采集OCTA和容积荧光素血管造影（vFA）图像。
  10. 使用Matlab构建OCTA和oSLO的容积图像。相关算法已在先前文献中详细描述10。通过图像分割生成深度分辨的视网膜血管结构。
  11. 成像完成后，关闭激光，释放动物，在其眼部涂抹适量眼用软膏，随后将动物置于恢复箱中。
  12. 在动物恢复足够意识、能够维持胸卧位之前，不得无人看护，或依照机构规定执行监护。

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结果

图4a 显示大鼠视网膜的横断面OCT图像。图4b–4c 显示在同一时间获取的OCTA和oSLO vFA的相同视网膜横断面图像。oSLO可实现类似于OCT B扫描的横断面荧光血管造影（FA）。与OCTA相比，oSLO vFA横断面图像可清晰识别神经纤维层（NFL）和神经节细胞层（GCL）中的血管，以及外丛状层（OPL）中的毛细血管。图4d 和 4g 显示OCTA和oSLO vFA图像的浅层结构。与OCTA不同，oSLO vFA图像（图4g）通过利用荧光发射对比度避免了运动伪影（图4d 中的垂直条纹）。通过比较视网膜中层内的oSLO vFA（图4e）和OC...

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讨论

在此，我们描述了oSLO，一种 体内 视场角超过30°的容积荧光视网膜成像技术。与目前眼科临床标准成像方法光学相干断层扫描（OCT）相比，光学扫描激光检眼镜（oSLO）具备类似的三维成像能力，同时可提供OCT不敏感的荧光对比度。oSLO的优势在于仅需一次光栅扫描，因而可无缝结合OCT，实现结构成像与荧光成像两种互补的容积成像技术。

在本实验方案中，获得良好图像质量的关键在于大鼠眼睛的清晰度。如果 oSLO 图像模糊，应检查是否存在白内障的形成。多种因素，如氯胺酮/赛拉嗪麻醉、角膜干燥以及蓝光过度暴露，均可能导致白内障形成，从而显著降低图像质量。为预防白内障，应避免蓝光连续照射超过2分钟；每分钟至少使用一次人工泪液以防止角膜干燥；在每次成像间隔期间，通过阻断光线使眼睛至少休息30秒。

我们预计，光学扫描激光检眼镜（oSLO）将显著影响荧光成像的临床实践。我们已证明，其深度分辨能力可有效消除外层视网膜的信号，从而获得高达单毛细血管水平的高对比度容积荧光血管造影（FA）图像，这是传统SLO无法实现的。显著改善的图像...

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披露

Ji Yi 拥有 oSLO 的待批专利。其他作者声明不存在竞争性财务利益。

致谢

资金来自波士顿医学中心的埃文斯医学基金会，以及美国国立卫生研究院（NIH）项目5R01CA183101的子合同、波士顿大学临床与转化科学研究所（BU-CTSI）试点资助项目1UL1TR001430、波士顿大学-乔斯林试点项目，以及波士顿大学临床与 translational 科学研究所KL2TR001411项目。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
超连续谱激光光源NKT PhotonicsSuperK EXTREME EXU-OCT6
二向色镜（DM1）ThorlabsDMLP650R
二向色镜（DM2）ChromaZT514/1064rpc
二向色镜（DM3）ThorlabsDMLP900R
单模光纤（SMF 1）ThorlabsP3-460B-FC-2
单模光纤（SMF 2）ThorlabsP3-780A-FC-2
光纤耦合器ThorlabsTW850R5A2
1:1 望远镜系统ThorlabsAC254-100-A×2
3:1 望远镜系统ThorlabsAC254-150-A×2
3:1 望远镜系统ThorlabsAC254-50-A×2
扫描振镜（GM1, GM2）ThorlabsGVS201×2
去扫描振镜（GM3）ThorlabsGVS011
物镜OlympusUplanSApo 20×/0.75
最终成像系统OlympusUplanFL N 10×/0.3
最终成像系统Computar12-36mm/1:2.8
相机PCOPco.pixelfly usb
滤光片ThorlabsFEL0800
带安装座的连续可变中性密度滤光片ThorlabsNDC-50C-4M-A
线阵扫描相机ThorlabsSPL2048-140K
模拟输出板卡（AO1）National InstrumentPCI-6731
模拟输出板卡（AO2）National InstrumentPCIe-6351
长通滤光片ThorlabsFEL0800

参考文献

  1. Webb, R. H., Hughes, G. W., Delori, F. C. Confocal scanning laser ophthalmoscope. Applied Optics. 26 (8), 1492-1499 (1987).
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