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可生物打印的海藻酸盐/明胶水凝胶3D 体外 模型系统诱导细胞球体形成

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DOI：

10.3791/57826

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2018年7月2日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Mechanical Engineering, McGill University Montreal, 2Department of Bioengineering, McGill University Montreal, 3Department of Molecular Biology, Instituto Potosino de Investigación Científica y Tecnológica, A.C. (IPICyT), 4Department of Mining and Materials Engineering, McGill University Montreal, 5Department of Biomedical Engineering, McGill University Montreal

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

我们开发了一种异质性乳腺癌模型，该模型由永生化的肿瘤细胞和成纤维细胞嵌入可生物打印的海藻酸盐/明胶生物墨水中构成。该模型可重现 体内 肿瘤微环境并促进多细胞肿瘤球体的形成，有助于揭示驱动肿瘤发生的相关机制。

摘要

原代肿瘤微环境在细胞、生化和生物物理层面具有高度异质性，而传统的二维（2D）细胞培养方法使用永生化癌细胞系无法重现这一复杂特性。通过生物打印技术构建包含多种细胞类型的异质性三维（3D）肿瘤模型，可有效克服上述局限。海藻酸钠和明胶是生物打印中最常用的两种生物材料，因其具备良好的生物相容性、仿生特性及机械性能。通过结合这两种聚合物，我们成功制备出一种可生物打印的复合水凝胶，其微观结构与天然肿瘤间质具有相似性。我们对这种复合水凝胶的可打印性进行了研究。 通过 流变学并获得了最佳打印窗口。将乳腺癌细胞和成纤维细胞包埋于水凝胶中，打印形成模拟的三维模型 体内 微环境。该生物打印的异质模型实现了长期细胞培养的高存活率（> 30天）并促进乳腺癌细胞自组装形成多细胞肿瘤球体（MCTS）。在该模型中，我们观察了癌相关成纤维细胞（CAFs）与MCTS之间的迁移及相互作用。通过将生物打印的细胞培养平台用作共培养系统，为研究肿瘤发生对间质成分的依赖性提供了独特的工具。该技术具有高通量、低成本和高重复性的特点，还可作为传统单层细胞培养和动物肿瘤模型的替代方案，用于癌症生物学研究。

引言

尽管二维细胞培养在癌症研究中被广泛应用，但其存在局限性，因为细胞以单层形式生长，营养物质和氧气浓度均一。这类培养体系缺乏天然肿瘤微环境（TME）中存在的关键细胞间及细胞与基质间的相互作用。因此，这些模型难以真实模拟生理条件，导致细胞行为异常，包括形态不自然、受体分布紊乱、膜极性改变以及基因表达异常等多种情况1,2,3,4另一方面，三维细胞培养技术通过在立体空间中以细胞聚集体、球状体或类器官的形式扩增细胞，提供了一种可构建更精确模型的替代方法 体外 环境以研究细胞生物学和生理学的基本问题。3D细胞培养模型还可促进细胞与细胞外基质（ECM）之间的相互作用，这种相互作用是原生肿瘤微环境（TME）的关键生理特征 体外1,4,5新兴的3D生物打印技术为构建模拟异质性肿瘤微环境的模型提供了可能。

3D生物打印技术源于快速成型技术，能够制造出可模拟某些活体组织样本复杂性的3D微结构6,7目前的生物打印方法包括喷墨打印、挤出打印和激光辅助打印8其中，挤出法可通过将不同类型的材料精确定位在初始位置不同的区域，从而在打印的基质中控制异质性。因此，该方法是制备异质结构的最佳途径 体外 涉及多种细胞或基质的模型。挤出式生物打印已成功用于构建耳廓形状的支架9血管结构10,11,12以及皮肤组织13，从而实现高打印保真度和细胞活性。该技术还具有材料选择多样、可沉积含有已知密度包埋细胞的材料以及高重复性等优势。14,15,16,17天然和合成水凝胶因其生物相容性、生物活性以及可被设计成在结构上模拟细胞外基质（ECM）的亲水性网络，常被用作3D生物打印的生物墨水7,18,19,20,21,22,23水凝胶还具有多种优势，因其可包含细胞黏附位点、结构组分、对营养物质和气体的通透性，以及适宜的机械性能，从而促进细胞生长发育。24例如，胶原蛋白水凝胶可为细胞提供整合素锚定位点，使其能够附着于基质。明胶是变性的胶原蛋白，仍保留类似的细胞黏附位点。相比之下，海藻酸盐具有生物惰性，但可通过与二价离子交联而提供机械稳定性。25,26,27,28.

在本研究中，我们开发了一种由海藻酸盐和明胶组成的复合水凝胶作为生物墨水，其微观结构类似于天然肿瘤间质。将乳腺癌细胞和成纤维细胞包埋于该水凝胶中并进行打印。 通过 基于挤出的生物打印机构建模拟的三维模型 体内 微环境。这种人工构建的三维环境可使癌细胞形成长期培养下仍具有高存活率的多细胞肿瘤球（MCTS）。> 30天）。本实验方案展示了复合水凝胶的合成方法、材料微观结构与可打印性的表征、细胞异质模型的生物打印，以及多细胞球（MCTS）形成过程的观察。这些方法同样可应用于挤出式生物打印中的其他生物墨水，以及具有不同设计的异质组织模型，有望用于药物筛选、细胞迁移实验及细胞基本生理功能的相关研究。

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方案

1. 材料、水凝胶及细胞培养材料的准备

  1. 材料与溶液的准备
    1. 清洗并干燥250 mL和100 mL玻璃烧杯、磁力搅拌子、刮刀、10 mL注射器筒、25 G圆柱形喷嘴（长度为0.5英寸，内径为250 µm）。将上述材料在121 °C、1 atm条件下高压灭菌15分钟。使用前保持材料处于无菌状态。
      注意：供应商信息请参见材料表。
    2. 称取3 g海藻酸钠（3% w/v）和7 g明胶（7% w/v）（以下简称A3G7）。
    3. 将以下物品在紫外线下灭菌至少4小时：海藻酸钠和明胶粉末、石蜡膜、5 cm2大小的铝箔片，以及1 mL和5 mL注射器。将端盖、针头盖和活塞浸入70%乙醇中至少4小时进行灭菌，并用无菌超纯水清洗2次。
      注意：供应商信息请参见材料表。
    4. 用超纯水溶解4 g琼脂糖，并通过高压灭菌进行灭菌。
      注意：琼脂糖在高压灭菌过程中完全溶解。
    5. 使用前，用无菌超纯水配制100 mM的无水氯化钙（CaCl2）溶液，并准备孔径为0.22 µm的无菌滤器。
    6. 对于琼脂糖包被的6孔板，将无菌琼脂糖在微波炉中加热至完全融化成液体；然后在生物安全柜（BSC）中，使用1 mL移液器向每孔加入2 mL，轻轻混匀，使孔底形成均匀覆盖层。静置冷却后，用石蜡膜密封各孔。使用前在室温（RT）下保存。
  2. A3G7水凝胶前体的制备
    1. 在生物安全柜（BSC）中，将3 g海藻酸钠和7 g明胶粉末加入250 mL烧杯中。放入磁力搅拌子，并加入100 mL DPBS。用无菌石蜡膜和5 cm2铝箔密封烧杯，防止污染。
    2. 在磁力加热板上以600 rpm转速、60 °C持续搅拌1小时，随后在室温下继续搅拌2小时，使粉末充分溶解。
    3. 将材料加热至37 °C，直至凝胶发生相变转为液态（对于100 mL储备凝胶溶液，约需45分钟）。将溶液转移至无菌50 mL锥形离心管中，密封后在834 × g条件下离心5分钟，以去除材料中的气泡。
    4. 将水凝胶前体吸入10 mL注射器中，用盖子和石蜡膜密封注射器。4 °C保存备用。
  3. 细胞培养
    注意：本节所有操作均需在无菌条件下进行。
    1. 按以下方法配制基础DMEM培养基（配制1 L）：在生物安全柜（BSC）中，将100 mL胎牛血清（FBS）和10 mL抗生素/抗真菌溶液（100倍稳定溶液）加入新鲜无菌容器中，再加入DMEM培养基定容至1,000 mL。密封容器后置于4 °C保存。
    2. 在预热的水浴（37 °C）中，轻柔地将一管MDA-MB-231-GFP（人乳腺癌细胞系，GFP标记，核定位）和一管IMR-90-mCherry（癌相关成纤维细胞系，mCherry标记，胞质定位）从液氮中取出并解冻。上述两种细胞系及GFP和mCherry标记质粒均为商业化产品。
    3. 向6孔板中每孔加入160 µL细胞悬液（3 × 106 个细胞/mL），并加入5 mL预热至37 °C的基础DMEM培养基。将培养板置于37 °C、5% CO2条件下培养24–48小时，直至细胞融合度达到80%。
    4. 当细胞达到融合状态后，弃去培养基，用DPBS清洗细胞两次；每孔加入500 µL胰蛋白酶-EDTA溶液（0.25%，1×，预先在37 °C预热），37 °C孵育6分钟。随后加入500 µL FBS终止胰酶反应，收集细胞悬液并转移至T-75培养瓶中。再次置于37 °C、5% CO2条件下培养，直至细胞融合度达到80%。
      注意：胰蛋白酶-EDTA溶液的用量可根据细胞培养容器的不同而调整。
    5. 重复上述步骤，使用第3–4代细胞进行实验，此阶段细胞代谢活性和稳定性更高。
    6. 使用台盼蓝染色法（0.4%）计数细胞，以确定与水凝胶混合时所需的初始细胞浓度。

2. 水凝胶流变学性质的测量

  1. 按照步骤1.2所述制备海藻酸盐/明胶水凝胶前体。
    注意：用于力学测试和分析的样品无需无菌条件。所有流变学测试均进行三次重复实验。
  2. 取一支水凝胶前体溶液，置于37 °C水浴中预热1小时。
  3. 打开流变仪，并按照以下步骤初始化系统。
    1. 打开与流变仪相连的空气压缩机，并让空气压缩机运行30分钟。开启流变仪的温度控制箱，启动流变仪主机，然后打开与流变仪连接的计算机。
    2. 打开流变仪软件，点击 初始化 在控制面板上启动初始化程序，并等待初始化过程完成。在控制面板上将平台温度设置为 37 °C。
    3. 点击 测量套件 标签并导航至 启动服务功能，选择 调节驱动惯量 在下拉菜单中，单击 开始调整 在弹出窗口中。
    4. 在流变仪上安装平行测量工具。本实验中所有测试均使用直径为25 mm的平板，板间间隙设为1 mm。
    5. 点击 设置零间距 在控制面板上操作并等待程序完成。在此过程中注意观察法向力的变化。
      注意：此步骤完成后，法向力应为 0。
    6. 点击 测量套件 标签并导航至 启动服务功能，选择 调节上部测量系统的惯性，然后单击 开始调整 在弹出窗口中完成操作后，点击控制面板上的三角形按钮，使测量工具向上移动。
  4. 进行振幅扫描。
    1. 点击 开始，然后点击 插入 在顶部菜单中，选择 等待 从下拉菜单中选择。调出设置窗口，将等待时间设为 2 h。
      注意：这将在测试前增加一个等待步骤。
    2. 点击 开始，然后点击 插入 再次点击按钮，然后从下拉菜单中选择 设备. 调出设置窗口，选择 温度，并将其设置为 25 °C。取消勾选该复选框 等待数值达到目标值.
    3. 点击该步骤 测量，然后点击变量 振荡应变，调出设置窗口，设置 简介 是 斜坡对数，将初始应变和最终应变的值分别更改为0.001%和100% 分别设置频率为 0.01 Hz。
    4. 点击 添加 按钮以添加 温度 变量。点击该变量 温度 并将其设置为25°C。在弹出窗口中，展开 计算器，设置 点密度 每十进制10个点。
    5. 将注射器从水浴中取出，并将约0.5 mL前驱体挤出至流变仪平台。
    6. 单击控制面板上的向下三角形按钮。等待测量工具下降至修整位置。
    7. 使用刮刀修剪测量工具边缘溢出的多余前驱体，并丢弃多余的材料。
    8. 用移液器将矿物油滴加到测量工具的边缘，等待矿物油完全封闭边界。
    9. 点击 继续 在控制面板上。然后单击 开始 按钮（绿色三角形），然后单击 继续 屏幕底部的按钮。
    10. 测试完成后，松开测量工具，然后单击控制面板上的向上三角形按钮。取下测量工具，并用70%乙醇清洁。用70%乙醇清洁平台。
    11. 在当前项目中，单击该步骤 测量 并打开设置窗口。现在，将频率设置为 100 Hz，其余参数保持不变。
    12. 重复步骤 2.4.5 - 2.4.10.
    13. 点击 示意图观察 G’ 和 G” 的曲线变化 与 振荡应变。找出两个频率（0.01 Hz 和 100 Hz）下 G’ 的拐点，并确定这两个拐点对应的振荡应变值。
    14. 选择较小的振荡应变，并在后续所有振荡测试中使用该应变的1/10。
      注意：G’开始偏转的点被视为最大线性弹性应变（ULES），在后续测试中不应超过该值。出于安全考虑，工程上通常采用1/10的比例。该计算得到的应变记为gC.
    15. 测试完成后，单击 表格复制所有数据，并将其粘贴到一个文本文件中。
  5. 进行温度扫描。
    1. 点击 我的应用程序 并选择模板 温度梯度，振荡剪切：凝胶化.
    2. 命名项目。
    3. 点击该步骤 测量 在工作流程中，然后单击变量 温度上拉设置窗口，将初始温度和最终温度分别设为 37 °C 和 25 °C。
    4. 在弹出窗口中，将振荡应变设置为 0.1%，振荡频率设置为 1 Hz。然后将数据点数量设置为 61，数据采集频率设置为 1 点/分钟。点击 计算器 并设置 点密度 至 0.2 °C/点。
      注意：这将使温度以 0.2 °C/min 的速率变化。
    5. 将样品加载到流变仪平台上，并按照步骤 2.4.5 进行测试 - 2.4.10.
    6. 点击 示意图，观察 G’、G” 与 温度。找到 G′ 和 G″ 的交点。确定交点处的温度。
      注：这是水凝胶前体的溶胶/凝胶相变温度。
    7. 重复步骤 2.4.15。
  6. 进行等温时间扫描。
    1. 点击 我的应用程序 并查找并点击该模板 等温时间-温度测试. 点击该步骤 测量 在工作流程中，然后单击该变量 振荡应变，调出设置窗口，将振荡应变设为0.1%，振荡频率设为1 Hz。在弹出窗口中，将数据点数设为120，数据采集频率设为1点/分钟。
      注意：该菌株的价值基于其振幅扫描实验结果。
    2. 点击 添加 按钮以添加 温度 变量。点击变量 温度 在中间窗口将其设置为 25 °C。 
      1. 右键单击该步骤 设备移至测量点 在工作流程中，单击 删除然后点击该步骤 设备设定值，取消勾选该复选框 等待直至达到设定值，并将值设为 25 °C。点击 图片, 标题, 按钮 在屏幕底部，取消勾选该复选框 继续然后点击该步骤 开始，命名项目并保存。
    3. 将样品加载到流变仪平台上，并按照步骤 2.4.5 开始测试 - 2.4.10.
    4. 观察 G’、G” 与 时间。找到 G′ 和 G″ 的交点。确定交点处的时间。测试结束后，点击 表格复制所有数据，并将其粘贴到一个文本文件中。
      注：这是水凝胶前体在 25 °C 下的溶胶/凝胶相变时间。
  7. 测量不同凝胶时间下的屈服强度。
    1. 点击 我的应用 并查找并点击该模板 产率和流动应力，类凝胶状命名项目。单击该步骤 开始 在工作流程中。点击 插入 在顶部菜单中，从下拉菜单中选择 等待. 调出设置窗口，将等待时间设为 20 min。
      注意：这将在测试前增加一个等待步骤。
    2. 点击 开始, 然后点击 插入 再次，然后在下拉菜单中选择 设备. 调出设置窗口，选择 温度 并设置为 25 °C。取消勾选该复选框 等待数值达到目标值.
    3. 点击该步骤 测量 在工作流程中，选择变量 剪切应力，调出设置窗口，将初始和最终剪切应力分别设置为 0 和 10,000 Pa。  点击计算器，设置 点密度 至 0.2 点/帕。在 数据点 在左侧的选项卡中，设置为每秒1个点。
      注意：这将产生 5 Pa/s 的应力 ramping 速率。
    4. 点击 事件控制 弹出窗口底部的选项卡，并设置停止标准：如果剪切速率 > 100 秒-1.
      注意：如果材料发生屈服，测量将自动停止。
    5. 将样品加载到流变仪平台上，并按照步骤 2.4.5 开始测试 - 2.4.10.
    6. 点击 示意图观察应力-应变曲线，找出应变的转折点及其对应的应力值，重复步骤 2.7.2 - 2.7.6，但将每次重复实验的等待时间分别改为30、40和50分钟；这将得到不同凝胶时间下的屈服强度。
      注：该应力被视为表观屈服强度。
      注意：不同流变仪型号和软件版本的操作界面点击可能有所差异。我们建议读者参考我们提供的测试参数，并在实际使用中参照特定流变仪或软件的用户手册。 
       

3. 支架设计、含细胞水凝胶及3D打印模型

  1. 支架设计
    1. 在纸上绘制一个类似螺旋桨的模型。
      注意：螺旋桨样模型的设计基于以下考虑：（a）它模拟了 体内 癌细胞被CAFs包围的情境；（b）它降低了应力的浓度 通过 采用圆形几何结构；（c）具有灵活性，未来可在不改变现有几何结构的情况下向模型中添加更多扇区；（d）在垂直尺度上呈扁平状，以促进营养物质的扩散。
    2. 以螺旋桨中心为原点，并使用以下符号 R0, R1，以及 R2 分别表示内圆、中间扇区和外扇区的最大半径。使用符号 m 和 n 分别表示扇形区域内部的弧线数量和辐条数量。
    3. 计算螺旋桨状模型上每个节点的坐标，并将其写入符号表达式中 R0, R1, R2, m，以及 n.
    4. 启动程序脚本，设置 R0, R1, R2, m，以及 n 作为变量，并输入每个关键节点的符号表达式。
      注意：请参考 材料表 有关任何软件信息。
    5. 连接各节点并规划路径，分别为内圈、中间扇区和外侧扇区分配 cartridges。设置层厚为 150 µm，层数为 4。
    6. 让程序输出一个生物打印机可识别的G代码格式的文本文件。
    7. 设置 R0 = 3.85, R1 = 6.85, R2 = 8.65, m = 2，且 n 5. 运行脚本并获取生成的G-code文件。将该文件复制并粘贴至生物打印机专用的G-code文件夹中。
    8. 打开生物打印机及其控制软件。初始化打印机。打开刚刚创建的G代码脚本，并将所有压力设置为零。返回控制软件，点击选项卡 支架生成器，然后单击 运行 右下角的按钮。观察打印机的移动路径。
      注意：这将测试生成的 G 代码的精度。参考 材料表 有关生物打印机的信息。
    9. 此步骤为可选。根据上述参数构建一个示范性三维模型 通过 计算机辅助设计（CAD）软件
      注意：请参考 材料表 有关供应商软件信息。
  2. 制备含细胞的A3G7水凝胶前体
    注意：本节中的步骤必须在无菌条件下进行。将生物打印机置于生物安全柜内。
    1. 用70%乙醇彻底喷洒生物打印机进行消毒，并在紫外灯下照射过夜。
    2. 取出一支水凝胶前体（4 °C），置于37 °C水浴中温育1 h。
    3. 从 CO₂ 培养箱中取出装有细胞的 T 型培养瓶（见步骤 1.3）2 培养箱，并置于生物安全柜中。弃去培养基，用DPBS冲洗细胞两次。加入预热的胰蛋白酶-EDTA溶液（3.0 mL），在37 °C孵育细胞6分钟。加入等体积胎牛血清（FBS）以灭活胰蛋白酶。使用台盼蓝染色法进行细胞计数。
    4. 将水凝胶前体的注射器从水浴中取出，清洁后用70%乙醇消毒。将注射器放入生物安全柜中。
    5. 将约 3 mL 水凝胶前体挤入 10 mL 打印 cartridge 中。将前体与 MDA-MB-231-GFP 细胞混合，细胞密度为 1 x 106 细胞/mL，通过缓慢移液操作避免产生气泡。用无菌端盖和顶盖封闭 cartridge，并用石蜡膜密封。以834 × g离心1分钟，以去除产生的任何气泡。
    6. 对含 IMR-90-mCherry 细胞的前体溶液和无细胞前体溶液重复步骤 3.2.3 至 3.2.5。
    7. 用70%乙醇对所有3个打印 cartridge 进行灭菌，然后将其装入生物打印机的腔室中。在打印机的控制软件中，将 cartridge 温度设置为25 °C。等待35分钟，使前体材料达到可打印状态。
      注意：此时间不会影响包埋在水凝胶中细胞的活力。
  3. 3D打印模型
    1. 在打印机的控制软件中，展开 工具头 在打印机控制软件的选项卡中，单击左侧图形界面中的1个墨盒，然后单击 测量短片段 按钮以测量喷嘴尖端的位置。对另外两个墨盒重复此操作。
    2. 放置一个透明的聚苯乙烯微孔板，打开G代码文件，将所有墨盒的压力调整为200 kPa。返回控制软件，点击选项卡 支架生成器，选择一个点作为打印起点，然后单击 运行 右下角的按钮。重复此步骤以获得 3 个 更多重复实验。
    3. 所有螺旋桨模型打印完成后，加入 100 mM CaCl₂ 溶液2 溶液中交联模型1分钟，然后用DPBS冲洗2次以去除多余的Ca++ 离子
    4. 使用刮铲将模型小心转移至涂有琼脂糖的6孔板中。每孔加入5 mL DMEM培养基。将培养板置于37 °C、5% CO₂的培养箱中孵育。2.
      注意：确保模型漂浮在孔中。
    5. 每3天更换一次细胞培养基，总共培养30天。

4. 水凝胶圆盘上的细胞活力与球体形成实验。

  1. 水凝胶圆盘制备
    1. 重复步骤 3.2.1 - 3.2.6。
      注意：可用小型无菌容器替代卡盒。
    2. 使用无菌的1 mL带刻度注射器，剪去喷嘴以在注射器末端制造一个大孔（孔径与注射器管体其余部分相同）。用70%乙醇清洗，并放置至干燥。
      注意：此操作应在无菌生物安全柜（BSC）中进行。
    3. 取一个培养板盖，在其表面加入100 mM CaCl2溶液直至覆盖整个表面；然后取含细胞的水凝胶填充至注射器中，采用悬滴法挤出100 µL。静置水凝胶1分钟，随后用大量DPBS冲洗。将水凝胶圆盘转移至涂有琼脂糖的6孔板中，每孔加入5 mL基础DMEM培养基，在37 °C、5% CO2条件下培养最多30天。每隔3天更换一次培养基。
  2. 细胞与类球体活性检测
    1. 采用MTS法测定细胞活性。用DPBS洗涤每个圆盘，再用无菌精细刀片将其切成4等份。收集整个圆盘的所有部分并转移至96孔板中。每孔加入100 μL DMEM和20 μL MTS试剂，混合后于37 °C孵育2小时。
    2. MTS反应完成后，收集上清液并转移至新的洁净96孔板中，在490 nm波长下测定各孔样品的吸光度。
  3. 类球体形成观察
    1. 在培养的第0、7、15、21和30天，从培养箱中取出孵育中的螺旋桨模型或圆盘模型，并转移至洁净的6孔板中。
    2. 使用共聚焦转盘倒置显微镜观察类球体，通过多点成像和z轴层扫获取图像。对每个螺旋桨模型或圆盘模型，沿其水平直径从左至右以500 µm间隔选取成像位置，并在每个水平位置上从底部到顶部焦平面采集z轴层扫图像。
      注意：请参见材料表以获取供应商信息。
    3. 使用ImageJ软件提供的最大投影（maximum stack projection）算法工具重建图像，生成用于类球体分析的二维图像。

5. 扫描电子显微镜（SEM）

  1. 按照步骤1.2所述方法制备海藻酸盐/明胶水凝胶。
    注意：无需无菌条件。
    警告：液氮和多聚甲醛具有危险性，必须小心操作。
  2. 取1 mL水凝胶放入研钵中，加入液氮，用研杵研磨。持续添加液氮以防止水凝胶解冻。将所得粉末转移至1.5 mL离心管中，密封后于-80 °C保存2小时，随后冷冻干燥24小时。
  3. 对于类球体成像，先用DPBS轻柔洗涤水凝胶2次，然后在37 °C下浸入4%多聚甲醛中固定细胞30分钟，接着用DPBS冲洗，并用液氮速冻。最后，将样品冷冻干燥24小时。
  4. 使用扫描电子显微镜（SEM）在25.0 kV电压、70 Pa（腔体压力）条件下，以40X至5,000X的放大倍数分析水凝胶/类球体的结构与形态。

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结果

温度扫描结果显示 A3G7 前驱体在 25 °C 和 37 °C 时存在明显差异。前驱体在 37 °C 时呈液态，其复数黏度为 1938.1 ± 84.0 mPa·s，且 G″ 大于 G′，验证了该状态。随着温度降低，由于明胶分子自发物理缠结形成三螺旋结构，前驱体发生物理凝胶化29,30。G′ 和 G″ 均随温度下降而升高，并在 30.6 °C 时趋于一致，表明发生溶胶-凝胶转变。模量继续随温度降低而增加，在 25 °C 时达到 G′ = 468.5 ± 34.2 Pa 和 G″ = 140.7 ± 9.3 Pa（图 1a）。根据温度扫描结果，我们选择 25 °C 作为打印温度。凝胶动力学实验模拟了样品制备和操作过程中发生的温度变化（即将样品从 37 °C 水浴中取出并放入 25 °C 生物打印舱内）。在降温条件下，G′、G″ 和 |η*| 随时间增加，溶胶-凝胶转变在约 17 ...

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讨论

含细胞结构可能在工艺过程中的任何阶段因污染（生物或化学污染）而受损。通常，生物污染在培养两到三天后表现为培养基或生物打印结构的颜色变化。因此，灭菌（物理和化学消毒）是所有与细胞相关操作的关键步骤。值得注意的是，明胶经高压灭菌后会改变其凝胶特性，导致我们在实验中观察到其凝胶速度变慢。因此，我们对海藻酸钠和明胶粉末进行了灭菌处理。 通过 紫外线照射。由于紫外线的穿透能力非常有限，只能作用于极薄的一层（< 应使用0.5 mm的喷头。海藻酸钠和明胶的浓度可根据需要任意调整，以调节材料的力学和生物学性能32在本研究中，我们选择了A3G7，因为它在其可打印时间窗口内具有理想的可打印性，且交联后的水凝胶在30天实验期间表现出高稳定性。将明胶粉末溶于DPBS时加热至60 °C有助于促进明胶的液化，从而便于搅拌。也可使用较低温度，但需要更长的搅拌时间。

流变学温度扫描显示溶胶-凝胶转变点为 30.6 °C，与其他文献报道结果一致33。理论上，任何高于 30.6 °C 的温度均可使...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

陶江感谢中国国家留学基金管理委员会（201403170354）和麦吉尔大学工程博士奖学金（90025）提供的奖学金资助。Jose G. Munguia-Lopez 感谢墨西哥国家科学技术委员会（CONACYT，项目编号 250279、290936 和 291168）以及魁北克自然科学与技术研究基金会（FRQNT，项目编号 258421）提供的奖学金资助。Salvador Flores-Torres 感谢墨西哥国家科学技术委员会（CONACYT，项目编号 751540）提供的奖学金资助。Joseph M. Kinsella 感谢加拿大自然科学与工程研究理事会、加拿大创新基金会、Townshend-Lamarre 家族基金会以及麦吉尔大学提供的经费支持。我们感谢 Allen Ehrlicher 允许我们使用他的流变仪，Dan Nicolau 允许我们使用他的共聚焦显微镜，以及 Morag Park 为我们提供荧光标记细胞系的使用权限。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
海藻酸钠FMC BioPolymerCAS编号: 9005-38-3Protanal LF 10/60 FT
明胶Sigma-AldrichG9391牛皮来源B型明胶
杜尔贝科磷酸盐缓冲液（DPBS 1X）GibcoLS141901361×，无钙，无镁
磁力加热搅拌器Corning N/A搅拌器/加热板型号 PC-420
50 mL 离心管Corning352098Falcon® 50 mL 高透明度聚丙烯离心管，锥底，无菌
离心机GMIN/ASorvall RT6000D，GMI，美国
无水氯化钙Sigma-AldrichC1016
MilliQ 水MilliporeN/A
Millipore 0.22 µm 滤器MilliporeSLGS033SBMillex-GS 注射器滤器单元，0.22 µm，混合纤维素酯，33 mm，环氧乙烷灭菌
振荡流变仪 MCR 302Anton PaarN/A
流变仪测量工具 CP25Anton Paar79038流变仪用锥形板几何结构
RheoCompassAnton PaarN/A控制流变仪 MCR 302 的软件
扫描电子显微镜HitachiN/ASEM，Hitachi SU-3500 变压
多聚甲醛，96%，超纯Acros Organics416785000
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）Gibco11965092
抗生素/抗真菌溶液（100X）稳定型SigmaA5955
胎牛血清Wisent Bioproducts080-150
细胞培养 T-75 培养瓶Sigma-AldrichCLS43064175 cm2 表面经组织培养处理
3D 生物打印机 BioScaffolder 3.1GeSiMN/A
GeSim 软件GeSiMN/A控制 BioScaffolder 3.1 的软件
10 cc 筒，抗紫外EFD Nordson7012126
端盖EFD Nordson7014472
喷嘴盖EFD Nordson7014469
活塞 EFD Nordson7012182
不锈钢喷嘴 G25EFD Nordson7018345
水浴锅VWRN/A
琼脂糖Sigma-AldrichA9539生物试剂，适用于分子生物学
Costar 6 孔板 Corning3516经组织培养处理的多孔板，独立包装，无菌 
共聚焦转盘倒置显微镜Olympus Life ScienceN/AOlympus IX83
MTS 检测试剂盒PromegaG3582CellTiter 96® AQueous One 溶液细胞增殖检测试剂盒 
活/死细胞活力与细胞毒性检测试剂盒Molecular Probes,ThermoFisher ScientificL3224
胰蛋白酶 0.25/EDTA 1XGibco25200-072
Corning 96 孔板Corning3595透明平底聚苯乙烯组织培养处理微孔板，独立包装，带低蒸发盖，无菌
高压灭菌器 TuttnauerHeidolph BrinkmannN/AHeidolph Tuttnauer 2540E 高压灭菌器电子型号，带4个不锈钢托盘，23L容量
台盼蓝Invitrogen T102820.4% 溶液
乙醇Commercial AlcoholsP016EA95Greenfield Specialty Alcohols
CO2 培养箱PanasonicN/AMCO 19AIC-PA
冷冻干燥机 SP ScientificN/AVirtis Sentry 2.0
SolidWorksDassault SystemsN/A用于构建演示性螺旋桨状模型的CAD软件
MATLABThe MathWorksN/A用于为 BioScaffolder 3.1 生成 G 代码的编程软件

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