通过啮齿类动物行为学测试评估大鼠运动皮层微电极植入所致功能缺损

摘要

我们已证明，在大鼠运动皮层植入微电极会导致立即且持续的运动功能障碍。本文所述方法概述了一种微电极植入手术以及三种啮齿类动物行为学任务，旨在阐明由于微电极植入对运动皮层造成损伤后，精细运动或粗大运动功能可能发生的改变。

摘要

植入大脑的医疗器械具有巨大的应用潜力。作为脑机接口（BMI）系统的一部分，皮层内微电极已展现出记录单个或少量神经元动作电位的能力。这些记录到的信号已成功用于使患者与计算机、机械肢体或其自身肢体进行交互或控制 。然而，先前的动物研究表明，脑内微电极的植入不仅会损伤周围组织，还可能导致功能缺陷。本文将讨论一系列行为学测试方法，用于量化在大鼠运动皮层植入皮层内微电极后可能出现的运动功能障碍。开放场地网格测试、梯子穿越测试和握力测试等方法，可为微电极植入所引发的潜在并发症提供有价值的信息。行为学测试结果将与终点组织病理学分析相关联，从而进一步揭示该操作对邻近组织的病理后果及其影响。

引言

皮层内微电极最初用于绘制大脑神经回路图谱，现已发展成为一种有价值的工具，可用于检测运动意图，并由此产生功能性输出¹。所检测到的功能性输出可帮助脊髓损伤、脑性瘫痪、肌萎缩侧索硬化症（ALS）或其他运动功能受限疾病的患者控制计算机光标^2,3或机械臂^4,5,6，或恢复其自身失能肢体的功能⁷。因此，皮层内微电极技术已成为一个前景广阔且快速发展的研究领域⁸。

由于该领域已取得显著成果，目前已有临床研究正在开展，以改进并更深入地理解脑机接口（BMI）技术的可能性^5,9,10。通过实现与大脑神经元之间充分的通信潜力，人们认为其康复应用前景无限⁸。尽管人们对皮层内微电极技术的未来持高度乐观态度，但众所周知，微电极最终会失效¹¹，这可能归因于植入后引发的急性神经炎症反应。在大脑中植入外来材料会造成周围组织的即刻损伤，并进一步引发神经炎症反应，从而导致持续性损害，而该炎症反应的程度取决于植入物的特性¹²。此外，大脑中的植入物 可能引起微损伤效应：即由于装置插入导致的急性水肿和出血，被认为会引起葡萄糖代谢降低¹³。此外，无论使用何种动物模型，信号质量以及可记录到有效信号的时间长度均存在不一致性^11,14,15,16。多项研究已证实神经炎症与微电极性能之间存在关联^17,18,19。因此，学界共识认为，至少部分原因在于微电极周围神经组织的炎症反应损害了电极的可靠性。

许多研究已探讨了局部炎症^11,20,21,22，或探索了减轻因植入所导致脑组织损伤的方法^11,23,24,25，旨在随时间推移改善记录性能^14,26。此外，我们最近的研究表明，在大鼠运动皮层插入微电极所引起的医源性损伤会导致即时且持续的精细运动功能障碍²⁷。因此，本文所介绍方案的目的是为研究人员提供一种定量评估方法，用于检测因皮层内装置（本文中为微电极）植入及长期留置所引发脑创伤后可能出现的运动功能障碍。本文描述的行为学测试旨在区分粗大运动与精细运动功能的损伤，且可广泛应用于多种脑损伤模型。这些方法操作简便、可重复性强，易于在啮齿类动物模型中实施。此外，本文所述方法可实现运动行为学结果与组织病理学结果之间的关联分析，而这一优势在脑机接口（BMI）领域此前鲜有发表。最后，由于这些方法最初设计用于检测精细运动功能²⁸、粗大运动功能²⁹以及应激与焦虑行为^29,30，因此也可应用于多种头部损伤模型，以帮助研究人员排除（或确认）任何运动功能缺陷。

方案

所有实验程序和动物护理操作均经路易斯·斯托克斯克利夫兰退伍军人事务医疗中心机构动物护理与使用委员会批准，并遵循其规定执行。

注意：为了帮助研究人员了解为何选择刺伤模型作为对照，建议参考 Potter et al.²¹ 的相关研究工作。

1. 微电极植入手术步骤

1. 术前动物准备
   1. 使用异氟烷（2 - 4%）在诱导室中对动物进行麻醉。在麻醉期间，使用生命体征监测系统持续监测动物的心率和血氧含量。
   2. 将动物转移至鼻罩以维持麻醉。皮下注射头孢类抗生素（如头孢唑林，25 mg/kg）和非甾体类抗炎药（如卡洛芬，5 mg/kg），分别用于预防感染和控制疼痛。
   3. 在动物眼睛上充分涂抹眼用软膏，防止角膜干燥。
   4. 使用小型动物指甲剪修剪脚趾甲，防止动物在伤口愈合期间抓挠缝线。注意不要剪得过短，以免引起疼痛和出血。
   5. 使用电动剃毛器彻底剃除动物从耳后至两眼之间的头部毛发。
   6. 在动物头部切口区域皮下注射布比卡因（0.3 mL 的 0.125% 布比卡因，由原液稀释而成），以提供局部镇痛。
   7. 将动物固定在立体定位仪上，使用耳杆固定头部以防止术中移动。在动物身下放置循环水加热垫，以维持其体温。
   8. 覆盖无菌手术巾，例如经机构批准的无菌塑料膜，以隔离手术区域。
   9. 使用聚维酮碘溶液和异丙醇交替擦拭手术区域进行消毒。
   10. 根据机构规程进行足趾夹捏测试，确认动物处于外科麻醉深度。
2. 准备动物以进行植入
   1. 使用10号手术刀片沿中线做约1英寸长的切口，暴露颅骨。用棉签钝性剥离骨膜，并用纱布压迫止血。使用鳄鱼夹牵开周围组织，并用过氧化氢清洁和脱水颅骨表面。
   2. 在暴露的颅骨上滴加数滴以氰基丙烯酸酯为基础的组织粘合剂，以增强后续牙科水泥的粘附力。
   3. 在选定的大脑半球上，通过在骨头上做一小切口标记对应前爪运动的运动皮层区域，该位置大约位于中线外侧3 mm、前囟前方2 mm处。
   4. 使用1.75 mm圆头牙科钻去除部分颅骨，操作时需特别注意避免钻速过快或过深，并将一只手支撑在立体定位仪上以增加稳定性。应间歇性地使用钻头，防止局部过热³¹。
   5. 使用精细的45°弯钩状硬脑膜剥离针轻轻翻起硬脑膜。
   6. 使用棉签和生理盐水清除任何出血，注意避免直接接触脑表面。
3. 将微电极插入运动皮层
   1. 小心地将已灭菌的微电极安装在立体定位仪的通用夹持器上，注意避免触碰电极柄。确保电极的前置放大器接口连接端被夹持器牢固固定。
      注：此处使用了一种非功能性的密歇根式硅基电极，尺寸为2 mm × 123 µm × 15 µm，电极柄通过精细镊子插入。
   2. 利用立体定位仪上的微操纵器，小心地将电极尖端定位至开放的颅骨窗上方。
   3. 使用微操纵器作为测量引导，缓慢将电极向下推进约2 mm进入脑组织（根据所用电极类型，可能需要采用自动控制速率的插入方式）。操作时应尽可能避开可见的血管。电极到位后，小心松开夹持器中的连接端，并撤回插入臂。
   4. 使用棉签和生理盐水小心清除电极周围的出血。
   5. 使用硅胶弹性体封闭植入电极周围的颅骨开窗区域。
   6. 使用牙科水泥将电极固定在颅骨上。
   7. 待水泥完全干燥后，将切口前后两端的边缘拉拢，并缝合关闭。
4. 术后护理
   1. 让动物在循环水加热垫上恢复，同时继续监测其生命体征。避免使用加热灯，因为灯光产生的温度较难控制，可能导致动物过热。
   2. 当动物完全清醒后，将其转移至清洁的笼子中，并确保其能方便地获取食物和水。
   3. 在术后第1至第3天，每天皮下注射头孢类抗生素（25 mg/kg）和非甾体类抗炎药（5 mg/kg），以预防感染并控制疼痛。
   4. 至少在术后第5天内，每日观察动物是否有疼痛或不适、出血、体重变化或缝线相关问题的迹象。

2. 行为学测试

1. 在所有行为学测试中，应在电极植入手术前一周内对动物进行每项测试各2次，以计算其术前基线评分。手术后，让动物休息1周，然后开始每周每项测试2次的行为学检测。整个研究过程中，术前和术后测试应保持一致的测试条件，以尽量减少应激对动物表现的影响，否则可能测得的是焦虑水平而非运动功能。
   1. 每次测试开始前以及每只动物测试结束后，均需使用基于二氧化氯的消毒剂清洁所有测试设备。
   2. 对旷场网格和梯子行走测试进行录像。这些测试需要一台视频摄像机（最低1080p分辨率，帧率至少15 fps，对角线视场角78°）、一台笔记本电脑以及用于存储视频数据的空间。
   3. 每天测试开始前，将动物带入测试房间，并使其适应环境至少20分钟后再开始测试。测试房间应保持光照和温度恒定，且由相同的实验人员完成全部测试。理想情况下，所有动物在整个测试期间均使用同一间房间，且房间布置不作任何更改。
   4. 使用食物奖励鼓励动物完成任务，尤其是在梯子行走训练期间。谷物早餐、小块香蕉片或饼干是良好的奖励物。
   5. 将每周测试的表现标准化为每只动物各自的术前评分（公式 1）。
      公式 1：
2. 旷场网格测试
   注：旷场网格测试装置为实验室自制，运行表面面积为1 m²，四周为约40 cm高的不透明侧壁。网格底部运行面从下方用胶带划分为9个相等的正方形（图1A）。摄像机永久固定在网格正上方的脚手架上。
   1. 开始旷场网格测试时，将动物面朝远离实验者的方向放置于网格中央。
   2. 让动物自由奔跑3分钟，同时录制视频。
   3. 动物完成测试后，将其从网格中移出并放回笼中。使用基于二氧化氯的消毒剂彻底清洁网格。
   4. 每只动物每天测试1次。
   5. 使用视频追踪软件分析动物穿过的格线数量、总移动距离以及最大速度，作为粗大运动功能的评估指标。
      注：本文所展示的数据由经过培训的研究人员手动量化，但推荐使用近期开发的实验室内部追踪算法³²。
3. 梯子行走测试
   注：梯子行走测试装置为实验室自制，由两块长1 m的透明亚克力侧板组成，其间以直径3 mm、间距2 cm的横杆连接（图2A）。梯子行走是一项技能型测试，因此在记录术前基线评分前需进行为期1周的训练。训练与正式测试的流程相同。
   1. 将动物转移至一个临时的清洁暂养笼中，以开始梯子行走测试。
   2. 设置梯子使其连接两个笼子。梯子的起始端置于一个清洁笼子上，终点端置于动物的 home cage 上，以此作为动物完成行走的动力。
   3. 将相同（或类似）型号的摄像机安装在三脚架上，置于梯子中央位置。摄像机高度应与横杆齐平，并能完整拍摄整个梯子。
   4. 在摄像机开始录制后，手持动物至梯子起始线处，使其前爪接触第一根横杆。
   5. 让动物以自己的速度穿过梯子。从动物前爪接触第一根横杆开始，到其到达倒数第三根横杆的终点线为止的时间，即为穿越时间。
   6. 若动物在梯子上转身或在20秒内未移动，则视为本次运行失败。为每次失败的运行赋予惩罚性计时分数。惩罚时间应根据术前测试中记录的最慢表现来确定²⁷。
   7. 每天允许每只动物穿越梯子5次，每次之间休息约1分钟。
   8. 以每天最快3次运行的平均时间为精细运动功能的评估指标。此外，使用视频追踪软件记录每只前爪从横杆上滑脱的次数。
      注：本文所展示的数据由经过培训的研究人员手动量化，但推荐使用Dona et al.开发的近期实验室内部追踪算法³²。
4. 抓握力测试
   1. 每次测试前校准抓握力测量仪，并以克（g）为单位测量力量。
   2. 将抓握力测量仪放置在操作台边缘，使握把部分悬于地面之上。
   3. 握住动物尾根部，使其前爪抓住握把（图3A）。
   4. 当动物双前爪牢固抓住握把后，缓慢而稳定地通过尾根部将动物从测量仪方向拉离。
   5. 记录抓握力测量仪数字显示屏上显示的动物最大抓握力值。
   6. 每只动物每天测试3次，每次之间休息约2分钟。
   7. 作为精细运动功能的评估指标，记录并计算3次试验中最大抓握力输出的平均值。

3. 行为学后处理方案

1. 完成所有行为学测试后（例如在植入后8至16周，使用氯胺酮（160 mg/kg）和赛拉嗪（20 mg/kg）对动物进行深度麻醉，经心脏灌注，取出脑组织并进行冷冻切片，随后利用免疫组织化学标记物对组织染色，以量化植入部位周围的细胞反应^{33,34,35,36,37,38}.

4. 统计分析

注意：对于旨在回答特定研究问题的任何研究，强烈建议进行前瞻性功效分析。功效分析应基于特定的研究假设、实验设计、预期处理效应量和变异性，以及达到临床或科学意义所需的效应量，以确定特定实验设计下实现统计学显著性所需的动物数量。

1. 使用常用统计软件进行统计分析。
2. 将描述性统计结果制表，并以均值 ± 标准误的形式展示。
3. 在每个每周时间点分析行为学表现［在开放场网格（步骤2.2）、梯子测试（步骤2.3）和握力测试（步骤2.4）］，以比较对照组 与 采用双样本 t 检验对植入组进行分析。将每个周时间点视为独立的测量值。
4. 使用混合效应线性模型量化纵向性能。周数和组别为固定因子，实验动物作为随机效应嵌套于组别内。采用方差分析（ANOVA）确定因子效应，显著性水平为 p < 0.05.
5. 使用线性回归分析比较梯度性能与免疫球蛋白G（IgG）强度的关系。采用Pearson法计算相关系数。

结果

采用本文所述方法，按照既定操作流程^39,40,41,42，完成运动皮层的微电极植入手术，随后进行开放场地网格测试以评估粗大运动功能，以及梯子行走和抓力测试以评估精细运动功能²⁷。在植入动物术后16周内，每周进行2次运动功能测试，以未接受手术且未植入的动物作为对照组。所有术后评分按周取平均值，并归一化至每只动物术前的基线评分。所有误差均以均值标准误（SEM）表示。

为评估动物的大体运动功能和应激行为，使其在开放场地网格实验中自由奔跑3分钟（图1A）。该实验可记录...

讨论

本方案已用于在啮齿类动物脑损伤模型中有效且可重复地评估精细运动和粗大运动功能障碍。此外，该方法还可实现精细运动行为与运动皮层微电极植入后组织学结果之间的相关性分析。这些方法易于操作、成本低廉，并可根据研究人员的具体需求进行调整。更重要的是，行为学测试不会给动物带来显著应激或疼痛；相反，研究人员发现动物似乎逐渐喜欢上了测试过程中的锻炼和奖励。既往研究表明，运动皮层损伤可导致运动、记忆及功能损害^44,45。然而，尽管已有这些认识，关于微电极植入运动皮层所引起的功能影响仍缺乏足够信息²⁷，而这一问题可能对患者的临床预后产生不利影响。

在整个实验方案中，无论是手术操作还是行为学测试，均可进行多种修改。本方案概述了在动物大脑运动皮层中影响前爪功能的区域植入微电极的操作流程。该流程可轻松调整以适应不同类型的植入物，例如用于电刺激的电极⁴⁶或用于药物递送的套管

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
雄性 Sprague Dawley 大鼠，体重 201-225 克	Charles River	CD
Compac5 麻醉系统	Vetequip	901812
电动剪毛器	Wahl	9918-6171
立体定位仪	David Kopf Instruments	1760
Gaymar 加热水垫及水泵	Braintree Scientific Inc	TP-700
Vetbond 组织粘合剂	3M	07-805-5031
牙科钻头	Pearson Dental	O60-0045
硬脑膜剥离针	Fine Science Tools	10064-14
硅胶柄微电极	克利夫兰退伍军人医疗中心自制	N/A
KwikCast 硅胶弹性体	World Precision Instruments	KWIK-CAST
Teets 牙科水泥	A-M Systems	525000
高清网络摄像头 c920	Logitec	960-000764
握力计	Harvard Apparatus	565084
Minitab 17 统计分析软件	Minitab Inc
旷场网格实验装置	凯斯西储大学自制	N/A
梯子行走实验装置	凯斯西储大学自制	N/A
兔抗大鼠 IgG 抗体	Bio-Rad	618501