使用缺氧条件下培养的细胞中内源性核蛋白进行免疫共沉淀实验

摘要

本文介绍了一种共免疫沉淀实验方案，用于研究缺氧条件下内源性核蛋白之间的蛋白质-蛋白质相互作用。该方法适用于验证转录因子与转录共调节因子在缺氧状态下的相互作用。

摘要

低氧水平（缺氧）会引发多种适应性反应，其中缺氧诱导因子1（HIF-1）复合物作为主调控因子发挥作用。HIF-1由一个受氧气调控的α亚基（HIF-1α）和一个组成型表达的β亚基（HIF-1β）组成，后者也称为芳香烃受体核转位蛋白（ARNT），可调控参与血管生成、促红细胞生成和糖酵解等多种生物学过程的基因。鉴定与HIF-1相互作用的蛋白质对于理解缺氧信号通路至关重要。除了对HIF-1α稳定性的调控外，缺氧还会触发包括HIF-1α和ARNT在内的多种转录因子向细胞核的转位。值得注意的是，目前用于研究此类蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs）的方法大多基于通过蛋白质过表达人为提高蛋白水平的系统。蛋白质过表达常常导致因时空异常而产生的非生理结果。本文描述了一种经改良的共免疫沉淀实验流程，该流程在缺氧处理后使用内源性核蛋白，并以概念验证的方式展示HIF-1α与ARNT之间的相互作用。在本方案中，细胞在缺氧条件下收集，且所用杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）洗涤缓冲液也预先平衡至缺氧条件，以避免再氧合过程中发生蛋白质降解或蛋白复合物解离。此外，随后提取细胞核组分以富集并稳定内源性核蛋白，避免蛋白质过表达时常出现的假阳性结果。该方案可用于展示在缺氧条件下转录因子与转录共调节因子之间的内源性和天然相互作用。

引言

当身体的细胞和组织供氧不足时，便会发生缺氧。缺氧在多种生理和病理过程中发挥关键作用，例如干细胞分化、炎症和癌症^1,2。缺氧诱导因子（HIFs）以异源二聚体形式发挥作用，由一个受氧调控的α亚基和一个组成型表达的β亚基（也称为ARNT）构成³。迄今为止已鉴定出三种HIF-α亚基亚型（HIF-1α、HIF-2α和HIF-3α）以及三种HIF-β亚基（ARNT/HIF-1β、ARNT2和ARNT3）。HIF-1α和ARNT广泛表达，而HIF-2α、HIF-3α、ARNT2和ARNT3的表达模式则更为局限⁴。HIF-1蛋白复合物是缺氧反应的关键调控因子。在缺氧条件下，HIF-1α趋于稳定，随后转入细胞核并与ARNT形成二聚体⁵。接着，该复合物结合到特定的核苷酸序列——即所谓的缺氧反应元件（HREs）——并调控参与血管生成、红细胞生成和糖酵解等多种过程的靶基因表达⁶。除了这种"经典"反应外，缺氧信号通路还被证实与多个细胞应答信号通路存在交叉对话，例如Notch通路和核因子-κB（NF-κB）通路^7,8,

方案

本实验方案使用人胚胎肾293A（HEK293A）细胞，遵循新加坡南洋理工大学人类研究伦理委员会的指导方针。

1. 在 HEK293A 细胞中诱导缺氧

1. 准备四个 10 cm 培养皿，每皿接种 3–5 × 10⁶ 个 HEK293A 细胞，加入 10 mL 添加了 10% 胎牛血清（FBS）、2 mM L-谷氨酰胺、110 mg/L 丙酮酸钠、100 U/mL 青霉素和 100 mg/mL 链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM，4.5 g/L 葡萄糖）。将细胞置于 37 °C、5% CO₂ 的培养箱中培养。
   注意：细胞接种操作应在生物安全柜（BSC）中进行。所有放入生物安全柜的物品表面均需用 70% 乙醇擦拭。
2. 接种后 24 小时，当细胞融合度达到 80–90% 时，将其中两个培养皿放入培养箱手套箱内的低氧亚室（见材料表），设置条件为 1% O₂、5% CO₂、37 °C；另两个培养皿保持常氧条件（21% O₂、5% CO₂、37 °C）培养 4 小时。使用一组常氧和低氧处理的细胞通过蛋白质印迹法评估低氧处理效果，另一组细胞用于共免疫沉淀实验。
   注意：氧气浓度可设定在 0–5% 范围内，低氧处理时间可根据细胞类型和研究目的进行调整。

结果

为评估细胞对缺氧的反应，检测了缺氧处理后HIF-1复合物各组分的表达水平及其亚细胞定位。将HEK293A细胞在缺氧条件下培养4小时，或在常氧条件下培养作为对照。通过Western blot检测全细胞裂解物或核/胞质提取物中HIF-1α和ARNT蛋白的表达水平。结果表明，与预期一致，缺氧条件下HIF-1α总蛋白水平上调，而ARNT在全细胞裂解物中的表达水平无明显变化（图1A）。此外，缺氧可诱导HIF-1α和ARNT在HEK293A细胞核中的聚集（图1B），该结果与既往报道一致，尽管在部分检测的细胞系中未观察到ARNT的胞质表达¹⁹。

接下来，我们证明了缺氧处理后HIF-1α与ARNT之间的相互作用。从在常氧或低氧条件下暴露4小时的HEK293A细胞中制备核提取物，并使用这些核提取物进行共免.......

讨论

HIF-1 复合物是细胞氧稳态的主要调控因子，可调控大量参与细胞低氧适应性反应的基因。鉴定新的 HIF-1 相互作用蛋白对于理解低氧信号转导机制具有重要意义。共免疫沉淀实验常用于蛋白质相互作用（PPI）研究，以阐明细胞内的信号转导通路。然而，目前仍广泛使用蛋白过表达方法，这可能导致实验假象。此外，HIF-1α 是一种高度不稳定的蛋白，在复氧过程中会迅速降解¹¹。同时，低氧可触发大多数哺乳动物细胞系中 HIF-1 组分向细胞核的转位。因此，传统的共免疫沉淀方案需要优化，以便在低氧处理后鉴定出具有生理相关性的 HIF-1 相互作用蛋白。本文描述了一种改良的共免疫沉淀实验方案，用于证明低氧条件下 HIF-1α 与 ARNT 之间的相互作用。

为避免复氧过程中HIF-1α的降解，低氧细胞在培养箱手套箱的处理室中收集，该处理室已预先平衡至低氧条件。DPBS洗涤缓冲液在使用前也已平衡至低氧条件。若无可用的低氧工作站进行处理，可使用预先平衡至低氧条件的DPBS洗涤低氧细胞，随后迅速在冰上收集。考虑到低氧可诱导HIF-1组分的核转位，且蛋白过表达可能.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
材料
1.0 M Tris-HCl 缓冲液，pH 7.4	1st BASE	1415
Protein A/G Sepharose 珠	Abcam	ab193262
天然小鼠 IgG 蛋白	Abcam	ab198772
EDTA	Bio-Rad	1610729
2x Laemmli 样品缓冲液	Bio-Rad	1610737
2-巯基乙醇	Bio-Rad	1610710
硝酸纤维素膜	Bio-Rad	1620112
印迹级封闭剂	Bio-Rad	1706404	用于 Western 印迹应用的脱脂奶粉
10x Tris 缓冲盐水 (TBS)	Bio-Rad	1706435
10% Tween 20	Bio-Rad	1610781
10x Tris/甘氨酸/SDS	Bio-Rad	1610732
10x Tris/甘氨酸缓冲液	Bio-Rad	1610771
Precision Plus Protein 双色标准品	Bio-Rad	1610374
抗兔 IgG，HRP 标记抗体	Cell Signaling	7074
抗小鼠 IgG，HRP 标记抗体	Cell Signaling	7076
SignalFire ECL 试剂	Cell Signaling	6883
杜氏磷酸盐缓冲液	Corning	21-030-CV
苯甲基磺酰氟 (PMSF)	Merck Millipore	52332
ARNT/HIF-1 beta 抗体	Novus Biologicals	NB100-124	浓度：1.4 mg/mL
HIF-1 alpha 抗体	Novus Biologicals	NB100-479	浓度：1.0 mg/mL
YY1 抗体	Novus Biologicals	NBP1-46218	浓度：0.2 mg/mL
Qproteome 核蛋白提取试剂盒	Qiagen	37582	裂解缓冲液 NL 和提取缓冲液 NX1 随试剂盒提供
GAPDH 抗体	Santa Cruz	sc-47724	浓度：0.2 mg/mL
甘油 (≥99%)	Sigma	G5516
氯化钾	Sigma	P9541
RIPA 缓冲液	Sigma	R0278
氯化钠 (NaCl)	Sigma	71376
NP-40	Sigma	127087-87-0
Dulbecco’s 改良 Eagle’s 培养基 (DMEM, 4.5 g/L 葡萄糖)	Thermo Fisher Scientific	11995065
二硫苏糖醇 (DTT)	Thermo Fisher Scientific	R0861
胎牛血清	Thermo Fisher Scientific	10270106
HEK293A 细胞系	Thermo Fisher Scientific	R70507
甲醇	Thermo Fisher Scientific	67-56-1
青霉素-链霉素	Thermo Fisher Scientific	15140122
Pierce 蛋白酶抑制剂片剂	Thermo Fisher Scientific	88660
Pierce BCA 蛋白定量试剂盒	Thermo Fisher Scientific	23225
QSP 凝胶加样吸头	Thermo Fisher Scientific	QSP#010-R204-Q-PK	1-200 uL
设备/仪器
厚型印迹滤纸，预裁，7.5 x 10 cm	Bio-Rad	1703932
Mini-PROTEAN Tetra 垂直电泳槽（用于小型预制胶），含 Mini Trans-Blot 模块和 PowerPac Basic 电源	Bio-Rad	1658034
4–15% Mini-PROTEAN TGX 预制蛋白凝胶	Bio-Rad	4561083
ChemiDoc XRS+ 系统	Bio-Rad	1708265
I-Glove	BioSpherix	I-Glove
Synergy HTX 多功能微孔板读板仪	BioTek	BTS1LFTA
Costar 5 mL Stripette 移液管	Corning	4487
Costar 10 mL Stripette 移液管	Corning	4488
Costar 25 mL Stripette 移液管	Corning	4251
Corning 96 孔透明底黑色聚苯乙烯微孔板	Corning	3631
15 mL 高透明度聚丙烯锥形离心管	Corning	352095
小型细胞刮刀	Corning	3010
Gilson Pipetman L 四通道移液器套装	Gilson	F167370	P2、P20、P200、P1000 及配件
1.5 mL 聚丙烯微量离心管	Greiner Bio-One	616201
PIPETBOY acu 2 移液器	INTEGRA Biosciences	155 000
Justrite 易燃液体储存柜	Justrite Manufacturing Co.	896000
涡旋混合器	Labnet	S0200
CO2 培养箱	NuAire	NU-5820
轨道摇床	Stuart	SSL1
SB3 试管旋转器	Stuart	SB3
MicroCL 21R 微型离心机	Thermo Fisher Scientific	75002470
Sorvall ST 16 离心机	Thermo Fisher Scientific	75004240
组织培养皿 (100 mm)	Thermo Fisher Scientific	150350
Slide-A-Lyzer MINI 透析装置	Thermo Fisher Scientific	69580	10K 分子量截留，0.1 mL
0.1 mL Slide-A-Lyzer MINI 透析装置用浮标	Thermo Fisher Scientific	69588
LSE 数字干浴加热器	Thermo Fisher Scientific	1168H25
Thermo Scientific 1300 系列 A2 级 II 型 A2 生物安全柜	Thermo Fisher Scientific	13-261-308
软件
Image Lab 软件	Bio-Rad	1709691