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使用缺氧条件下培养的细胞中内源性核蛋白进行免疫共沉淀实验

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DOI：

10.3791/57836

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2018年8月2日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Lee Kong Chian School of Medicine, Nanyang Technological University, 2Singapore Eye Research Institute (SERI), Singapore General Hospital, 3The Rolf Luft Research Center for Diabetes and Endocrinology, Karolinska Institutet, Karolinska University Hospital, 4Cancer and Stem Cell Biology Program, Duke-NUS Medical School, 5Department of Cell and Molecular Biology, Karolinska Institutet

本文内容

摘要

本文介绍了一种共免疫沉淀实验方案，用于研究缺氧条件下内源性核蛋白之间的蛋白质-蛋白质相互作用。该方法适用于验证转录因子与转录共调节因子在缺氧状态下的相互作用。

摘要

低氧水平（缺氧）会引发多种适应性反应，其中缺氧诱导因子1（HIF-1）复合物作为主调控因子发挥作用。HIF-1由一个受氧气调控的α亚基（HIF-1α）和一个组成型表达的β亚基（HIF-1β）组成，后者也称为芳香烃受体核转位蛋白（ARNT），可调控参与血管生成、促红细胞生成和糖酵解等多种生物学过程的基因。鉴定与HIF-1相互作用的蛋白质对于理解缺氧信号通路至关重要。除了对HIF-1α稳定性的调控外，缺氧还会触发包括HIF-1α和ARNT在内的多种转录因子向细胞核的转位。值得注意的是，目前用于研究此类蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs）的方法大多基于通过蛋白质过表达人为提高蛋白水平的系统。蛋白质过表达常常导致因时空异常而产生的非生理结果。本文描述了一种经改良的共免疫沉淀实验流程，该流程在缺氧处理后使用内源性核蛋白，并以概念验证的方式展示HIF-1α与ARNT之间的相互作用。在本方案中，细胞在缺氧条件下收集，且所用杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）洗涤缓冲液也预先平衡至缺氧条件，以避免再氧合过程中发生蛋白质降解或蛋白复合物解离。此外，随后提取细胞核组分以富集并稳定内源性核蛋白，避免蛋白质过表达时常出现的假阳性结果。该方案可用于展示在缺氧条件下转录因子与转录共调节因子之间的内源性和天然相互作用。

引言

当身体的细胞和组织供氧不足时，便会发生缺氧。缺氧在多种生理和病理过程中发挥关键作用，例如干细胞分化、炎症和癌症1,2。缺氧诱导因子（HIFs）以异源二聚体形式发挥作用，由一个受氧调控的α亚基和一个组成型表达的β亚基（也称为ARNT）构成3。迄今为止已鉴定出三种HIF-α亚基亚型（HIF-1α、HIF-2α和HIF-3α）以及三种HIF-β亚基（ARNT/HIF-1β、ARNT2和ARNT3）。HIF-1α和ARNT广泛表达，而HIF-2α、HIF-3α、ARNT2和ARNT3的表达模式则更为局限4。HIF-1蛋白复合物是缺氧反应的关键调控因子。在缺氧条件下，HIF-1α趋于稳定，随后转入细胞核并与ARNT形成二聚体5。接着，该复合物结合到特定的核苷酸序列——即所谓的缺氧反应元件（HREs）——并调控参与血管生成、红细胞生成和糖酵解等多种过程的靶基因表达6。除了这种"经典"反应外，缺氧信号通路还被证实与多个细胞应答信号通路存在交叉对话，例如Notch通路和核因子-κB（NF-κB）通路7,8,9。

鉴定新的HIF-1相互作用蛋白对于深入理解缺氧信号通路具有重要意义。与对氧水平不敏感且组成性表达的ARNT不同，HIF-1α蛋白的水平受到细胞氧浓度的严格调控。在常氧条件（21%氧气）下，HIF-1α蛋白会迅速降解10,11。HIF-1α在常氧下的短半衰期为从细胞提取物中检测该蛋白以及鉴定HIF-1α相互作用蛋白带来了特定的技术挑战。此外，包括HIF-1复合物在内的多种转录因子在缺氧条件下会转入细胞核12,13,14。目前用于蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）研究的大多数方法依赖于非生理性的蛋白过表达。已有报道指出，蛋白过表达可能通过多种机制引发不同的细胞缺陷，包括资源超载、化学计量失衡、非特异性相互作用以及信号通路的调控改变15,16。就PPI研究而言，蛋白过表达可能导致假阳性，甚至假阴性结果，具体取决于过表达蛋白的性质和功能。因此，现有的PPI研究方法需要进行改进，以揭示在缺氧条件下具有生理相关性的蛋白质相互作用。我们此前已在缺氧的P19细胞中证实了HIF-1与Ets家族转录因子GA结合蛋白（GABP）之间的相互作用，该作用参与了Hes1启动子对缺氧的响应17。在此，我们描述了一种在缺氧条件下研究内源性核蛋白之间相互作用的共免疫沉淀实验方案。以HIF-1α与ARNT之间的相互作用作为概念验证示例。该方案适用于在缺氧条件下展示转录因子与转录共调节因子之间的相互作用，不仅限于HIF-1相互作用蛋白的鉴定。

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方案

本实验方案使用人胚胎肾293A（HEK293A）细胞，遵循新加坡南洋理工大学人类研究伦理委员会的指导方针。

1. 在 HEK293A 细胞中诱导缺氧

  1. 准备四个 10 cm 培养皿，每皿接种 3–5 × 106 个 HEK293A 细胞，加入 10 mL 添加了 10% 胎牛血清（FBS）、2 mM L-谷氨酰胺、110 mg/L 丙酮酸钠、100 U/mL 青霉素和 100 mg/mL 链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM，4.5 g/L 葡萄糖）。将细胞置于 37 °C、5% CO2 的培养箱中培养。
    注意：细胞接种操作应在生物安全柜（BSC）中进行。所有放入生物安全柜的物品表面均需用 70% 乙醇擦拭。
  2. 接种后 24 小时，当细胞融合度达到 80–90% 时，将其中两个培养皿放入培养箱手套箱内的低氧亚室（见材料表），设置条件为 1% O2、5% CO2、37 °C；另两个培养皿保持常氧条件（21% O2、5% CO2、37 °C）培养 4 小时。使用一组常氧和低氧处理的细胞通过蛋白质印迹法评估低氧处理效果，另一组细胞用于共免疫沉淀实验。
    注意：氧气浓度可设定在 0–5% 范围内，低氧处理时间可根据细胞类型和研究目的进行调整。

2. 全细胞与核提取

注意：有关本方案中所用缓冲液的信息，请参见表1。

  1. 收获常氧对照组细胞。
    1. 用10 mL移液管吸取弃去培养基，并用10 mL DPBS（pH 7.0–7.2）冲洗细胞。
      注意：避免移液管接触细胞单层。洗涤时，沿细胞培养板壁轻轻加入DPBS，以避免细胞脱落。
    2. 用移液器将5 mL预冷的DPBS加入培养板中，然后在预冷的PBS中用细胞刮将细胞从培养板表面刮下。
    3. 将细胞悬液转移至15 mL锥形管中，置于冰上保存。
  2. 收集在低氧条件下培养的细胞。
    1. 将未加盖的DPBS置于缺氧条件下预平衡 100 mL 实验玻璃试剂瓶，内装 DPBS，置于低氧亚室（1% O₂）中2 和5% CO₂2 在37 °C下提前孵育24小时。
    2. 在收获经低氧处理的细胞前约1小时，将装有冰块的冰盒放入已平衡至1% O₂的手套箱操作腔内2 和5% CO2将装有预先平衡的低氧 DPBS 的瓶子从低氧亚室转移至处理室，并置于冰上。
    3. 缺氧处理4小时后，将细胞从缺氧亚室转移至已预平衡至1% O₂的处理室2 和5% CO₂2.
    4. 用10 mL移液管吸取去除培养基，再用10 mL预冷并预平衡的缺氧DPBS冲洗细胞一次。
    5. 用5 mL移液管加入5 mL预冷的预平衡DPBS，用细胞刮轻轻刮取使细胞脱落。
    6. 倾斜培养板，用10 mL移液管收集脱落的细胞。将DPBS中的细胞悬液转移至15 mL锥形管中，置于冰上保存。
    7. 打开已在1% O2和5% CO条件下预平衡的手套箱处理室与缓冲室之间的门2将装有经缺氧处理细胞的15 mL锥形管（置于冰上）从操作舱转移至缓冲舱。打开缓冲舱门，将细胞完全移出手套箱。
  3. 将2.1中的常氧细胞和2.2中的缺氧细胞通过离心在1,000 x g下收集沉淀 g 4 °C下离心5分钟。
  4. 制备全细胞提取物。
    1. 将细胞沉淀重悬于 500 µL 冰冷的放射免疫沉淀分析（RIPA）裂解缓冲液中，缓冲液含 50 mM 三（羟甲基）氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl）（pH 8.0）、150 mM 氯化钠（NaCl）、1% Tergitol 型 NP-40（NP-40）、0.5% 脱氧胆酸钠和 0.1% 十二烷基硫酸钠（SDS），并添加 1× 蛋白酶抑制剂混合物（见 材料表通过反复吹打细胞沉淀数次。
    2. 将细胞裂解液转移至新的1.5 mL离心管中，冰上孵育30分钟，期间偶尔涡旋振荡。
    3. 将细胞裂解液在13,000 x g 4 °C 下离心 10 分钟。
    4. 收集上清液，将50 µL上清液分装至1.5 mL微量离心管中，于-80 °C保存。
  5. 使用核提取试剂盒制备核提取物（见材料表）。
    1. 轻轻吹打细胞沉淀数次，用500 µL裂解缓冲液NL重悬细胞沉淀，裂解缓冲液NL中需添加1x蛋白酶抑制剂混合物和0.1 M二硫苏糖醇（DTT）。
    2. 加入25 µL NP去垢剂溶液至细胞悬液中，最大速度涡旋振荡10秒。
    3. 在 10,000 x g 条件下离心 g 4 °C下离心5分钟。
    4. 收集上清液（胞质提取物），将50 µL上清液分装至1.5 mL微量离心管中，于-80 °C保存。
    5. 将含有细胞核的沉淀重悬于500 µL裂解缓冲液NL中，缓冲液中需添加1×蛋白酶抑制剂混合物和0.1 M DTT，涡旋振荡5秒（最高速度）。
    6. 以 10,000 x g 离心 g 4 °C下离心5分钟，保留核沉淀。
    7. 将细胞核沉淀重悬于50 µL含有1×蛋白酶抑制剂混合液的提取缓冲液NX1中，通过反复吹打数次使沉淀充分悬浮。
    8. 冰上孵育30分钟，每5分钟以最大速度涡旋振荡10秒。
    9. 以 12,000 x g 离心 g 4 °C 下离心 10 分钟。
  6. 对核提取物进行脱盐处理。
    1. 收集步骤 2.5.9 的上清液，转移至微型透析装置中，每单位最大体积为 100 µL。
    2. 盖上微型透析装置的盖子，并将其放入浮力装置中。
    3. 将浮力装置放入含有500 mL预冷透析缓冲液（20 mM Tris-HCl pH 7.4、20%甘油、100 mM氯化钾（KCl）、0.2 mM乙二胺四乙酸（EDTA）、0.2 mM苯甲基磺酰氟（PMSF）和0.5 mM DTT）的烧杯中，在4 °C下轻轻搅拌孵育30分钟。
      注意：PMSF 具有危险性。避免与皮肤直接接触或吸入。
    4. 从微型透析装置的角落收集样品，并转移至新的1.5 mL微量离心管中。
    5. 以 12,000 x g 离心 g 4 °C下孵育10分钟，将每份上清液25 µL分装至1.5 mL微量离心管中，于-80 °C保存。

3. 通过检测 HIF-1α 蛋白表达及亚细胞定位评估缺氧处理效果

  1. 根据制造商说明书，使用二辛可宁酸（BCA）蛋白质检测试剂盒的微孔板法测定全细胞或核/胞质提取物的蛋白质浓度18。
  2. 将细胞裂解液用含5% 2-巯基乙醇的1× Laemmli上样缓冲液稀释，并在95 °C下煮沸5分钟。
    注意：切勿触碰加热块表面，以免造成烫伤。
  3. 通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白质。
    1. 将等量蛋白质（25 µg）加入SDS-PAGE预制梯度凝胶（4–20%）的每个加样孔中，同时加入3 µL分子量标记物。
    2. 在含有2.5 mM Tris、19.2 mM甘氨酸、0.01% SDS、pH 8.3的电泳缓冲液中，以200 V电压运行30分钟。
  4. 将凝胶中的蛋白质转移至硝酸纤维素膜。
    1. 组装转膜“三明治”结构（滤纸-凝胶-膜-滤纸），将凝胶置于夹具阳极侧，膜置于阴极侧。
    2. 将夹具放入装有转膜缓冲液的转膜槽中，转膜缓冲液含2.5 mM三羟甲基氨基甲烷（Tris）、19.2 mM甘氨酸和20%甲醇。
      注意：甲醇易燃，应储存在易燃液体储存柜中。
    3. 在4 °C冷室中以100 V电压进行转膜1小时。
  5. 在摇床上，用10 mL封闭缓冲液（含50 mM Tris-Cl（pH 7.6）、150 mM NaCl、0.1% Tween 20和5%脱脂奶粉）室温封闭膜1小时。
  6. 在相同的封闭缓冲液中，加入抗HIF-1α抗体（1/500稀释）于4 °C孵育过夜。
  7. 用50 mL TBS-T缓冲液洗涤膜3次，每次5分钟。
  8. 在含5%脱脂奶粉的10 mL TBS-T缓冲液中，加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗（1/1,000稀释），室温孵育1小时。
  9. 用50 mL TBS-T缓冲液洗涤膜3次，每次5分钟。
  10. 在1.5 mL微量离心管中，各取500 µL增强型化学发光（ECL）试剂A和B，短暂涡旋混匀。
  11. 将ECL底物加至膜上，室温孵育1分钟。
  12. 使用基于CCD相机的成像系统捕获化学发光信号。
    1. 用纸巾轻触膜边缘以去除多余的ECL底物，然后将膜放入透明保护膜中。
    2. 将膜放置在基于CCD相机的成像系统的样品托盘上。
    3. 启动图像处理软件（见材料表），按以下设置采集图像：文件 → 新建方案 → 单通道 → 方案设置 → 凝胶成像（应用：Chemi；成像区域：Bio-Rad Ready gel；成像曝光：软件将自动优化强条带的曝光时间）→ 运行方案
      注意：可手动设置曝光时间以获得最佳图像。

4. 免疫沉淀及免疫沉淀蛋白的检测

  1. 在1.5 mL微量离心管中，用500 µL TBS缓冲液洗涤50 µL蛋白A/G Sepharose微珠，并在4 °C下以3,000 × g离心2分钟，使微珠沉淀。
  2. 弃去上清液，将微珠重悬于100 µL TBS缓冲液中。
  3. 加入2 µL小鼠单克隆抗ARNT抗体（1.4 mg/mL）或小鼠免疫球蛋白G（IgG）（1.4 mg/mL），后者通过将0.7 mg小鼠IgG溶于500 µL TBS缓冲液中配制而成。
  4. 将含有微珠的1.5 mL微量离心管置于旋转混合仪中，在4 °C下以10 rpm转速孵育2小时。
    注意：操作时应轻柔处理管体，并保持微珠悬液始终位于管底。
  5. 在4 °C下以3,000 × g离心2分钟使微珠沉淀，弃去上清液。
  6. 将步骤2.6.5中获得的200 µg核蛋白裂解液加入800 µL免疫沉淀（IP）缓冲液中进行稀释，IP缓冲液组成为：50 mM Tris-HCl（pH 7.4）、180 mM NaCl、20%甘油、0.2% NP-40和1×蛋白酶抑制剂混合物。将裂解液与步骤4.5中获得的抗体偶联微珠在4 °C下孵育过夜。
  7. 在4 °C下以3,000 × g离心2分钟使微珠沉淀，弃去上清液，并用1 mL预冷的含0.2% NP-40的TBS缓冲液洗涤微珠3次。
  8. 在50 µL Laemmli上样缓冲液中95 °C煮沸微珠5分钟。
  9. 在4 °C下以10,000 × g离心5分钟，收集上清液，弃去微珠。
    注意：上清液可短期储存于4 °C，或长期储存于-20 °C。
  10. 通过Western blot检测免疫沉淀所得蛋白复合物中HIF-1α的存在，具体操作参照步骤3.3及后续步骤所述方法。
    注意：本步骤无需进行蛋白定量。将每份样品的全部上清液体积（50 µL）上样至SDS-PAGE预制梯度胶（4–20%）的每个加样孔中。

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结果

为评估细胞对缺氧的反应，检测了缺氧处理后HIF-1复合物各组分的表达水平及其亚细胞定位。将HEK293A细胞在缺氧条件下培养4小时，或在常氧条件下培养作为对照。通过Western blot检测全细胞裂解物或核/胞质提取物中HIF-1α和ARNT蛋白的表达水平。结果表明，总HIF-1α水平在缺氧条件下上调，而总细胞裂解物中ARNT的表达水平无明显变化（图1A）。此外，缺氧诱导了HIF-1α和ARNT在HEK293A细胞核中的聚集（图1B），该结果与既往报道一致，尽管在部分检测的细胞系中未观察到ARNT的胞质表达19。

接下来，我们证明了缺氧处理后HIF-1α与ARNT之间的相互作用。从在常氧或低氧条件下暴露4小时的HEK293A细胞中制备核提取物，并使用这些核提取物进行共免疫沉淀实验。如<...

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讨论

HIF-1 复合物是细胞氧稳态的主要调控因子，可调控大量参与细胞低氧适应性反应的基因。鉴定新的 HIF-1 相互作用蛋白对于理解低氧信号转导机制具有重要意义。共免疫沉淀实验常用于蛋白质相互作用（PPI）研究，以阐明细胞内的信号转导通路。然而，目前仍广泛使用蛋白过表达方法，这可能导致实验假象。此外，HIF-1α 是一种高度不稳定的蛋白，在复氧过程中会迅速降解11。同时，低氧可触发大多数哺乳动物细胞系中 HIF-1 组分向细胞核的转位。因此，传统的共免疫沉淀方案需要优化，以便在低氧处理后鉴定出具有生理相关性的 HIF-1 相互作用蛋白。本文描述了一种改良的共免疫沉淀实验方案，用于证明低氧条件下 HIF-1α 与 ARNT 之间的相互作用。

为避免复氧过程中HIF-1α的降解，低氧细胞在培养箱手套箱的处理室中收集，该处理室已预先平衡至低氧条件。DPBS洗涤缓冲液在使用前也已平衡至低氧条件。若无可用的低氧工作站进行处理，可使用预先平衡至低氧条件的DPBS洗涤低氧细胞，随后迅速在冰上收集。考虑到低氧可诱导HIF-1组分的核转位，且蛋白过表达可能...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

感谢黄新忠副教授提供缺氧工作站的使用。本工作获得以下机构的支持：新加坡教育部（MOE 1T1-02/04 和 MOE2015-T2-2-087，资助对象：Y.A.），南洋理工大学李光前医学院启动基金 M4230003（资助对象：P.O.B.），瑞典研究理事会，Erling-Persson 家族基金会，诺和诺德基金会，Jochnick 基金会，瑞典糖尿病协会，Scandia 保险公司，糖尿病研究与健康基金会，Berth von Kantzow 基金会，卡罗林斯卡学院糖尿病战略研究计划，欧洲研究理事会（ERC-2013-AdG 338936-Betalmage），以及克努特和爱丽丝·瓦伦堡基金会。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
材料
1.0 M Tris-HCl 缓冲液，pH 7.4 1st BASE1415
Protein A/G Sepharose 珠Abcamab193262
天然小鼠 IgG 蛋白Abcamab198772
EDTABio-Rad1610729
2x Laemmli 样品缓冲液Bio-Rad1610737
2-巯基乙醇Bio-Rad1610710
硝酸纤维素膜   Bio-Rad1620112
印迹级封闭剂Bio-Rad1706404用于 Western 印迹应用的脱脂奶粉
10x Tris 缓冲盐水 (TBS)Bio-Rad1706435
10% Tween 20Bio-Rad1610781
10x Tris/甘氨酸/SDSBio-Rad1610732
10x Tris/甘氨酸缓冲液 Bio-Rad1610771
Precision Plus Protein 双色标准品Bio-Rad1610374
抗兔 IgG，HRP 标记抗体Cell Signaling7074
抗小鼠 IgG，HRP 标记抗体 Cell Signaling7076
SignalFire ECL 试剂Cell Signaling6883
杜氏磷酸盐缓冲液Corning21-030-CV
苯甲基磺酰氟 (PMSF)Merck Millipore52332
ARNT/HIF-1 beta 抗体 Novus BiologicalsNB100-124 浓度：1.4 mg/mL
HIF-1 alpha 抗体Novus BiologicalsNB100-479浓度：1.0 mg/mL
YY1 抗体Novus BiologicalsNBP1-46218浓度：0.2 mg/mL
Qproteome 核蛋白提取试剂盒Qiagen37582裂解缓冲液 NL 和提取缓冲液 NX1 随试剂盒提供
GAPDH 抗体Santa Cruzsc-47724浓度：0.2 mg/mL
甘油 (≥99%)SigmaG5516
氯化钾SigmaP9541
RIPA 缓冲液SigmaR0278
氯化钠 (NaCl)Sigma71376
NP-40Sigma127087-87-0
Dulbecco’s 改良 Eagle’s 培养基 (DMEM, 4.5 g/L 葡萄糖)Thermo Fisher Scientific11995065
二硫苏糖醇 (DTT)Thermo Fisher ScientificR0861
胎牛血清Thermo Fisher Scientific10270106
HEK293A 细胞系Thermo Fisher ScientificR70507
甲醇 Thermo Fisher Scientific67-56-1
青霉素-链霉素Thermo Fisher Scientific15140122
Pierce 蛋白酶抑制剂片剂 Thermo Fisher Scientific88660
Pierce BCA 蛋白定量试剂盒Thermo Fisher Scientific23225
QSP 凝胶加样吸头 Thermo Fisher ScientificQSP#010-R204-Q-PK1-200 uL
设备/仪器
厚型印迹滤纸，预裁，7.5 x 10 cmBio-Rad1703932
Mini-PROTEAN Tetra 垂直电泳槽（用于小型预制胶），含 Mini Trans-Blot 模块和 PowerPac Basic 电源Bio-Rad1658034
4–15% Mini-PROTEAN TGX 预制蛋白凝胶Bio-Rad4561083
ChemiDoc XRS+ 系统Bio-Rad1708265
I-GloveBioSpherixI-Glove
Synergy HTX 多功能微孔板读板仪 BioTekBTS1LFTA
Costar 5 mL Stripette 移液管Corning4487
Costar 10 mL Stripette 移液管Corning4488
Costar 25 mL Stripette 移液管Corning4251
Corning 96 孔透明底黑色聚苯乙烯微孔板Corning3631
15 mL 高透明度聚丙烯锥形离心管Corning352095
小型细胞刮刀Corning3010
Gilson Pipetman L 四通道移液器套装 GilsonF167370P2、P20、P200、P1000 及配件
1.5 mL 聚丙烯微量离心管Greiner Bio-One 616201
PIPETBOY acu 2 移液器INTEGRA Biosciences155 000 
Justrite 易燃液体储存柜Justrite Manufacturing Co.896000
涡旋混合器LabnetS0200
CO2 培养箱NuAireNU-5820
轨道摇床StuartSSL1
SB3 试管旋转器StuartSB3
MicroCL 21R 微型离心机Thermo Fisher Scientific75002470
Sorvall ST 16 离心机Thermo Fisher Scientific75004240
组织培养皿 (100 mm)Thermo Fisher Scientific150350
Slide-A-Lyzer MINI 透析装置Thermo Fisher Scientific6958010K 分子量截留，0.1 mL
0.1 mL Slide-A-Lyzer MINI 透析装置用浮标Thermo Fisher Scientific69588
LSE 数字干浴加热器Thermo Fisher Scientific1168H25
Thermo Scientific 1300 系列 A2 级 II 型 A2 生物安全柜Thermo Fisher Scientific13-261-308
软件
Image Lab 软件Bio-Rad1709691

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HIF 1 ARNT Protein AG Sepharose Beads Laemmli

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