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方法文章

外周相关蛋白在质膜上的分配测定

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⸱

DOI：

10.3791/57837

⸱

2018年6月15日

 ,  , 
1Department of Experimental Plant Biology, Faculty of Science, Charles University

本文内容

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摘要

本文介绍了一种对荧光标记的外周相关蛋白在细胞质膜上结合水平进行定量分析的实验方案。该方法基于对用质膜荧光标记物标记的细胞中所观察到的信号进行膜相与胞质相的计算分解。

摘要

该方法通过分析跨质膜的荧光强度分布，快速测定任何荧光标记的外周相关蛋白在质膜上的分布情况。通过一个沿细胞边缘垂直方向施加的、用于拟合膜和细胞质荧光分布的模型，对实测的荧光强度分布进行拟合。该模型基于表达细胞质荧光标记物并用FM 4-64标记质膜的参考细胞中的荧光强度值构建而成。该方法可应用于多种细胞类型和生物体；但仅适用于评估非相邻细胞的质膜。这种基于显微镜的快速方法适用于需要定量检测质膜相关标记物细微且动态变化的实验，例如蛋白质突变体分析、抑制剂处理以及信号转导观察。该方法已实现为一个跨平台的R软件包，并与一个ImageJ宏相结合，提供用户友好的操作界面。

引言

外周相关质膜蛋白是细胞信号通路的关键组分。其基本功能之一是可逆地与质膜结合与解离，这一过程在质膜与细胞质之间的信号转导中具有重要作用。外周相关质膜蛋白可通过脂质锚定（如N-豆蔻酰化、S-酰化或异戊二烯化）或脂质结合结构域（与磷脂酰肌醇磷酸、磷脂酸相互作用）附着于质膜。 等等。).

这些蛋白质的质膜结合特性可被检测 体内, 例如，当荧光标记蛋白的关键氨基酸位点经定点突变修饰，或经影响脂质信号通路的不同抑制剂处理时。外周质膜蛋白的分布通常以定性方式评估，尤其在蛋白重新分布现象明显的情况下。本文所述方法适用于蛋白重新分布仅为部分发生、且需进行定量评估的情形。一种常用方法是通过共聚焦激光扫描显微镜图像，将质膜区域与细胞质区域的荧光强度比值作为质膜结合程度的指标1,2，方法简单，但不够准确。由于所用荧光显微技术及光学元件的光衍射特性，细胞膜上的荧光强度反映了细胞膜与细胞质信号的叠加。3因此，细胞质信号也被包含在膜区域中。基于这一原因，FM 4-64 染色模式不能用作膜信号选择的掩膜4此外，由于膜信号与细胞质组分的叠加，基于FM 4-64染色最大值位置对膜信号进行的简单测量总会系统性高估外周相关膜蛋白的真实质膜信号。荧光标记的外周相关蛋白信号的最大值也并不与质膜标记物的最大值共定位。即，FM 4-64 染料），但其定位向细胞质偏移。另一个局限性在于，由于光的衍射具有波长依赖性，FM 4-64 的发射峰相较于绿色荧光蛋白（如 GFP）的发射峰更宽3.

在本方法中，通过两个经验函数分别拟合标记蛋白信号，这两个函数描述了质膜和细胞质信号的假设分布。该信号分解应用于线性荧光轮廓，这些轮廓在原始图像中垂直于细胞表面的质膜方向获取，原始图像为表达荧光标记蛋白并用FM 4-64染料染色的细胞的常规双通道共聚焦切片图像。

用于拟合的第一个函数描述了细胞边缘胞质信号的衍射。该函数来源于先前获取的荧光轮廓，这些轮廓是在表达细胞质蛋白标记物的细胞中测得的，该标记物使用与质膜外周相关目标蛋白相同的发色团进行标记。描述质膜信号衍射的第二个函数则来源于FM 4-64的荧光信号。该信号首先用高斯函数进行近似，以对点光源的光衍射进行初步建模。其次，将此模型（适用于红色FM 4-64发射）通过数学变换转化为适用于质膜上外周相关目标蛋白所用发色团发射波长的形式。两个函数分别通过对FM 4-64信号和胞质蛋白信号最高值的10%取平均后的最大强度进行归一化处理。通过这种信号分解（非线性最小二乘拟合方法），可简便而准确地估算目标蛋白在质膜与胞质中的比例。计算得到的分配系数的真实物理量纲为微米级别，因为该系数比较的是胞质内的体积浓度与质膜上的表面浓度。它定义了从质膜到胞质的距离，在该距离范围内局部化的蛋白量等于相邻质膜区域中的蛋白量。该数值等同于先前引入的分配系数K25。该方法非常快速，仅需使用常规共聚焦激光扫描显微镜获取单张共聚焦切片，且对计算资源要求较低。分析核心已实现为一个便携式的R软件包，同时编写了一个附加的ImageJ宏，以提供图形用户界面，使用户可通过直观的对话框运行分析。相关软件及该方法的更详细描述（此前已发表6）可访问http://kfrserver.natur.cuni.cz/lide/vosolsob/Peripheral/获取。

该方法适用于分离的细胞、原生质体和组织，其中单个细胞的质膜清晰可辨，并表达被检测的外周相关蛋白的荧光标记构建体。所用发色团必须与FM 4-64染色兼容。FM 4-64发射红色荧光，因此被检测蛋白可通过具有蓝色、绿色或黄色发射的荧光蛋白进行标记（例如，GFP、CFP、YFP）。建议对生物材料进行稳定转化，因为这有助于更少人为干扰且更可重复地观察蛋白分布。被检测蛋白需具有相对均一的细胞质分布。若蛋白定位于内质网或其他细胞内膜区室，则可能产生人为假象结果。

此外，用于比较的实验必须使用表达细胞质标记物的相同生物材料。细胞可通过游离染料（与用于外周蛋白标记的染料相同）进行转化， 例如，游离GFP）或通过标记的目的蛋白但其膜结合能力已被破坏。膜结合能力的破坏可通过例如切除膜结合结构域或对关键氨基酸残基进行定点突变来实现。例如N-豆蔻酰化、S-酰化或异戊二烯化位点 等等。).

对于共聚焦扫描显微镜观察，细胞必须用膜标记物（如FM 4-64染料）进行标记。如果FM 4-64染色不适用于所研究的材料（由于存在干扰性自发荧光、染料渗透不良等原因）， 等。），质膜可以通过与适当荧光染料（如mCherry、RFP）标记的整合型质膜蛋白进行标记， 等等。标记物在细胞内膜系统（内膜系统）中的定位必须可忽略不计。

若使用固定样品和抗体，可采用可固定类似物FM 4-64FX或针对适当靶标的抗体对质膜进行标记。在此情况下，必须非常谨慎地评估实验结果，因为固定步骤可能导致细胞质和质膜蛋白的选择性丢失。

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方案

1. 生物材料的制备

  1. 准备表达目标荧光标记蛋白的生物材料，以及一种细胞质标记物。请遵循引言中提到的操作步骤。

2. 共聚焦激光扫描显微镜

  1. 用FM 4-64染料对第1节中制备的材料进行染色7⁠。
    1. 采用适用于所研究材料的染色方案。对于烟草BY-2细胞，将200 μL细胞悬浮液与0.2 μL溶于二甲基亚砜中的10 mM FM 4-64溶液混合染色。
      注意：FM 4-64染料的典型染色浓度约为10 μM，使用溶于二甲基亚砜的10 mM储备液。应使用尽可能低的FM 4-64浓度以实现适当染色，并避免将细胞置于冰上孵育（FM 4-64与低温可能影响质膜特性）。染色后应立即进行共聚焦显微镜观察。染色与图像采集之间的间隔不应超过10分钟；否则，染料的内吞作用将影响FM 4-64的染色结果。
    2. 应连续处理多个样品，不要在实验开始时一次性完成所有样品的染色。
  2. 对每个细胞采集一个赤道面的共聚焦光学切片。
    1. 设置顺序双通道扫描，第一通道用于蛋白标签所用的发色团，第二通道用于FM 4-64。设置较高的光学分辨率（10–20 像素/μm）。示例设置：63倍油浸物镜，数值孔径NA 1.3，图像尺寸1,024 × 1,024像素。确保在所采集的图像中，质膜平面与共聚焦切片平面垂直。
    2. 每一样品至少采集20个细胞，以获得足够的数据用于统计分析（具体数量取决于所处理材料中信号的变异性）。

3. 所需软件安装

  1. 安装 Fiji ImageJ 发行版8⁠ 以及所需的宏外围工具。
    1. 从网站 https://fiji.sc/#download 下载软件，并通过解压进行安装。
    2. 在解压后的 “Fiji.app” 目录中，双击 “ImageJ(.exe)” 文件以启动 Fiji。
    3. 从以下网址下载宏 “peripheral”：
      http://kfrserver.natur.cuni.cz/lide/vosolsob/Peripheral/source/Peripheral_.ijm。
    4. 在 Fiji 中，从主菜单选择 Plugins | Macros | Install...，并指定已下载的 “Peripheral_.ijm” 文件路径。
      注意：安装后的宏 “peripheral” 将在 Fiji 工具栏中显示两个新工具：“Take profile Tool” 和 “Peripheral Protein Menu”。
  2. 安装 R-project 软件9⁠ 及所需软件包。
    1. 按照网站 https://cloud.r-project.org/ 上的说明安装 R-project。
      注意：整体分析将在 Fiji 中进行。R 软件仅在 Fiji 宏 “peripheral” 执行计算时被内部调用。
    2. 运行 R 图形用户界面（GUI），在主菜单中选择 Packages | Install package(s)... ，指定最近的镜像仓库，并安装 软件包 “ggplot2”。
      注意：也可在 R 命令行中输入：install.packages(“ggplot2”)。
    3. 从以下地址下载 R 软件包 peripheral：http://kfrserver.natur.cuni.cz/lide/vosolsob/Peripheral/source/peripheral_latest.tar.gz。通过选择 Packages | Install package(s) from local files... 进行安装。
      注意：也可仅在 R 命令行中输入以下命令：
      install.packages(“http://kfrserver.natur.cuni.cz/lide/vosolsob/Peripheral/source/peripheral_latest.tar.gz”, repo=NULL, type=“source”)。

4. 在 Fiji 中进行图像分析

  1. 处理细胞质标记物的共聚焦图像。
    1. 使用 Fiji 导入图像 插件 | Bio-Formats | Bio-Formats 导入器 使用默认设置从 Fiji 菜单中。
    2. 检查 Bio-Formats 导入器是否正确识别了图像标定。图像窗口左上角信息字段中显示的图像尺寸必须与原始图像尺寸一致。
    3. 对尺寸不正确的未正确校准图像进行单独处理， 例如，通过在对话窗口中设置正确的参数 分析 | 设置比例尺... 从 Fiji 菜单中：将图像宽度（以像素为单位）填入 像素距离 视野及相应长度单位下的实际宽度输入到 已知距离 领域。
      注意：如果 Leica LCS LEI 文件校准不正确，请执行步骤 4.2.1。
  2. 运行 导入选项宏 用于分析设置。通过以下三种方式之一激活宏：选择 插件 | 宏 | 导入选项 [f1] 在主 Fiji 菜单中，点击菜单工具后选择相同的项目 外周蛋白菜单，或按键盘快捷键 F1。在调用的宏对话框窗口中设置参数。
    1. 对于 Leica LCS LEI 格式的情况，进行求解 校准不当 通过激活 Leica.lei 图像 复选框。此选项可从扩展名为“lei”的文件中正确导入图像尺寸。
    2. 在字段中定义适当的值 高斯模糊半径（px）这会影响图像平滑和噪声降低。较低的值（1 px）已足够，且不会导致任何图像信息丢失。
    3. 在字段中设置一个值 剖面线宽度（px）较粗的线条会导致轮廓曲线的平滑程度更高。建议使用默认值 10 px。
    4. 设置图像标题 根据定义进行解析 样本分隔符 和 导出的项目。
      注意：图像标题（不含扩展名的文件名， 例如：“实验-1_行-02_细胞-11”）将根据该字段中列出的所有字符进行拆分 样本分隔符 (例如： “-_”) 拆分为一组可使用的项目（“Experiment”、“1”、“line”、“02”、“cell” 和 “11”），可用于 分组因素 （样本、细胞、株系或处理方式的标识）在后续分析中。通过输入其序号（第一个项目的序号为“0”）到该字段中，定义将使用哪些项目 导出的项目。 使用空格分隔格式 例如，“3 5。”在此示例中，项目“02”和“11”将被称为名为“Fac_0”和“Fac_1”的分组因子。此外，每次测量的标识将被称为“i”因子。
    5. 或者，保留 样本分隔符 清空并输入 0 到 导出的项目 如果可以保留完整的图像标题。
    6. 在 Windows 操作系统中，检查 R 软件的路径是否会在该字段中被正确自动检测 R.exe 的路径. 否则，请在系统中指定 R.exe 文件的完整路径（例如“C:\Program Files\R\bin\R.exe”
    7. 点击 好的. 在下一个对话窗口中检查标题解析，然后单击 好的 或 返回 重置。
      注意：所有图片将被自动平滑处理，并最终重新校准。所有导出的分组因子列表将在结果窗口中显示。
  3. 在处理后的图像中，沿质膜区域进行线性选择，并测量荧光强度分布。
    1. 选择 Fiji 工具 直线 从 Fiji 工具栏中选择。点击图像，并在质膜区域划一条线。该线必须起始于细胞外空间，且应垂直于质膜。选择皮层细胞质较厚且更均匀的区域。线性选择的最佳长度为 5 - 10 μm。
    2. 运行 取轮廓宏 通过类比方法（如步骤4.2中的快捷键“x”）或单击 取轮廓工具 在 Fiji 工具栏中。将自动测量两个通道的荧光轮廓，数据将在“结果”窗口中显示。
    3. 如果使用“x”键被认为不够友好，可打开宏源文件 外周_.ijm 在文本编辑器中，将行中的“x”符号替换为“macro” "获取轮廓 [x]" 用一个在 Fiji 环境中未被用作活动键盘快捷键的更合适的符号替换，并保存文件。重新安装宏（步骤 3.1.4），然后从图像导入开始重新启动分析。
    4. 根据个体信号的变异性，为每种细胞选取具有代表性的轮廓数量。
    5. 通过以下方式保存数据 文件 | 另存为…始终使用“csv”扩展名；这是确保数据格式正确的必要条件。
  4. 运行 绘图轮廓数据宏 （快捷键 F5）以图形化方式显示测量曲线。在弹出的宏对话框窗口中设置参数。
    1. 保留复选框 是否对输入数据使用过滤？ 未选择
    2. 指定是否应从该数据创建图表 最新数据 在结果窗口中，从一个 单个 CSV 文件 或 来自所有 CSV 文件 通过单击相应的单选按钮，在指定目录中。
      注意：如果图表由最近的结果生成，数据将首先被保存（另存为... 对话框将自动激活。
    3. 指定哪一个 分组因素 将通过选择相应的复选框来用于绘图。如果所有曲线应在独立的图中显示，请选择因子“i”；如果所有数据应在同一图中绘制，请不要选择任何复选框。
      警告：在绘图过程中选择处理结果中不存在的分组因子会导致错误。
    4. 指定 文件名 在野外保存图表时 输出文件前缀 并定义该图 图像尺寸 在文件中 高密度图 和 行宽.
      注意：生成的图表将作为 PNG 文件保存在源数据目录中。
    5. 选择 PDF 输出？ 如果可以生成额外的 PDF 输出，请勾选此框。
    6. 点击 好的指定在下一个对话框中保存结果的路径，或用于数据导入的路径。单击确认以开始分析 好的 在显示已执行 R 代码的对话窗口中。
      注意：图表将在新的图像窗口中打开，R 分析结果将显示在文本窗口中。
  5. 运行 轮廓过滤设置宏 （快捷键 F2），如果某些绘制的轮廓在细胞外空间（针对标记蛋白）或细胞内空间（针对 FM 4-64 信号）出现过强信号。随后，在弹出的宏对话框窗口中设置相应参数。
    注意：过滤功能可根据指定 x 坐标处允许的最大强度阈值，去除质量较差的谱图。
    1. 为每个通道，在文件中设置适当的强度阈值 移除具有过强细胞外（细胞内）信号的测量数据指定将在该字段中应用强度阈值的区域 x坐标较低（较高）的.
    2. 运行 绘图轮廓数据宏 （步骤 4.4）再次勾选复选框 是否对输入数据使用过滤？ 选择；确保所有异常谱型均已成功去除。否则，优化过滤参数（步骤 4.5.1）。
  6. 运行 创建模型宏 （快捷键 F3）根据校准数据创建质膜和细胞质荧光分布的模型。随后在弹出的宏对话框中设置参数。
    1. 指定是否应通过选择来过滤输入数据（步骤 4.5） 是否对输入数据使用过滤？ 复选框
    2. 指定 源数据 类比于步骤 4.4.2。
    3. 指定一个 间隔 根据定义的“start”、“end”和“step”值（单位：μm），模型将在该位置进行预测。
      注意：所有轮廓测量值均应大于指定间隔。
    4. 指定 荧光波长 激发和发射波长最大值，填入相应字段。将GFP和FM 4-64组合设为默认值。
      注： “GFP” 表示用于蛋白质标记的发色团（GFP、CFP、YFP、 等等。），而“FM4”表示用于细胞膜染色的发色团（通常为FM 4-64）。
    5. 指定 输出文件前缀 领域。该前缀将用于将生成的模型作为 RData 文件保存至源数据目录中。
    6. 选中复选框 绘制模型？ 如果需要图形输出，图表将被保存为 PNG 格式，同时也会保存为 PDF 文件。 PDF 输出？ 复选框已选中。
    7. 点击 好的在接下来的对话窗口中指定输入或输出路径，然后单击以确认分析 好的 在显示已执行 R 代码的对话窗口中。
      注意：外周相关蛋白荧光的模拟胞质和膜组分图将显示在新图像窗口中，R分析结果将列在文本窗口中。
  7. 处理表达目标蛋白的细胞图像。
    1. 参照第4.1步的方法类比导入图像。
    2. 参照第4.2步的方法进行分析设置。平滑处理和线宽应保持一致。
    3. 按照步骤4.3中的方法进行模拟测量。
    4. 通过绘图（步骤4.4）检查轮廓的准确性，并根据需要设置滤波（步骤4.5）。
  8. 运行 计算分布宏 （快捷键 F4）用于计算蛋白质在质膜与细胞质之间的分配。请按照调用的宏对话框窗口中的参数设置进行操作。
    1. 与前一步骤（步骤 4.4）类似，指定数据源、筛选条件和文件名前缀。
    2. 指定是否 模型 用于蛋白质分布计算的数据将从 上一次模型计算 在 Fiji 中最近使用的“Peripheral”宏（选中复选框） 近期结果），或来自 RData 文件 （勾选复选框） 从文件).
    3. 保留复选框 移除残余变异性大于的结果 若需进行结果筛选，则激活此选项。设定允许未被个体轮廓测量信号分解所解释的最大残余变异性的阈值。例如：设定值为 0.200 时，表示将舍弃那些未被解释的变异性超过轮廓中荧光强度总变异性的 20% 的所有测量数据。
    4. 选择 样本分组因素，可用于箱线图的绘制（步骤 4.4）。
    5. 激活复选框 PDF 输出？ 用于将箱线图保存为 PDF 文件。
    6. 点击 好的，指定输入或输出路径，然后单击以确认分析 好的 在显示已执行 R 代码的对话窗口中。
      注意：外周相关蛋白在质膜与细胞质之间的分配箱线图将在新图像窗口中显示，R 分析结果将在文本窗口中列出。
    7. 用于外部处理时，保存显示的结果 结果 通过窗口 文件 | 另存为... 在窗口菜单中。

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结果

DREPP10 是一种植物特有的、与质膜外周相关联的膜蛋白，通过N-肉豆蔻酰化修饰及与磷脂酰肌醇磷酸的静电相互作用锚定于质膜11,12DREPP 被描述为植物细胞中钙信号传导机制的一个组分，并且还与细胞骨架相互作用13,14在本实验中，野生型烟草 DREPP2 及其非豆蔻酰化突变体（Gly2 被 Ala 取代）均被 GFP 标记6 并在烟草BY-2悬浮细胞中表达15 在 CaMV 35S 启动子控制下16. 通过3日龄（稀释后3天）、FM 4-64标记的细胞测量这些蛋白质在质膜中的分区情况8 µM细胞培养6

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讨论

与基于荧光强度测量的其他方法相比，本文所述方法可更准确地估算外周相关蛋白在质膜上的分布情况5。该方法的主要改进在于考虑了光的衍射效应以及质膜信号与胞质信号的叠加。尽管该方法的结果与一种简单方法的结果具有相关性——后者通过比较膜位置处的荧光强度与平均胞质信号强度来评估（如先前研究所示6）——但这种新方法的主要优势在于能够确定信号分解无法解释的残差变异性，从而评估结果的可靠性，尤其适用于质膜信号低于胞质信号的情况。此外，由于蛋白分布的计算并非仅基于单个点，该方法对信号噪声也具有更强的鲁棒性。

分析仅需单张双通道共聚焦图像。与FRAP方法相比18 基于对蛋白质扩散动态在较长时间窗口内的测量，所述方法更适用于动态研究 体内 当快速图像采集是关键需求时的方法，例如信号转导研究、抑制性实验等）。该方法适用于快速获取足量数据，以进行统计学评估。

该方法仅限于单层膜...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本项目由捷克共和国教育、青年和体育部NPU I项目LO1417资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
FM 4-64ThermoFisher ScientificT13320细胞膜染料
二甲基亚砜Sigma-AldrichD4540 Sigma染料溶剂
常规设备（显微镜载玻片、移液器、枪头、离心管）细胞标记和显微镜观察用设备
共聚焦激光扫描显微镜
普通计算机

参考文献

  1. Barbosa, I. C. R., Shikata, H., Zourelidou, M., Heilmann, M., Heilmann, I., Schwechheimer, C. Phospholipid composition and a polybasic motif determine D6 PROTEIN KINASE polar association with the plasma membrane and tropic responses. Development. 143 (24), 4687-4700 (2016).
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重印与许可

勘误


Formal Correction: Erratum: Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins
Posted by JoVE Editors on 11/02/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins. The Affiliations section was updated.

One of the affiliations was updated from:

Department of Experimental Plant Biology, University of Science, Charles University

to:

Department of Experimental Plant Biology, Faculty of Science, Charles University

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荧光强度分布图共聚焦显微镜FM 4-64 染色ImageJ 宏R 软件包分析蛋白质胞质分布膜-胞质模型荧光分布拟合
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