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调控γ-氨基丁酸A型受体神经传递的新型化合物发现方法

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DOI：

10.3791/57842

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2018年8月16日

 ,  , 
1Discovery Neuroscience, Pharma Research and Early Development, Roche Innovation Center Basel, 2HiQScreen Sàrl 6

本文内容

摘要

本文介绍了从结合到生理学和药理学层面发现作用于GABAA受体的活性化合物的实验方案。

摘要

本文提供了一种针对γ-氨基丁酸A型（GABAA) 受体及其在临床前实验中用于鉴定新型活性分子的应用 体外 重组受体与其在啮齿类动物脑片中天然受体上的药理效应。对于作用于受体苯二氮䓬位点的化合物，第一步是建立初级筛选，包括在表达主要GABA受体的细胞膜上开发放射性配体结合实验。A 亚型。随后，利用啮齿类和人类GABA的异源表达A 受体在 非洲爪蟾 卵母细胞或HEK 293细胞中，可通过电生理实验研究不同受体亚型的生理特性以及所鉴定化合物的药理学特性。 非洲爪蟾 本文将介绍卵母细胞系统，内容从卵母细胞的分离及其显微注射不同mRNAs开始，到利用双电极电压钳进行药理学表征。最后，将描述在啮齿类动物脑片上进行的记录，该记录作为次级生理学检测手段，用于评估分子在其天然受体及明确神经环路中的活性。同时演示使用多神经元群体反应进行的细胞外记录及药物应用。

引言

本文介绍了针对 GABAA 受体活性化合物的发现方案，涵盖从结合到生理学与药理学的各个环节。在寻找特异性作用于 GABAA 受体的新分子时，至关重要的是尽可能精确地定义目标亚型，并评估新发现化合物的特异性（例如，综述见 Rudolph 和 Knoflach1 或 Sieghart2）。药物发现的典型路径及所需完成的步骤如图1所示。

结合实验长期以来一直是药物发现的第一步，并且至今仍被广泛使用。对于GABAA受体而言，这类实验经过优化，可用于鉴定能够结合到受体苯二氮䓬结合位点的化合物，该位点正是具有治疗价值且安全性良好的药物的作用部位。其他技术则采用基于荧光成像微孔板读数仪（FLIPR）的膜电位红色染料检测方法3，用于发现如巴比妥类药物等结合于其他附加位点的化合物，但由于这些位点常伴随不良副作用，因此并不理想。此外，所使用的染料可能直接激活GABAA受体，从而对这些实验在药物发现中的应用价值提出质疑4。结合实验仅能提供某一化合物可与特定受体类别结合的证据。体外实验利用细胞膜来鉴定选择性的人源GABAA α5β3γ2受体配体。通过瞬时转染表达人源GABAA α5β3γ2、α1β3γ2、α2β3γ2和α3β3γ2受体的HEK293细胞，制备实验所需的细胞膜。配体的作用通过检测膜受体上结合的[3H]氟马西尼的闪烁信号来测定（即对[3H]氟马西尼结合的抑制作用）。该技术的主要优势在于，能够快速、高效地测定化合物在目标受体上的结合亲和力。

功能研究对于评估化合物的功能活性，以及提出化合物与受体结合所引起机制的生理学和药理学解释至关重要。目前公认，功能性GABAA受体由五个亚基围绕离子孔道形成的假对称轴组装而成，也可由五个相同亚基组装形成。大多数GABAA受体由两种或更多不同的亚基组成。例如，大脑中主要的GABAA受体由α1、β2和γ2亚基构成，其化学计量比分别为2、2和15,6。在宿主系统（如Xenopus卵母细胞或HEK293细胞）中进行重组，可快速探索这些受体的药理学特性。

随后通过脑片细胞外记录来研究这些化合物的药理学特性7。该方法可用于探究化合物对神经传递的影响，并提供一种有效手段，以在神经元整体环境中，于天然受体水平上验证在异源表达系统中所确定的化合物功能效应。GABA能神经传递也可通过检测化合物对抑制性突触后电流（IPSCs）的影响，在分子水平上进行评估8。但此处所采用的基于脑片全细胞膜片钳记录的方案更为复杂，通量较低。

最后，该方法的优点与局限性 体外 讨论了用于鉴定α5β3γ2选择性配体的筛选级联，重点分析了不同技术及其内在局限性。本研究旨在为GABA领域的专家和非专家提供参考A 受体 不同组合的综合评述 体外 用于发现这些配体门控离子通道新调节剂的方法。

方案

Xenopus laevis 的饲养和操作遵循日内瓦州动物使用指南。

1. 放射性配体结合

  1. 检测板的制备
    1. 制备 1.5 L 测定缓冲液，含 5 mM KCl、1.25 mM CaCl₂、1.25 mM KH₂PO₄、1.25 mM MgSO₄、20 mM HEPES 和 10 mM 葡萄糖，用去离子水配制，pH 调至 7.4。2，1.25 mM MgCl2，120 mM NaCl 和 15 mM Tris；用 HCl 调节 pH 至 7.4。
    2. 制备待测化合物 50.76 µM (例如，一个 5 µL 10 mM 化合物至 980 µL 在微量离心管中加入缓冲液）。使用涡旋振荡器高速混合 2–5 秒。
    3. 用移液器吸取参考化合物氟马西尼，制备预稀释液 1 µL 化合物（10 mM）的 1,970 µL 加入检测缓冲液，使用涡旋振荡器高速混匀2–5秒。
    4. 稀释一种 [3H]flumazenil 储备液与测定缓冲液混合 4 °C 至50 mL聚丙烯管中的4 nM。
    5. 移液器 50 µL/well 将检测缓冲液加入96孔微孔板的第1列以及第3–11列，具体加样布局如图示微孔板布局所示 图2.
    6. 移液器 73.2 µL 化合物稀释后的 50.76 µM （参见步骤 1.1.2）加入到板的第 12 列。
    7. 使用几何级数将每种化合物稀释9个步骤（1E-10 – 1E-06 M），其中 23.12 µL 转移体积并填充第3至11列。充分混匀稀释液。每次稀释后更换移液枪头。
  2. 稀释细胞膜
    1. 解冻先前从过表达人GABA的HEK293细胞中分离得到的细胞膜A 受体（0.025–0.15 mg/mL）以获得80 mL室温（RT）溶液，并将该悬浮液转移至测定缓冲液中 4 °C.
    2. 将仍处于悬浮状态的膜溶液重新悬浮 4 °C 使用组织匀浆器在10,000–12,000 rpm条件下匀浆30–40秒。
  3. 为非特异性结合（NSB）对照稀释地西泮
    1. 将4 mM的安定（diazepam）储备液用检测缓冲液稀释至所需浓度 40 µM 在 5 mL 中。
  4. 开始反应
    1. 移液器 50 µL 4 nM [3将 [H]氟马西尼加入96孔板的每个孔中，并将其置于冰水容器中。
    2. 添加 100 µL GABA的A 受体亚型膜制备，使蛋白浓度为0.5 mg/mL。
    3. 移液器 50 µL 的 40 µM 地西泮加入第2列。
    4. 将培养板置于冰上孵育1小时。
    5. 添加 50 µL 在96孔滤板的每孔中加入适量的测定缓冲液，用于后续的膜分离和放射性测量，然后终止反应。
  5. 终止反应
    1. 使用 50 mM Tris-HCl（pH 7.4）配制洗涤缓冲液。
    2. 使用96孔细胞收集器过滤溶液。用缓冲液洗涤反应板3次 300 µL 每孔加入冰冷的洗涤缓冲液。
    3. 用塑料膜密封板的底部并加入 40 µL 每孔加入闪烁液用于液体闪烁计数，并用70%乙醇擦拭。
    4. 在室温下轻轻振荡平板至少1小时。然后在室温下静置至少另外1小时。
    5. 将培养板置于闪烁计数器上，测定放射活性（单位：CPM），每孔计数3分钟。
  6. 数据分析
    1. 测定8个非特异性结合（NSB）重复孔以及总结合（TB）的均值，同时测定各样品的双复孔或三复孔的均值。根据以下公式计算各样品均值的特异性结合百分比（%SB）：
      figure-protocol-1
      此处，
      总SB = 平均结核病数减去 平均非特异性结合.
    2. 横坐标绘制 % SB 与 按抑制剂浓度排序。使用单一位点竞争分析方程拟合数据：
      figure-protocol-2
      此处，
      y = SB 的百分比，
      A = 最小值 y,
      B = 最大值 y,
      C = IC50,
      X = 日志10 竞争化合物的浓度
      D 曲线的斜率（Hill 系数）。
    3. 使用半数抑制浓度（IC₅₀）计算结合亲和力（Ki）50)，[的解离常数（Kd）3H]氟马西尼在相应膜上的作用9，以及[3根据以下数据使用公式测定 [H]氟马西尼
      figure-protocol-3

2. 受体表达与记录 爪蟾属 卵母细胞

  1. 卵巢采集与卵母细胞制备
    1. 用 88 mM NaCl、1 mM KCl、2.4 mM NaHCO₃、0.82 mM NaH₂PO₄、1.3 mM CaCl₂、4.7 mM MgCl₂ 和 10 mM HEPES 配制无菌 Barth 溶液，调节 pH 至 7.43，10 mM HEPES，0.82 mM MgSO₄4.7H2O，0.33 mM Ca(NO3)2.4H2O 和 0.41 mM CaCl2.6H2O，在 pH 7.4 条件下，添加 100 单位/毫升青霉素 100 µg/mL 链霉素和 0.25 µg/mL 两性霉素B
    2. 制备1x OR2培养基（不含CaCl₂）2) 加入 88.5 mM NaCl、2.5 mM KCl、5 mM HEPES、1 mM MgCl2.6H2O，在 pH 7.4 条件下。
    3. 处死一只 非洲爪蟾 雌性个体在冷却的三卡因甲磺酸盐（浓度为150 mg/L，pH值调至7.4）与碳酸氢钠（300 mg/L）溶液中深度麻醉20分钟后，进行断头处死。
    4. 用洁净的剪刀和镊子迅速摘取卵巢，并置于两个盛有40 mL 1×Barth溶液及抗生素/抗真菌剂的培养皿（10 cm）中。
    5. 将未解离的卵巢置于 Barth 溶液中，在 4 °C.
    6. 对于解离，使用洁净的剃须刀片将卵巢切成小块（1–2 cm）3）并在不含 CaCl 的 50 mL OR2 培养基中孵育2 (OR2-无CaCl2) 加入0.2% I型胶原酶，在17–19 °C 在100 mL的旋转培养瓶中缓慢搅拌4–5小时。确认磁力搅拌子位于旋转培养瓶底部上方约3–5 cm处，以避免压碎卵母细胞。
    7. 孵育4–5小时后，验证大部分卵母细胞是否已从其滤泡中游离出来（即，它们会各自游动）。用200 mL添加了1.8 mM CaCl₂的OR2溶液清洗5次2.
    8. 将去滤泡的卵母细胞转移至含有Barth溶液及抗生素/抗真菌剂的培养皿（10 cm）中，至少在4°C下孵育过夜 17 °C 在cDNA或mRNA注射之前。
    9. 第二天，在体视显微镜下挑选一个动物极清晰分明的健康卵母细胞 与 植物极（动物极为深棕色） 与 植物极呈淡黄色。使用洁净的巴斯德吸管，将卵母细胞逐个转移至无菌的96孔锥形注射板中。
      注意：进行 mRNA 注射时，卵母细胞的放置无需特殊定位；而进行 cDNA 注射时，必须将卵母细胞调整方向，使动物极朝上。
  2. mRNA 或 cDNA 自动注射
    1. 使用市售试剂盒，按照推荐说明合成mRNA。用RNase清洁仪器和实验台，并佩戴适当的防护手套。
      注意：mRNA 的质量是获得良好表达的关键因素，且在注射过程中防止 mRNA 降解至关重要。
    2. 使用市售试剂盒制备 cDNA，并将所需量溶解于双蒸水中，使其浓度达到 0.2 µg/µL.
    3. 注射10–50 nL浓度为 0.2 µg/µL，或浓度在0.02–0.2 ng/μL范围内的cDNA溶液10 nL0.2 µg/µL，最好以95个卵母细胞为一批进行。
    4. 对于需要多个亚基的膜蛋白（即异源多聚体 α1β2γ2 GABAA 受体），按所需比例混合相应的mRNAs或cDNAs（即1:1:1 或 1:10:1
    5. 保持卵母细胞在 17 °C 以防止卵母细胞表达热休克蛋白；将微孔板存放在温控储存区域。
    6. 将结合试验中呈阳性的待测化合物溶解于 OR2 中，浓度为 0.1–1,000 µM 用于电生理记录，并将其弃置于96孔平底聚丙烯板中。
  3. 用于表达的质粒
    1. 按照市售试剂盒的说明书操作，使用细菌 T7 或 T6 启动子进行 mRNA 合成，并制备 20 µL 溶液的 0.2 µg/µL 在无RNase的水中。
    2. 至少准备 20 µL 含有用于cDNA表达的真核表达载体的溶液，通常在 0.2 µg/µL 溶于双蒸水中。
  4. 卵母细胞显微注射及其质量观察
    1. 使用玻璃微量注射针（针尖直径不超过规定范围）注入10–50 nL含有质粒的溶液（参见步骤2.3.1或2.3.2） 100 µm 安装在配备压力喷射系统或自动注射系统的显微操作仪上。
      注：在本示例中，使用适用于cDNA或mRNA注射的自动化系统，将卵母细胞以每批95个进行注射。
    2. 用注射针头吸取 1 µL 使用1%的染料（如亚甲蓝）并通过标准程序进行卵母细胞注射（cDNA注射至细胞核，mRNA注射至细胞质）。
    3. 将注射后的卵母细胞在沸水中处理约 1 分钟。在体视显微镜下用剃刀刀片将卵母细胞切成两半。
      注意：染料保持在局部，如图所示 图3E，从而实现对注射过程的精确观察。
  5. 双电极电压钳记录
    1. 将含有卵母细胞的培养板放置于自动化系统上，该系统采用图示原理 图4.
      注意：与图示的膜片钳系统不同 图5细胞的真实膜电位由电压电极读取。
    2. 使用基于图标的界面来编程自动记录系统，例如采用图中所示的方案 图6 用于确定浓度与活性之间的关系。
  6. 曲线拟合
    1. 使用适当的软件分析结果，根据所示的浓度激活曲线，绘制电流幅度随激动剂浓度对数变化的曲线图。
    2. 观察随后可用经验 Hill 方程拟合的 S 形曲线，其形式为：
      figure-protocol-4
      此处，
      Y= 诱发电流的比例，
      EC50 达到50%激活时的浓度，
      x = 化合物的浓度，
      nH = Hill系数或表观协同性。
    3. 通过将每个反应的幅度除以1来将电流归一化 与 记录最高浓度下的数值，以分析从一系列细胞获得的数据。
    4. 计算平均值与标准误，并使用标准软件进行曲线拟合。

3. 脑片中的电生理记录

注意：大鼠海马脑片的制备需遵循国家和机构的相关指南。

  1. 海马切片的制备
    1. 配制解剖用人工脑脊液（dACSF），其中包含 124 mM NaCl、2.5 mM KCl、1.25 mM KH2PO4、2 mM MgSO4·7H2O、2.5 mM CaCl2·2H2O、26 mM NaHCO3、10 mM 葡萄糖和 4 mM 蔗糖，并在瓶中用 95% O2 与 5% CO2 的混合气体饱和。
    2. 配制记录用人工脑脊液（rACSF），其中包含 124 mM NaCl、5 mM KCl、1.25 mM KH2PO4、2 mM MgSO4·7H2O、2.5 mM CaCl2·2H2O、25 mM NaHCO3 和 10 mM 葡萄糖，并在瓶中用 95% O2 与 5% CO2 的混合气体饱和。
    3. 使用 2.5% 异氟烷与纯氧的混合气体麻醉大鼠，随后将其断头处死。
    4. 用精细的剪刀沿中线切开头皮。沿中线剪开颅骨，注意不要损伤下方组织。用镊子移除颅骨，并用精细刮匙取出脑组织。
    5. 将脑组织置于室温下含混合气体饱和的 dACSF 溶液中，并用精细刮匙分离左侧海马结构。
    6. 使用组织切片机从海马中段切取横切片（厚度为 400 µm），并用画笔将其转移至记录槽中。在室温下维持切片 45 分钟。
    7. 以 35 °C、流速 1.5 mL/min 的混合气体饱和 rACSF 对切片进行灌流，同时用 95% O2 与 5% CO2 的混合气体持续通气。
      注：完成此步骤后，切片即可用于电生理实验。
  2. 单群体峰电位记录
    1. 将一片脑切片放入显微镜载物台上的记录槽中。
    2. 以 3 mL/min 的流速用 rACSF 对切片进行灌流。
    3. 使用拉针仪制备硼硅酸盐玻璃微电极，使其电阻约为 2 MΩ。
      注：该微电极用作记录电极，并与放大器电连接。
    4. 用含 2 M NaCl 的溶液填充微电极，并将其插入放大器的电极夹持器中。
    5. 使用右侧微操纵器将记录微电极置于海马切片 CA1 区的锥体细胞层（stratum pyramidale）内。
      注：该位置在 图7 中有示意图表示。
    6. 将一根绝缘双极铂/铱电极置于左侧微操纵器的夹持器中。
      注：该电极用作刺激电极，并与刺激发生器电连接。
    7. 使用右侧微操纵器将刺激电极置于海马切片 CA1 区的Schaffer侧支通路中。
      注：该位置在 图7 中有示意图表示。
    8. 通过刺激发生器每隔 30 秒向刺激电极施加一个电流脉冲（持续时间为 100 µs，起始强度为 10 µA），并逐步增加刺激强度，直至出现群体峰电位（PS）。
    9. 调节刺激强度，使诱发的群体峰电位（PS）的振幅达到最大振幅的 45%。PS 信号通过信号放大器以 2.4 KHz 滤波，以 20 KHz 采样频率进行数字化。
  3. 双脉冲抑制
    1. 制备脑切片（步骤 3.1），并按前述方法操作（步骤 3.2.1–3.2.7）。
    2. 通过刺激发生器每隔 30 秒向刺激电极施加两个电流脉冲（每个脉冲持续 100 µs，间隔 20 ms），并将刺激强度设定为诱发振幅达最大值 45% 的群体峰电位（PS）。
  4. 化合物测试
    1. 将待测化合物用混合气体饱和的 ACSF 稀释，使终浓度中 DMSO 不超过 0.1%。
    2. 在对照溶液中加入与化合物溶液中相同浓度的 DMSO。
    3. 每隔 30 秒记录一次由 Schaffer 侧支刺激诱发的单脉冲（步骤 3.2）或双脉冲（步骤 3.3）群体峰电位（PS），持续至少 30 分钟。在此基线期，PS 的波形应保持稳定。
    4. 准备一个烧杯，其中盛有含固定浓度待测化合物的混合气体饱和 rACSF 溶液。
    5. 用该溶液灌流海马切片，同时继续记录单脉冲或双脉冲群体峰电位（PS）。
    6. 通过用不含化合物的混合气体饱和 rACSF 灌流切片，评估化合物效应的恢复情况。
      注：对于可逆效应，群体峰电位（PS）将恢复至施加化合物前基线期所观察到的初始波形。
  5. 数据分析
    1. 使用数据分析软件将实验过程中记录的群体峰电位（PS）轨迹以每 4 个为一组进行平均。
    2. 测量平均轨迹中群体峰电位（PS）的振幅。
    3. 将振幅标准化为施加化合物前 10 分钟内记录的基线值的百分比。
    4. 数据以均值 ± 标准误（SEM）表示。

结果

结合：
的 体外 使用细胞膜进行的检测用于鉴定选择性的人源GABAA α5β3γ2受体配体在BZD变构位点的结合 γ2 含有受体。瞬时转染表达人 GABA 的 HEK293 细胞A α5β3γ2, α1β3γ2, α2β3γ2，以及 α3β3γ2 个受体用于制备本实验所需的膜。通过检测[3H]氟马西尼与膜受体结合（对[3H]氟马西尼结合）。随后生成置换结合曲线，以评估化合物对特定GABA受体亚型的选择性。A 受体，如 RO4938581 示例中所示（图8). 图9 总结了多种参考化合物的特征，包括 α5 选择性 GABAA 受体负性变构调节剂，RO49385819，这些数据是通过结合实验生成的。

在Xenopus卵母细胞中的记录：
表达GABAA受体（例如α5β3γ2异源多聚体）可在暴露于GABA时产生显著的电流反应。图6展示了在表达人源α5β3γ2受体的卵母细胞中，对浓度递增至300 µM的短时GABA脉冲（30 s）所记录到的典型电压钳电流。在本实验中，不同浓度的GABA被预先置于96孔板中，通过将细胞移至特定孔中以诱发反应。通过将细胞移回中央灌流室并启动相应的蠕动泵灌注对照溶液，可充分洗去GABA。用于测定浓度-激活曲线的程序序列如图6A所示。该过程完全自动化，这些数据不仅展示了在Xenopus卵母细胞中所能获得的记录质量，也反映了mRNA注射数天后受体表达水平之高。在不同受体亚基组合下开展的实验获得了一系列EC50值，即激活半数受体所需的GABA浓度。将EC50值绘制成蛛网图（如图10所示），可快速比较受体特性及其亚基组成的影响。

为了检测负向或正向变构调节剂（NAM 或 PAM）的作用，必须首先在对照条件下，然后在存在调节剂的情况下，比较激动剂（GABA）测试脉冲所引发的反应。进行此类实验的一种高效实验方案如图所示。 图11首先测定细胞对参考浓度 GABA 的反应，随后重复该序列，依次施加相同浓度的 GABA，以及 GABA 与调节剂的共施加。两条叠加反应的曲线图在此示例中显示出调节剂存在下明显的抑制作用。通过计算调节剂存在时所诱发反应的比值，可快速量化调节剂的作用效果。 与 对照组和结果可以以热图形式绘制。图中所示数据 图12 展示96种化合物三组数据集记录结果对应的热图。

在确定具有足够活性的化合物后，通常必须评估这些分子在其他受体组合中的活性。以 GABAA 受体为例，目前已鉴定出19个编码不同亚基的基因，已知功能性受体可由多种亚基组成的多聚体结构形成（参见 Knoflach、Hernandez 和 Bertrand10 的综述）。尽管存在多种亚基及其组合，导致受体亚型种类繁多，可能需要进行大量反筛实验，但通常可优先聚焦于最丰富的亚型，对于 GABAA 受体而言，即 α1β2γ2 构型。通过在同一批卵母细胞中平行表达例如 α5β3γ2 和 α1β2γ2，可对同一分子的相应效应进行良好比较。在三个细胞中针对 α5β3γ2 和 α1β2γ2 所获得的典型结果如图13所示，显示了某一分子对 α5β3γ2 亚型具有优先的正向调节作用。

文中所示的实验方案 图11 非常适合用于表征PAM活性。在本方案中，待测化合物与激动剂共同施加，并逐步增加浓度。为避免在同一细胞上多次施加可能引起的累积效应，每个数据点均使用新的、未经处理的细胞进行测量。通过记录单独使用激动剂时的反应幅度，以及在施加化合物期间的反应幅度，计算其比值，从而量化PAM或NAM效应。在典型实验中获得的结果显示于 α1β2γ2 和 α5β3γ2 的地西泮显示在 图14，揭示出明显的敏感性 α5β3γ2，该受体组合下的值大约高出10倍。这些数值与已发表的数据具有良好的相关性11. 由于人们认为苯二氮䓬位点是由α和γ亚基之间的界面构成的 γ2 及其相邻区域 α 亚基12,13,14，该方法的灵敏度 α5β3γ2 表明地西泮对...具有优先亲和性 γ2-α5 以上 γ2-α表达不同受体组合并结合高效功能表征的可能性，为探索正向变构调节剂（PAM）特性的决定因素及其在生理和药理效应中的意义提供了多种途径。

海马脑切片：
利用大鼠海马脑片进行实验，以验证在筛选中鉴定出的化合物的药理学特征 体外 在天然受体模型中进行的检测。主要的GABAA 海马锥体细胞中表达的受体亚型为 α1β2/3γ2, α2β2/3γ2，和 α5β2/3γ2，这些均受苯二氮䓬类药物（BDZs）调节15成对脉冲抑制是一种通过检测相隔20 ms的两个成对电刺激中第二个刺激反应的变化来揭示海马神经回路兴奋性的范式。第二个反应的变化源于中间神经元对锥体细胞层的GABA能反馈。16,17,18如图所示 图7在对照情况下，由于GABA能抑制作用，成对刺激中的第二个反应受到抑制。当通过灌注切片以 β-CCM是一种非选择性的NAM，成对刺激中的第二次反应受到的抑制程度要小得多。该实验范式对选择性作用于GABA的化合物敏感A 含受体的 α5 个亚基

figure-results-1
图1筛选策略 典型的药物筛选流程始于高通量筛选，即对大量化合物库针对特定靶标进行筛选。在确定先导候选化合物后，药物化学工作随之展开。在此阶段，化学家将通过结构修饰对分子进行研究和优化，以满足预期的标准，如靶标选择性、血脑屏障穿透能力、稳定性及降解特性 等等。 在此关键阶段，必须评估化学修饰是否改变了分子性质，并筛选出最优候选分子。下一步是确定若干有前景的化合物，并推进至后续步骤，包括安全性、耐受性评估 等等。 需要注意的是，电生理学被列为功能检测方法，但也可使用其他方法作为替代，包括钙荧光检测或电压敏感性染料检测。后述这些方法还可用于高通量检测，以替代结合实验。 请点击此处查看该图的放大版本。

figure-results-2
图 2：用于结合实验的 96 孔板布局。第 1 列用于总结合测量，第 2 列用于非特异性结合测量。A–H 行在第 3–12 列中加入 4 种不同化合物，浓度依次递增，每种化合物设两个复孔（i.e.，化合物 1 位于 A 和 E 行，化合物 2 位于 B 和 F 行，etc.），在布局中以不同颜色表示。请点击此处查看该图的放大版本。

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图3使用自动化系统进行显微注射。 (A一种精确的XYZ系统，可自动将装有含目的质粒液体的玻璃注射针插入卵母细胞中。B该图展示了用于实验的96孔锥底板，其中（C卵母细胞被自动注射。D) 该图示说明了注射原理。进行细胞核注射时，针头穿透卵母细胞的深度应略深于细胞核，如图所示 B。随后，将针头从细胞核中撤出（见图示面板 C注射前（见图示面板） D). (E) 为评估注射质量，可将染料注入针头中 "煮熟的" 卵母细胞可以被切成两半。 请点击此处以查看此图的放大版本。

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图 4：自动双电压钳电极原理。 该原理基于将样品在不同孔之间移动，而非在灌流过程中施加液体。（A）图中左侧展示了实验装置，可在移动样品时利用两个电极及一个小篮子使Xenopus卵母细胞周围保持液滴状态，从而实现记录。右侧展示了卵母细胞置于篮中并连接两个电极的实际图像。（B）本图展示了“倒置”膜片钳电生理记录原理的示意图。（C）本图展示了卵母细胞、化合物板和清洗站于记录台上的布局。请点击此处查看该图的放大版本。

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图5双电极电压钳记录 与 膜片钳 典型的卵母细胞双电极电压钳记录（左图）与用于细胞系的膜片钳构型（右图）相比较。注意卵母细胞之间的尺寸差异，其直径约为1 mm 与 细胞，其大小约为 20 µm在双电极电压钳中，将卵母细胞的膜电位与设定的钳制电压进行比较，其信号差值被注入电流电极。在膜片钳记录中，假设膜片钳电极的电阻可忽略不计。 与 膜电阻，因此放大器施加的电压能够真实地传递到细胞膜19图示为一种液体细丝灌流实验，其中theta管的两个通道分别装有对照溶液和含药物的溶液20,21. 请点击此处以查看此图的放大版本。

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图6：人 α5β3γ2 受体上的浓度-激活关系。 （A）控制自动化系统的序列由一系列图标组成，用于设定测定浓度-激活关系的实验方案。如本图所示，在步骤1–3中，系统将卵母细胞从培养板装载至测量篮中。在步骤2中测量漏电流，若该值超过预设标准，则系统自动更换细胞（步骤3）。经过一段稳定期（步骤4）后，测量卵母细胞对参考GABA浓度的反应（步骤5–8）。对显示电流大于1 µA的卵母细胞保留用于后续测量。在步骤11–13中，用不同浓度的GABAA刺激细胞，并对所需数量的浓度（步骤14）和细胞（步骤15）重复该过程。（B）本图显示了一系列按递增顺序施加的短暂GABA应用（30 s）所诱发的典型电流。化合物施加的时间由图中的条形表示。（C）峰值内向电流随GABA浓度对数变化的曲线图可拟合为经验性的Hill方程，拟合曲线为连续线，EC50约为11 µM，Hill系数为1.3。8个细胞中记录的电流被归一化为最大诱发反应的单位值。条形表示平均值的标准误。请点击此处查看此图的放大版本。

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图7: β-CCM，一种GABAA NAM 降低海马脑片中的成对脉冲抑制。 (A) 该图显示大鼠海马脑片的示意图。起源于CA3锥体细胞轴突的Schaffer侧支（Sch C）投射至CA1锥体神经元的树突分支。记录电极置于锥体细胞层（str pyramidale）以记录群体峰电位（PS），树突记录电极置于辐射层（str radiatum）以记录场兴奋性突触后电位（epsp）。刺激电极置于Schaffer侧支内。B该图显示通过同一刺激电极以 20 ms 间隔施加成对刺激所诱发的群体峰电位（PS）。第二个刺激诱发的群体反应（PS2）的振幅小于第一个刺激诱发的反应（PS1）。C) 在无（黑色柱）和有 β-CCM，一种非选择性的GABAA 受体NAM（绿色条状图）。 β-CCM 通过部分阻断前馈性 GABA 能抑制，增强了第二个 PS2 的振幅。柱状图表示平均值的标准误，*** 表示数据具有高度显著性，且具有 p <0.01. 请点击此处以查看此图的放大版本。

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图8: 竞争性（抑制或置换）实验中获得的典型结合结果。 通过实验数据生成置换结合曲线，从中可确定IC50和Ki值。IC50是指竞争性配体置换50%放射性配体特异性结合所需的浓度；Ki（药物的抑制常数）则是指在无放射性配体存在时，竞争性配体占据50%受体所需的浓度。Ki值可通过Cheng-Prusoff方程由IC50 计算得出：
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请点击此处查看该图的放大版本。

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图9：使用结合于主要GABAA受体亚型的配体进行竞争性置换结合实验。 亲和力（nM）通过[3H]氟马西尼结合实验测定，所用膜蛋白来自瞬时转染了不同人源GABAA受体亚基组合的HEK293细胞。柱状图清晰地展示了化合物RO493851在α5β3γ2受体上的差异性敏感性，其Ki值最低。请点击此处查看该图的放大版本。

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图10: GABA受体的差异性敏感性 GABA受体EC曲线图50 在蜘蛛图上以及假定亚基组成的示意图可有效比较不同亚基的功能作用。请注意，该引入的 γ2个亚基与受体敏感性的降低相关。 请点击此处以查看此图的放大版本。

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图11：检测一种调节剂的作用效果。（A）该图示说明了用于控制自动化系统的图标序列。请注意，两个（A/D）图标分别对应于对照条件（绿色）和调节剂作用期间（红色）的记录。（B）该图示显示了在表达GABAA受体的细胞中进行此类序列记录时的典型电流。为评估调节剂的作用，先记录固定浓度GABA诱导的反应（绿色迹线），随后记录先暴露于GABA、再暴露于GABA加调节剂的反应（红色迹线）。通过定位十字准线光标（青色和蓝色）来界定测量范围，蓝色十字表示两种记录条件之间的最大差异。对照与调节剂条件之间的比值由分析软件自动计算。请点击此处查看该图的放大版本。

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图12： 三组重复实验的热图。 本图显示了96种化合物在人源α5β3γ2 GABAA受体上调节效应的三组重复实验对应的热图。测试反应相对于对照的比值在0.5至1.2之间时，视为与对照无显著差异，以绿色圆点表示；比值低于0.5视为具有抑制效应，以蓝色圆点表示；比值高于1.2视为增强反应，以红色圆点表示。请注意三组独立记录之间的图谱模式具有相似性。请点击此处查看该图的放大版本。

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图13： 在 α1β2γ2 位点的反向筛选。 （A）该图显示了一个假定的亚基组成示意图。后续各图显示了（B–D）在人源 α5β3γ2 受体上，以及（F–H）在 α1β2γ2 受体上，使用相近浓度的 GABA 和相似浓度（100 µM）的调节剂对一种正向变构调节剂作用效果的评估结果，这些结果突显了本实验中所测试化合物的特异性。（E）该图也展示了一个假定的亚基组成示意图。 请点击此处查看该图的高清版本。

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图14PAM 敏感性与受体组成 地西泮系列浓度效应的测定（A-D) 在 α1β2γ2 和 (E-H) α5β3γ2个受体显示出表观亲和力几乎相差10倍。同时注意亚基组成对反应时程的影响，其中脱敏速度更快 α1β2γ2 受体（例如，参见图版） D 和 H）。请注意，随着 α1β2γ2 和 α5β3γ2 种受体对 GABA 具有不同的亲和力（另见 图10），两种受体的激动剂浓度被调整至相近的激活范围。（I）该图显示的是电流幅度相对于归一化为1时的倍数增加量的曲线图 与 对照条件 请点击此处查看该图的放大版本。

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图15：包含T7和CMV启动子的表达质粒。 这些图示显示了在非洲爪蟾（Xenopus）卵母细胞（右上图）和细胞系中表达所用的质粒。右下图展示了转染了含有绿色荧光蛋白（GFP）基因质粒的典型HEK-293细胞，以及膜片钳记录电极。 请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

开发作用于配体门控离子通道（如GABAA受体）的新型化合物需要采用多种方法。通常，第一步常通过结合实验进行；然而，此类测量不足以表征化合物的生理活性或其精确的药理学特性。特别是，能够与受体结合的化合物可能增强或抑制其功能，甚至不产生任何功能性效应（即为“沉默”状态）（即，与受体结合但不改变其功能）。因此，必须进行功能性检测，以实现对化合物的全面表征。

结合实验：
结合实验的主要优势在于，它能够高效地对多达数千个样品进行检测，并可提供活性分子的结合亲和力。如本文所述，第一步是建立针对目标受体亚型的检测方法。具体而言，尽管结合实验可在来源于组织组分或完整脑组织的天然受体上进行，但这种方法将无法测定特定受体亚型上的亲和力。因此，有必要使用重组表达系统来对目标分子进行筛选。如今，在细胞系中瞬时或稳定转染目标受体亚基的cDNA，已成为表达特定受体亚型（例如，GABAA α5β3γ2）的一种高效且可靠的方法。传统的结合实验依赖放射性配体，但目前已有多种技术可避免放射性操作带来的不便（例如，基于定量荧光的配体结合检测法）。

在宿主系统中的功能表达：
为了在宿主系统中表达基因，必须将目的编码序列插入含有适当启动子的质粒中。通常，对于 体外 mRNA合成通常使用细菌T7或T6启动子。对于cDNA表达，目的基因的转录必须由真核生物启动子（如CMV（巨细胞病毒）或类似启动子）调控。目前，已有多种质粒同时包含这两种启动子即，pUNIV、pCMV-6AC、psf-CMV/T7、pCI-neo、pcDNA）可供选择，可用于实现 体外 mRNA 或 cDNA 表达的合成，如图所示 图15. GABA 表达的检测A 受体可从细胞系或在 非洲爪蟾 卵母细胞。后者的优点主要在于无内源性受体表达、操作简便，以及具备自动化显微注射与记录系统。本方案所述步骤展示了该自动化系统的高效性，可在约7分钟内完成96个卵母细胞的注射，且无需显微操作技能。需注意，单个卵巢所获取的 非洲爪蟾 含有10,000至30,000个卵母细胞，显然可在单次制备样本上进行大量细胞水平的测量。此外，通过cDNA注射可实现基因表达，因此用于结合实验的相同质粒可直接用于功能表征，无需进一步的分子生物学操作。

由于卵母细胞体积较大且表面表达水平高，单个卵母细胞所获得的受体数量大约相当于一个35 mm培养皿中汇合细胞的产量。然而，与细胞系相比，卵母细胞的制备和注射成本仅为其一部分，因为该实验无需特定的培养基和无菌操作。单个GABAA通道的激活可产生数皮安（10-12）的电流，而在单个卵母细胞中记录到的电流可高达数十微安（10-6），这证实了在一次反应中数百万个受体同时发挥作用。

配体门控离子通道表征的第一步通常是测定受体的表观亲和力。所需进行的实验包括施加一系列短暂的激动剂测试脉冲，并将诱发电流的幅度或在某些情况下曲线下面积（AUC）对激动剂浓度的对数作图。由于在同一组卵母细胞中显微注射不同浓度和比例的质粒是很容易实现的，因此该表达系统特别适用于此类表征。此外，批次间的比较显示不同EC50值具有高度稳定性。使用蜘蛛图可以直观地展示亚基组成对受体表观亲和力的影响，如图10所示。

双电极电压钳实验所获得的结果 非洲爪蟾 卵母细胞常与采用膜片钳电极记录的方法进行比较。尽管对这两种系统进行详细比较将超出本研究的范围，但仍可考察若干要点。尽管细胞中的膜片钳技术在快速给药条件下的生物物理表征方面具有优势，但其操作要求比双电极记录更为复杂 非洲爪蟾 卵母细胞。一个首要且不可忽视的困难在于目标蛋白的表达，这需要进行细胞培养、瞬时或稳定转染，并鉴定出表达目标构建体的细胞。此外，必须考察所选细胞中内源性表达可能产生的影响。同时，膜片钳记录需要由熟练的操作人员在高倍显微镜下进行显微操作，且该人员还需在实验过程中进行适当的分析，以评估封接质量、通路电阻等参数。 等等。 相比之下，双电极电压钳记录（尤其是使用自动电生理系统的记录）不需要特殊技能，实验室技术人员即可完成。

在购置电生理实验装置时，成本因素无疑是需要仔细分析的重要方面。例如，尽管自动化系统的成本相对较高，但进一步比较发现，安装一套完整的电生理实验系统需要购买多种设备，包括高性能显微操作器、双目透镜、放大器、灌流系统和防震台，同时还需进行数据采集与分析。两种电极电压钳装置之间的成本比较 与 膜片钳装置进一步揭示了更多差异。此外，自动化系统具有设备全自动运行的优势，可全天候无人值守操作。

化合物的药理学特性由其在受体上的作用方式决定。例如，竞争性抑制剂是能够进入与激动剂相同结合位点（即正构位点）的分子，从而产生竞争。非竞争性抑制剂则是通过与另一个位点相互作用来抑制受体功能的化合物，在配体门控离子通道的情况下，这类抑制剂可进入并阻断离子孔道。深入探讨各种相互作用机制已超出本研究的范围，但更多相关信息可参阅药理学教科书，或参考其他文献，如 Bertrand 和 Bertrand 的研究22。

对于变构调节剂而言，化合物结合于与正构位点不同的位点，但该分子的存在会改变受体在激活态与其他状态之间的能量势垒。正向变构调节剂（PAMs）是一类能够降低受体从静息态转变为激活态所需能量势垒的化合物，从而增强激动剂的作用效果。因此，为了表征可能存在的PAM效应，有必要确定该化合物是否能够增强激动剂引起的反应，以及产生增强效应的具体浓度。在图11和图14中展示的实验说明了可用于GABAA受体上PAMs表征的可行实验方案。

在某些情况下，单独暴露于PAM可能足以激活受体。此类活性可通过对此处所述实验方案进行轻微修改来确定。具体而言，不再在暴露于GABA的同时共施加调节剂，而是可将方案修改为先单独施加待测化合物，然后再在GABA存在的情况下施加。通过测定化合物本身所诱发反应的幅度，并与GABA诱发的电流进行比较，即可表征其直接激动活性。

在脑切片中进行的实验，如图所示 图7用于在推进动物模型研究及临床试验路径之前，确认化合物在特定抑制性环路中天然受体上的活性。相对简单的数据记录与分析流程，可通过对不同化合物对PS振幅调节效应的评估，实现对多种化合物的活性排序。此外，还可检测与GABA系统无关的化合物非特异性效应。例如，当观察到突触后电位（PS）形态发生变化时）。在这些情况下，可通过全细胞膜片钳技术测量化合物对抑制性突触后电流（IPSCs）的影响，以评估直接的GABA能神经传递作用8.

披露

作者 Frédéric Knoflach 和 Maria-Clemencia Hernandez 为瑞士巴塞尔 4070 的制药公司 F. Hoffmann-La Roche AG 的员工。作者 Daniel Bertrand 为瑞士日内瓦 Vésenaz 1222 Compois 路 6 号 HiQScreen Sàrl 公司的员工，该公司为制药企业提供筛选服务。

致谢

作者感谢罗氏公司的 Judith Lengyel、Maria Karg、Grégoire Friz、Rachel Haab 和 Marie Claire Pflimlin，以及 HiQScreen 公司的 Tifany Schaer 和 Deborah Paolucci 提供的出色技术支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
通用设备
96孔细胞收集器 -（Filtermate 196） 帕卡德过滤结合了放射性配体的膜
微量滴定板液体闪烁计数器（Top Count NXT）帕卡德微孔板闪烁和发光计数器
Vial 液体闪烁计数器（Beta-Couter 2500 TR）帕卡德小瓶闪烁和发光计数器
液体  移液工作站（Biomek 2000）Beckman Coulter配制化合物稀释液
涡旋振荡器（Vortex Genie 2）Scientific Industries 公司混合化合物储备液
组织匀浆器（Polytron PT1200E）Kinematica AG重悬膜制备物
XLfit5 软件Microsoft Excel
 IDBS 增强模块		曲线拟合软件
Smart PullUniPix-电极拉制仪
RoboInjectMultiChannel Systems-自动化注射（非洲爪蟾卵母细胞）
HiClampMultiChannel Systems-自动电压钳Xenopus 卵母细胞
数据挖掘MultiChannel Systems-数据分析软件
DataMergerMultiChannel Systems-数据处理软件
Digidata 1550Molecular Devices低噪声数据采集系统
CyberAmp 380 或同等型号Axon Instruments可编程信号调节器
pClamp 程序套件Molecular Devices数据采集与分析软件
防震台 TMC为避免微电极振动 
Patchstar 微操纵器科学仪器准确放置脑片中的微电极
法拉第笼 Sutter Instruments为消除噪声干扰而分离记录信号
McIlwain组织切片机Campden Instruments LTD 制备脑切片
硼硅酸盐玻璃微量移液管 Warner InstrumentsGC150TF-10记录脑片中的细胞外电位
双绞铂铱丝刺激电极World Precision Instruments刺激脑切片以施加电流
用于电流和电压驱动刺激的刺激发生器MultiChannel SystemsSTG4000向刺激电极输送电流
塑料器皿
微孔板圆底康宁#3365用于结合实验
GF/C 玻璃纤维滤底 96 孔微孔板，孔径 1.2 µm 孔径，用于使用真空 manifoldwell 过滤器进行细胞收获测定 帕卡德 #6005174用于结合实验
50 mL 离心管Falcon #352070用于结合实验
安全锁扣管 1.5 mLEppendorf#0030 120086用于结合实验
安全锁扣管 2 mLEppendorf#0030 120094用于结合实验
180 mL 运输管 Semadeni Europe AG #3722用于结合实验
6 mL 聚乙烯小瓶 Perkin Elmer #6013329用于结合实验
顶部密封 Perkin Elmer #60051859用于结合实验
旋转烧瓶BellcoBELLCO # 1965-00100旋转烧瓶
96  孔板（锥形）赛默飞世尔科技 Milian56368卵母细胞注射板
96  培养板（平底）Corning（Vitaris 瑞士）3364-冠用于HiClamp的化合物板
玻璃毛细管 Hilgenberg（德国）-硼硅酸盐玻璃，外径1.2，内径0.76，带纤维丝
RNA制备
Ambion mMessage mMachineThermo Fisher Scientific用于 体外 合成
化学品
测定缓冲液：KCl 5 mM；CaCl2 1.25 mM；MgCl₂2 1.25 mM；NaCl 120 mM；Tris 15 mM，用 HCl 调节 pH 至 7.4；4 ℃ 保存，最长可保存 3 个月 °C.用于结合实验
洗涤缓冲液：Tris 50 mM-HCl，pH 7.4；4 ℃保存 °C.用于结合实验
测试化合物的DMSO储备液（10 mM）用于结合实验
氟马西尼（RO0151788）10 mM 溶于 DMSO用于结合实验
地西泮 4 mM 溶于 DMSO用于结合实验
[3[H]-氟马西尼 60-85 Ci/mmol，溶于乙醇；-20℃保存 °C用于结合实验
Microscint 40 帕卡德 #6013641用于结合实验
Ultima Gold Perkin Elmer #6013329用于结合实验
MS-222SigmaSigma # A5040MS-222
AB/AMSigmaSigma # A5955抗生素 / 抗真菌剂
胶原酶SigmaSigma # C1030I 型胶原酶
RNaseSigmaSigma # R2020-250 mLRNaseZAP
EndoFree 质粒大提试剂盒QiagenQiagen # 12362
人工脑脊液用盐类（NaCl、KCl 等）Sigma
膜
来自瞬时或稳定转染的过表达不同人源GABA受体的HEK293细胞的冷冻膜制备物A 受体亚型： α1β3γ2, α2β3γ2, α3β3γ2, α5β3γ2. 参见 Ballard 等 2009年以获取详细方法。用于结合实验

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GABA A

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