方法文章

一种利用阿米巴进行的快速基于图像的细菌毒力检测方法

DOI：

10.3791/57844

⸱

2018年6月27日

 , 
1Department of Physics and Astronomy, University of California, 2Department of Molecular Biology and Biochemistry, University of California

本文内容

摘要

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本文介绍了一种利用D. discoideum（阿米巴原虫）作为宿主来测定浮游态或表面附着细菌毒力的实验方案。通过荧光显微镜观察和图像分析，在1小时的时间范围内对宿主杀伤效应进行量化。我们以细菌P. aeruginosa为例，演示了该实验方案的操作过程。

摘要

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传统的细菌毒力检测通常需要将细菌与宿主细胞共孵育数小时。在此期间，细菌可能因暴露于宿主生长环境及宿主细胞的存在而发生生理状态的改变。我们开发了一种快速检测细菌毒力状态的方法，该方法最大限度地减少了细菌在宿主细胞存在条件下的生长。将细菌与变形虫混合后，利用琼脂垫将其固定在单一成像平面上。该方法采用单细胞荧光成像技术，以钙黄绿素乙酰甲酯（calcein-AM）作为指示宿主细胞健康状况的荧光探针。通过落射荧光显微镜，在宿主细胞与细菌共孵育1小时后分析宿主细胞的荧光信号。利用图像分析软件计算宿主杀伤指数。该方法已用于检测生物膜形成初期浮游态和表面附着态铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）亚群的毒力，并可适用于其他细菌及其他生物膜生长阶段。本方案提供了一种快速且可靠的毒力检测方法，避免了哺乳动物细胞系培养与维持过程中的诸多复杂因素。本研究中利用变形虫检测到的毒力表型也已在小鼠巨噬细胞中得到验证。特别是，该检测方法证实了表面附着可上调铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）的毒力。

引言

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细菌感染是人类和动物死亡的主要原因之一1,2。在医疗和科研环境中，测定细菌在培养物或生物膜中致病能力具有重要意义。本文介绍一种通用、快速且相对简便的细菌致病性定量方法。以真核生物Dictyostelium discoideum（阿米巴原虫）作为模式宿主生物。D. discoideum 已被用作宿主来鉴定Pseudomonas aeruginosa（P. aeruginosa）3,4,5及其他细菌6,7,8的致病因子，并且对多种与杀伤哺乳动物细胞相同的致病因子具有敏感性，包括III型分泌系统9,10。以往使用D. discoideum进行的致病性检测通常需要将细菌与D. discoideum细胞长时间共孵育数小时

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方案

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所有实验操作均在加利福尼亚大学欧文分校进行。

1. 缓冲液与溶液

  1. 在1 L玻璃瓶中制备LB（Lysogeny Broth）培养基：将25 g LB-Miller培养基粉末加入1 L双蒸水（ddH2O）中。若用于制备培养皿，额外加入20 g琼脂。经高压灭菌后，在10 cm直径的培养皿中各倒入25 mL熔融琼脂培养基，并于室温下静置凝固。液体培养基室温保存，琼脂平板4 °C保存。
  2. 在1 L玻璃瓶中制备葡萄糖酵母蛋白胨（GYP）平板：将1 g D-葡萄糖、2 g蛋白胨、0.25 g酵母提取物、4.2 g KH2PO4、5.1 g Na2HPO4·7H2O和25 g琼脂溶于1 L双蒸水（ddH2O）中，混合均匀。高压灭菌后，在10 cm直径的培养皿中各倒入25 mL熔融琼脂，室温下静置凝固。4 °C保存。
  3. 在1 L玻璃瓶中制备PS（Peptone S）培养基：将10 g蛋白胨、7 g酵母提取物、15 g D-葡萄糖、0.12 g Na2HPO4·7H2O、1.4 g KH2PO4、40 µg维生素B12和80 µg叶酸加入800 mL双蒸水....

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结果

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我们在直径6 cm的培养皿中培养野生型P. aeruginosa菌株PA1419或相同PA14背景下的ΔlasR突变菌株20，并检测了浮游状态细胞和附着于表面细胞的毒力。培养物从单菌落接种至PS:DB培养基中，在37 °C条件下于旋转滚筒中培养过夜至饱和，随后以1:100比例转接至PS:DB培养基，在直径6 cm的培养皿中于100 rpm振荡条件下培养8小时，浮游态和表面附着态的P. aeruginosa亚群按第3节所述方法分离。

附着在表面的野生型P. aeruginosa杀死了变形虫，表现为变形虫细胞呈圆形，并观察到钙黄绿素荧光（图4A，左上图）。这导致宿主杀伤指数较高（

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讨论

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本方案描述了一种快速且定量检测铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）毒力的方法。该方案也可用于其他细菌的检测。但需要注意的是，所使用的培养基应与阿米巴原虫的生长条件相容。特别是，我们已使用PS:DB作为细菌培养基对本方案进行了优化。若使用其他培养基，则可能需要设置仅含培养基而不含细菌细胞的对照组，以验证该培养基是否适合阿米巴原虫的生长。

该方法可扩展用于检测毒力与细菌生长阶段的依赖关系。具体而言，可将细菌培养不同时间，而非固定在一个时间点。根据我们的经验，重要的是在特定时间点收获细菌培养物，因为铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）的毒力似乎依赖于其生长阶段。我们观察到，在培养皿中培养6至8小时之间，铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）的毒力被诱导产生。

与生长环境相关的许多变量会影响宿主健康和细菌毒力。因此，每个实验都必须使用适当的阳性和阴性对照。我们已使用野生型表面附着 P. aeruginosa 作为阳性对照和ΔlasR

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披露

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作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

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KP 和 AS 撰写并修改了论文。KP 完成了实验和分析工作。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）职业转型奖（K22AI112816）资助，授予 AS。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
试剂
Bacto琼脂，脱水BD Difco214010
抗生素-抗真菌素（100X）Life Technologies15240062分装 < 1 mL 并于 -20 °C 保存
钙黄绿素-乙酰氧基甲酯（calcein-AM）Life TechnologiesC34852钙黄绿素乙酰氧基甲基（AM）
氯化钙，无水Sigma-AldrichC1016
D-葡萄糖Fisher ChemicalD16500右旋糖
二甲基亚砜Sigma-AldrichD5879
叶酸Sigma-AldrichF8758
LB-MillerBD Difco244620
氯化镁Sigma-AldrichM8266
酵母提取物OxoidLP0021
特殊蛋白胨OxoidLP0072
氢氧化钾Fisher ChemicalP250
磷酸二氢钾 Sigma-AldrichP0662
七水合磷酸氢二钠Fisher ChemicalS373
维生素B12Sigma-AldrichV2876
菌株
Dictyostelium discoideumSiryaporn 实验室菌株 AX318
Escherichia coliSiryaporn 实验室菌株 B/r17
Pseudomonas aeruginosaSiryaporn 实验室PA14PA14 菌株19
Pseudomonas aeruginosa ΔlasRSiryaporn 实验室AFS20.1源自PA14的菌株20
耗材
0.22 µm 滤膜 MilliporeSCGPT01RE用于过滤除菌
15 mL 锥形管Corning352097
玻璃储存瓶Pyrex13951L250 mL、500 mL、1000 mL
6 cm 直径培养皿Corning35100760 × 15 mm 聚苯乙烯培养皿
10 cm 直径培养皿FisherFB0875712100 × 15 mm 聚苯乙烯培养皿
带盖塑料容器Ziploc2.57E+09方形3杯容量容器
玻璃板Bio-Rad1653308用于制备琼脂垫。其他具有相似尺寸的玻璃板也可使用。
木棒Fisher23-400-102 
设备
Eclipse Ti-E 显微镜 NikonMEA53100显微镜系统
10X Plan Fluor Ph1 物镜  0.3 NANikonMRH20101显微镜系统
荧光激发光源LumencorSola light engine显微镜系统
荧光滤光片组SemrockLED-DA/FI/TX-3X3M-A-000 显微镜系统
Orca Flash 4.0 V2 相机Hamamatsu77054098显微镜系统
ImageJNIHv. 1.49图像分析软件
MATLABMathworksR2013图像分析软件
轨道摇床培养箱VWR89032-092用于在 37 °C 下培养细菌
平台摇床Fisher13-687-700用于在 22 °C 下培养变形虫
分光光度计BiochromUltrospec 10
台下式冷藏培养箱Fisher97990E用于在 22 °C 下培养变形虫
Isotemp 水浴锅 Fisher15-462-21Q用于将培养基冷却至 55 °C

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rasko, D. A., Sperandio, V. Anti-virulence strategies to combat bacteria-mediated disease. Nature Reviews Drug Discovery. 9 (2), 117-128 (2010).
  2. Coburn, B., Grassl, G. A., Finlay, B. B. Salmonella, the host and disease: a brief review. Immunology and Cell Biology<....

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Calcein AM

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