一种利用阿米巴进行的快速基于图像的细菌毒力检测方法

摘要

本文介绍了一种利用D. discoideum（阿米巴原虫）作为宿主来测定浮游态或表面附着细菌毒力的实验方案。通过荧光显微镜观察和图像分析，在1小时的时间范围内对宿主杀伤效应进行量化。我们以细菌P. aeruginosa为例，演示了该实验方案的操作过程。

摘要

传统的细菌毒力检测通常需要将细菌与宿主细胞共孵育数小时。在此期间，细菌可能因暴露于宿主生长环境及宿主细胞的存在而发生生理状态的改变。我们开发了一种快速检测细菌毒力状态的方法，该方法最大限度地减少了细菌在宿主细胞存在条件下的生长。将细菌与变形虫混合后，利用琼脂垫将其固定在单一成像平面上。该方法采用单细胞荧光成像技术，以钙黄绿素乙酰甲酯（calcein-AM）作为指示宿主细胞健康状况的荧光探针。通过落射荧光显微镜，在宿主细胞与细菌共孵育1小时后分析宿主细胞的荧光信号。利用图像分析软件计算宿主杀伤指数。该方法已用于检测生物膜形成初期浮游态和表面附着态铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）亚群的毒力，并可适用于其他细菌及其他生物膜生长阶段。本方案提供了一种快速且可靠的毒力检测方法，避免了哺乳动物细胞系培养与维持过程中的诸多复杂因素。本研究中利用变形虫检测到的毒力表型也已在小鼠巨噬细胞中得到验证。特别是，该检测方法证实了表面附着可上调铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）的毒力。

引言

细菌感染是人类和动物死亡的主要原因之一^1,2。在医疗和科研环境中，测定细菌在培养物或生物膜中致病能力具有重要意义。本文介绍一种通用、快速且相对简便的细菌致病性定量方法。以真核生物Dictyostelium discoideum（阿米巴原虫）作为模式宿主生物。D. discoideum 已被用作宿主来鉴定Pseudomonas aeruginosa（P. aeruginosa）^3,4,5及其他细菌^6,7,8的致病因子，并且对多种与杀伤哺乳动物细胞相同的致病因子具有敏感性，包括III型分泌系统^9,10。以往使用D. discoideum进行的致病性检测通常需要将细菌与D. discoideum细胞长时间共孵育数小时^3,4,5。本方案提供了一种利用该阿米巴原虫快速测定致病性的新方法。本方案（图1）详细说明了以下操作步骤：（1）无菌培养阿米巴原虫（即不依赖细菌的培养条件），（2）培养用于检测的细菌，（3）制备用于显微观察的细菌和宿主细胞样本，（4）进行落射荧光显微镜观察，以及（5）分析阿米巴原虫的荧光信号。

首先从冷冻保存的菌种中划线分离阿米巴原虫，并在大肠杆菌（Escherichia coli，E. coli）菌苔上培养，使其产生孢子。挑取这些孢子并接种至富集培养基中进行无菌培养。在营养充足的条件下通过无菌培养维持阿米巴原虫的生长，直至其可用于与细菌共培养以评估细菌的毒力。通过检测钙黄绿素乙酰甲酯（calcein-AM）的荧光强度来定量阿米巴原虫的存活或死亡情况。calcein-AM 可被细胞内酯酶切割而激活产生荧光^11,12。活的阿米巴原虫几乎不产生荧光，而处于应激状态或正在死亡的细胞则表现出强烈的荧光。这是由于健康的阿米巴原虫几乎不摄取 calcein-AM，而处于应激状态的阿米巴原虫则会摄取该底物并将其切割¹³。这种现象明显不同于 calcein-AM 在哺乳动物细胞中的荧光表现^11,14,15,16。

将分别培养待评估毒力的细菌。本文描述了如何测定机会性病原菌P. aeruginosa的毒力，并详细说明了如何量化浮游（游动）状态和附着于表面的亚群的毒力。本方案可经调整后用于检测其他细菌的毒力。在代表性结果部分，我们展示出毒力在附着于表面的细胞中被激活，而在浮游细胞中则处于较低水平，这一现象此前已有报道¹³。毒力被激活的表面附着型P. aeruginosa可杀死阿米巴原虫，而无毒力的浮游细胞则会被阿米巴原虫吞噬。若仅需检测浮游细菌的毒力，则可将细菌培养于普通培养管中，而不必如本方案所述使用培养皿。

阿米巴原虫和P. aeruginosa的培养生长必须协调进行，以确保在阿米巴原虫处于营养丰富的条件下稳定生长时，P. aeruginosa培养物达到预期的生长阶段。通常需要在阿米巴原虫与细菌混合前至少1天对其进行稀释。阿米巴原虫与细菌通过琼脂垫固定，共同孵育1小时，并使用低分辨率（10X，数值孔径0.3）物镜、绿色荧光蛋白（GFP）滤光片及成像相机进行成像。分析可使用免费的ImageJ软件或自定义的图像分析软件完成。我们的分析采用自行编写的软件，基于一种科学分析软件包¹³。该软件应利用相差图像生成掩膜，并从荧光图像的掩膜区域中提取荧光值。荧光值需至少在100个细胞上取平均，从而获得一个数值化的宿主杀伤指数。

方案

所有实验操作均在加利福尼亚大学欧文分校进行。

1. 缓冲液与溶液

1. 在1 L玻璃瓶中制备LB（Lysogeny Broth）培养基：将25 g LB-Miller培养基粉末加入1 L双蒸水（ddH₂O）中。若用于制备培养皿，额外加入20 g琼脂。经高压灭菌后，在10 cm直径的培养皿中各倒入25 mL熔融琼脂培养基，并于室温下静置凝固。液体培养基室温保存，琼脂平板4 °C保存。
2. 在1 L玻璃瓶中制备葡萄糖酵母蛋白胨（GYP）平板：将1 g D-葡萄糖、2 g蛋白胨、0.25 g酵母提取物、4.2 g KH₂PO₄、5.1 g Na₂HPO₄·7H₂O和25 g琼脂溶于1 L双蒸水（ddH₂O）中，混合均匀。高压灭菌后，在10 cm直径的培养皿中各倒入25 mL熔融琼脂，室温下静置凝固。4 °C保存。
3. 在1 L玻璃瓶中制备PS（Peptone S）培养基：将10 g蛋白胨、7 g酵母提取物、15 g D-葡萄糖、0.12 g Na₂HPO₄·7H₂O、1.4 g KH₂PO₄、40 µg维生素B₁₂和80 µg叶酸加入800 mL双蒸水（ddH₂O）中混合。若pH计超过一天未使用，需使用pH 4和pH 7标准缓冲液校准电子pH计。
   1. 使用pH计测定PS培养基的pH值，根据需要缓慢加入5 M KOH或5 M H₃PO₄，调节pH至6.5。用双蒸水（ddH₂O）定容至1 L。使用0.22 µm真空滤器过滤灭菌，4 °C保存。
      注意：进行pH调节时应谨慎操作，佩戴防护装备，包括手套、防护服、眼部防护和面部防护。
4. 在1 L玻璃瓶中制备10倍浓缩发育缓冲液Prime（10x DB'）：加入3.4 g KH₂PO₄、13.4 g Na₂HPO₄·7H₂O，并用双蒸水（ddH₂O）定容至800 mL。若pH计超过一天未使用，需使用pH 4和pH 7标准缓冲液校准电子pH计。
   1. 使用电子pH计测定缓冲液的pH值，根据需要缓慢加入5 M KOH或5 M H₃PO₄，调节pH至6.5。用双蒸水（ddH₂O）定容至1 L，并通过高压灭菌进行灭菌。室温保存。
      注意：进行pH调节时应谨慎操作，佩戴防护装备，包括手套、防护服、眼部防护和面部防护。
5. 制备1倍发育缓冲液（1x DB）：在1 L玻璃瓶中，将100 mL 10x DB'缓冲液与1 mL灭菌的2 M MgCl₂和1 mL灭菌的1 M CaCl₂混合，用高压灭菌的双蒸水（ddH₂O）定容至1 L。室温保存。
6. 在1 L玻璃瓶中制备PS:DB培养基：将100 mL灭菌PS培养基、100 mL灭菌10x DB'缓冲液与灭菌双蒸水（ddH₂O）混合至总体积为1 L。补充1 mL灭菌2 M MgCl₂和1 mL灭菌1 M CaCl₂。4 °C保存。
7. 制备钙黄绿素-AM（calcein-AM）储备液：将50 µL DMSO加入厂家提供的塑料容器中，溶解50 µg钙黄绿素-AM。-20 °C保存。

2. 变形虫的培养与维持

1. 培养 E. coli B/r 型菌株¹⁷ 作为阿米巴原虫在初始生长期的食物来源。划线接种 E. coli 从-80 °C保存的冻存菌种中挑取单菌落，接种至LB琼脂平板，37 °C过夜培养以获得单菌落。
2. 接种单个菌落 E. coli 将B/r接种至2 mL LB培养基中，37 °C条件下在滚筒摇床或摇床中过夜培养。
3. 过夜后取出 E. coli 将培养物恢复至室温。使用木棒从保存在 -80 °C 的冻存菌种中接种阿米巴至 750 µL 过夜培养物中。
   注意：使用 D. discoideum 菌株AX3，具有无菌生长能力¹⁸此步骤不需要无菌培养，但后续步骤将有此要求。
4. 立即加入 700 µL 的阿米巴-E. coli 将混合物涂布于葡萄糖酵母蛋白胨（GYP）平板上。通过前后和左右倾斜平板，使培养物在平板表面均匀分布。避免使用涂布棒。
5. 将GYP平板倒置于可保持高湿度的盒子中。使用两个一次性塑料容器（183 cm × 183 cm × 91 cm）上下堆叠，将底部容器加入约25 mL水，并将上层容器底部钻出数个直径为0.5 cm的小孔，使水分可从下层水槽向上层容器扩散。
6. 将GYP平板和盒子在22 °C孵育4 - 5天 平板表面出现阿米巴孢子生长所需的天数（图2使用冷藏培养箱孵育平板，而非在室温下孵育。
   ​注意：孢子生长后，若将平板储存于 4 °C，可保持数周的活性。储存时应将平板倒置（琼脂面朝上）。培养 3 - 4 天后，可在细菌菌苔中观察到透明圈区域，表明阿米巴孢子形成开始。
   1. 孵育4至5天后，在培养皿表面观察到微小的变形虫孢子（图2).
      注意：不要将阿米巴培养超过一周，因为 孢子的质量在此时间之后下降。
7. 用无菌的1 mL移液器枪头平行于培养皿表面刮取变形虫孢子，以准备变形虫的无菌培养。从一个10 cm培养皿的一半区域收集孢子。
   注意：避免让枪头接触琼脂平板表面，因为这种操作会收集到大量菌体 E. coli.
8. 用移液器枪头浸入1 mL PS培养基中，轻轻吹打，使枪头尖端的阿米巴原虫重悬。
9. 将接种后的混合物转移至含有25 mL PS培养基的250 mL锥形瓶中，该培养基已添加抗生素-抗真菌素溶液，浓度为0.25倍。
   注意：将抗生素-抗真菌素溶液以250 µL分装于-20 °C保存。避免反复冻融此溶液，以免降低其效价。
10. 在22 °C、100 rpm振荡条件下，将阿米巴原虫进行无菌培养。在步骤5的毒力测定中，将细胞培养至600 nm处测得的光密度（OD₆₀₀0.2 至 0.5
    注意：此步骤需要从接种时（步骤 2.7）起培养 3 - 4 天。若细胞密度过高，需用 PS 培养基将培养物稀释至 OD₆₀₀ 0.05 或更低，然后恢复生长至 OD₆₀₀ 0.2 到 0.5

3. 生长 P. aeruginosa

1. 从 LB 平板上挑取一单个 P. aeruginosa 菌落，接种至 2 mL PS:DB 培养基中，于 37 °C 过夜培养至饱和状态。
   注意：PS:DB 培养基中不要添加抗生素-抗真菌素溶液。
2. 将过夜培养物按 1:100 或 1:1,000 的比例用 PS:DB 培养基稀释后，接种于直径 6 cm 的培养皿中。若仅检测浮游细胞的毒力，则应使用常规培养管进行培养。将培养物置于台式旋转摇床，37 °C、100 rpm 振荡培养。
3. 在特定时间点收获培养物，以确保实验可重复性。在检测毒力前 30 分钟至 1 小时，按第 4 节所述方法制备琼脂垫。
   注意：P. aeruginosa 的毒力通常在表面培养约 8 小时后被诱导产生。
4. 为分离表面附着细胞，从培养皿中移除液体培养基，立即用 1 mL DB 缓冲液清洗，以去除浮游细胞，随后立即进行步骤 5.1。
   警告：清洗时间不得超过 30 秒，否则会扰动并使表面附着细胞脱落，可能影响毒力测定结果。
5. 为分离浮游细胞，从培养皿中转移 10 µL 培养液至新的洁净培养皿中，随后立即进行步骤 5.1。

4. 显微镜观察——琼脂垫的制备

1. 在阿米巴准备与混合前约30分钟至1小时制备琼脂垫 P. aeruginosa.
2. 在250 mL锥形瓶中，将50 mL含1% (w/v) 琼脂的DB缓冲液微波加热。每20秒摇匀一次，直至琼脂结块完全消失。
3. 将熔化的琼脂放入预热至55 °C的水浴中冷却15分钟。
4. 在锥形管中，将15 µL的钙黄绿素-AM储备液加入15 mL熔化的琼脂中。轻轻倒置管子4–5次以混匀，并立即进行下一步操作。
   注意：此步骤需在聚丙烯15 mL离心管中进行。请勿使用厚壁玻璃容器，否则会导致琼脂凝固过快。
5. 将熔化的琼脂混合物倒入一块12 cm × 10 cm的玻璃板上，室温下静置10分钟，使琼脂凝固。将玻璃板置于印有网格的纸上，使用金属直尺沿网格线切割凝固的琼脂垫，切成若干个1.5 cm × 1.5 cm的小片。
6. 将凝胶置于湿盒中保持湿润，直至准备使用。

5. 显微镜观察——用于成像的细菌-阿米巴样品制备

1. 为检测表面附着细菌细胞的毒力，将步骤 2.10 中的 10 µL 阿米巴细胞加入步骤 3.4 中的表面附着细菌中。
   注意：此步骤描述了将阿米巴细胞与细菌混合的过程。
2. 为检测浮游细胞的毒力，将步骤 2.10 中的 10 µL 阿米巴细胞与步骤 3.5 中的 10 µL 浮游细菌混合。
   注意：在与细菌混合前，不要洗涤无菌培养的阿米巴细胞（OD₆₀₀ 为 0.2 至 0.5）。由于使用了抗生素-抗真菌素溶液，阿米巴培养物中不会观察到 E. coli 的生长。
3. 立即将步骤 4.5 中制备的 1.5 cm × 1.5 cm 钙黄绿素-AM 琼脂垫置于培养皿表面的细菌-阿米巴混合物上方。
   注意：使用快速平稳的动作将琼脂垫放置在混合物上。切勿缓慢放下琼脂垫，因为该动作容易将细胞推向边缘，并远离琼脂垫的底面。此步骤可确保细菌和阿米巴细胞均匀混合、固定，并使两种细胞类型均限制在同一平面上。
4. 用移液器轻轻吸除琼脂垫周围残留的多余液体。将培养皿在室温下干燥 20 分钟。
5. 盖上培养皿盖，将固定的阿米巴-细菌混合物在室温下继续孵育 40 分钟。随后进行步骤 6.1。
   注意：所有样品的孵育时间必须保持一致，因为背景荧光会随时间增加。建议总孵育时间为 1 小时。超过 1 小时的孵育重复性较差，因为阿米巴细胞可能开始破裂。

6. 显微镜——图像采集

1. 使用能够获取明场和绿色荧光图像的荧光显微镜对变形虫进行成像。对于绿色荧光，使用绿色荧光蛋白（GFP）滤光片，激发光波长为474/27 nm，发射光波长为525/45 nm。使用10X （数值孔径≥0.3）物镜对变形虫进行成像。
   注意：琼脂中的钙黄绿素-AM会导致死亡的变形虫在绿色荧光通道中发出荧光，而健康的变形虫则无荧光。
2. 调整相差、GFP通道的采集时间，以减少光毒性，并优化图像强度的动态范围。如有必要，可使用微分干涉差（DIC）相差成像替代。
   注意：尽量将相差和GFP荧光的曝光时间设置为100–200 ms。在整个实验过程中保持曝光参数和仪器设置不变，这对于计算宿主杀伤指数至关重要。
3. 为获得用于计算宿主杀伤指数的可靠统计数据，需至少采集100个变形虫细胞的图像。

7. 图像分析与宿主杀伤指数

1. 使用 ImageJ 进行图像分析。
2. 通过点击 文件 | 打开 并选择图像，在 ImageJ 中打开相差图像文件。通过点击 图像 | 分析 | 设定阈值 调整阈值。调节下限和上限阈值，仅选择强度峰值区域（图 3A）。
3. 点击 处理 | 二值化 | 转为二值图像 将图像转换为二值图像。选择 处理 | 二值化 | 填充孔洞 填充孔洞。
   注：以 图 1 中的图像为源，步骤 7.1–7.2 将生成一幅图像，其中变形虫和附着于表面的细菌呈现为暗区（图 3B）。
4. 在 分析 | 设定测量值 中，确保勾选 面积 和 平均灰度值 选项。使用主工具栏中的椭圆工具，选择代表性变形虫区域。点击 分析 | 测量，记录代表性变形虫的面积。
5. 点击 分析 | 分析粒子，创建变形虫的掩膜。在“大小”输入框中，输入可包含变形虫但排除细菌的面积范围。在 显示选项 的下拉菜单中选择 掩膜。确保勾选 添加到管理器 选项。
6. 点击 确定，将显示仅包含变形虫的图像，并弹出 ROI 管理器对话框（图 3C）。
7. 使用 文件 | 打开 选择并打开荧光图像文件。在 ROI 管理器 中，按住 Shift 键并依次点击列表中的每一项，以选中所有区域（图 3D）。
8. 点击 ROI 管理器 中的 测量 按钮。这将打开一个结果窗口，显示每个变形虫的平均荧光强度值。
9. 将每个变形虫的荧光强度值复制到电子表格程序中，并通过计算所有荧光值的平均值来得出宿主杀伤指数。

结果

我们在直径6 cm的培养皿中培养野生型P. aeruginosa菌株PA14¹⁹或相同PA14背景下的ΔlasR突变菌株²⁰，并检测了浮游状态细胞和附着于表面细胞的毒力。培养物从单菌落接种至PS:DB培养基中，在37 °C条件下于旋转滚筒中培养过夜至饱和，随后以1:100比例转接至PS:DB培养基，在直径6 cm的培养皿中于100 rpm振荡条件下培养8小时，浮游态和表面附着态的P. aeruginosa亚群按第3节所述方法分离。

附着在表面的野生型P. aeruginosa杀死了变形虫，表现为变形虫细胞呈圆形，并观察到钙黄绿素荧光（图4A，左上图）。这导致宿主杀伤指数较高（

讨论

本方案描述了一种快速且定量检测铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）毒力的方法。该方案也可用于其他细菌的检测。但需要注意的是，所使用的培养基应与阿米巴原虫的生长条件相容。特别是，我们已使用PS:DB作为细菌培养基对本方案进行了优化。若使用其他培养基，则可能需要设置仅含培养基而不含细菌细胞的对照组，以验证该培养基是否适合阿米巴原虫的生长。

该方法可扩展用于检测毒力与细菌生长阶段的依赖关系。具体而言，可将细菌培养不同时间，而非固定在一个时间点。根据我们的经验，重要的是在特定时间点收获细菌培养物，因为铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）的毒力似乎依赖于其生长阶段。我们观察到，在培养皿中培养6至8小时之间，铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）的毒力被诱导产生。

与生长环境相关的许多变量会影响宿主健康和细菌毒力。因此，每个实验都必须使用适当的阳性和阴性对照。我们已使用野生型表面附着 P. aeruginosa 作为阳性对照和ΔlasR

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂
Bacto琼脂，脱水	BD Difco	214010
抗生素-抗真菌素（100X）	Life Technologies	15240062	分装 < 1 mL 并于 -20 °C 保存
钙黄绿素-乙酰氧基甲酯（calcein-AM）	Life Technologies	C34852	钙黄绿素乙酰氧基甲基（AM）
氯化钙，无水	Sigma-Aldrich	C1016
D-葡萄糖	Fisher Chemical	D16500	右旋糖
二甲基亚砜	Sigma-Aldrich	D5879
叶酸	Sigma-Aldrich	F8758
LB-Miller	BD Difco	244620
氯化镁	Sigma-Aldrich	M8266
酵母提取物	Oxoid	LP0021
特殊蛋白胨	Oxoid	LP0072
氢氧化钾	Fisher Chemical	P250
磷酸二氢钾	Sigma-Aldrich	P0662
七水合磷酸氢二钠	Fisher Chemical	S373
维生素B12	Sigma-Aldrich	V2876
菌株
Dictyostelium discoideum	Siryaporn 实验室	菌株 AX318
Escherichia coli	Siryaporn 实验室	菌株 B/r17
Pseudomonas aeruginosa	Siryaporn 实验室	PA14	PA14 菌株19
Pseudomonas aeruginosa ΔlasR	Siryaporn 实验室	AFS20.1	源自PA14的菌株20
耗材
0.22 µm 滤膜	Millipore	SCGPT01RE	用于过滤除菌
15 mL 锥形管	Corning	352097
玻璃储存瓶	Pyrex	13951L	250 mL、500 mL、1000 mL
6 cm 直径培养皿	Corning	351007	60 × 15 mm 聚苯乙烯培养皿
10 cm 直径培养皿	Fisher	FB0875712	100 × 15 mm 聚苯乙烯培养皿
带盖塑料容器	Ziploc	2.57E+09	方形3杯容量容器
玻璃板	Bio-Rad	1653308	用于制备琼脂垫。其他具有相似尺寸的玻璃板也可使用。
木棒	Fisher	23-400-102
设备
Eclipse Ti-E 显微镜	Nikon	MEA53100	显微镜系统
10X Plan Fluor Ph1 物镜  0.3 NA	Nikon	MRH20101	显微镜系统
荧光激发光源	Lumencor	Sola light engine	显微镜系统
荧光滤光片组	Semrock	LED-DA/FI/TX-3X3M-A-000	显微镜系统
Orca Flash 4.0 V2 相机	Hamamatsu	77054098	显微镜系统
ImageJ	NIH	v. 1.49	图像分析软件
MATLAB	Mathworks	R2013	图像分析软件
轨道摇床培养箱	VWR	89032-092	用于在 37 °C 下培养细菌
平台摇床	Fisher	13-687-700	用于在 22 °C 下培养变形虫
分光光度计	Biochrom	Ultrospec 10
台下式冷藏培养箱	Fisher	97990E	用于在 22 °C 下培养变形虫
Isotemp 水浴锅	Fisher	15-462-21Q	用于将培养基冷却至 55 °C