一种通过高频刺激激活小鼠齿状回的侵入性方法

摘要

本方案展示了如何在小鼠中建立可靠的高频刺激（HFS）方法。通过HFS直接和间接地对海马齿状回中的神经元进行电刺激。 体内神经元活动和分子信号传导通过以下方式检测 c-fos 以及Notch1免疫荧光染色；神经发生通过溴脱氧尿苷标记实验进行定量。

摘要

利用植入电极针对不同脑区进行的高频电刺激（HFS）已被证实是治疗多种神经性和精神类疾病的有效方法。针对脑深部区域的高频刺激，即脑深部电刺激（DBS），在临床试验中正变得越来越重要。近年来，高频脑深部电刺激（HF-DBS）手术领域的进展开始将这种侵入性技术的应用拓展至其他领域，例如重度抑郁症（MDD）、强迫症（OCD）等疾病的治疗。

尽管适应症不断扩展，高频深部脑刺激（HF-DBS）产生有益效应的潜在机制仍不明确。为解决这一问题，一种方法是使用植入式电极，通过高频刺激（HFS）稀疏激活分布于不同区域的神经元亚群。已有报道表明，丘脑前核的高频刺激在临床上可用于治疗难治性癫痫。其潜在机制可能与神经发生增加和神经元活动改变有关。因此，我们感兴趣的是，在小鼠齿状回（DG）中，通过检测高频刺激（HFS）治疗前后神经元活动及神经发生的变化，来探索其生理学改变。

在本文中，我们描述了在小鼠中以急性或慢性方式直接或间接靶向激活齿状回（DG）的高频刺激（HFS）方法。此外，我们还详细阐述了用于制备脑切片的实验方案，以进行c-fos和Notch1免疫荧光染色来监测神经元活动及信号通路的激活，并通过溴脱氧尿苷（BrdU）标记来确定高频深部脑刺激（HF-DBS）诱导后的神经发生情况。HF-DBS处理后神经元活动的激活和神经发生的增加提供了直接的神经生物学证据，并具有潜在的治疗益处。特别是，该方法可经修改后应用于靶向其他感兴趣的脑区，如基底神经节和丘脑下核区域，以针对临床特定的脑部疾病开展研究。

引言

高频深部脑刺激（HF-DBS）是一种用于脑内电刺激的神经外科技术，自19世纪70年代以来不断发展¹。20世纪80年代末，高频刺激（HFS）首次被用作帕金森病及其他运动障碍类疾病的潜在治疗干预手段²。在过去的几十年中，HF-DBS被越来越广泛地应用于目前传统治疗策略无法治愈的脑部疾病。特别是由于HFS电极精准度的提高、疗效显著以及副作用极小，过去几十年中接受HF-DBS治疗的脑部疾病种类显著增加^3,4,5。例如，HF-DBS已获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准，用于治疗帕金森病（PD）、阿尔茨海默型痴呆、原发性震颤及其他类型的运动障碍^2,6,7。在帕金森病患者中，接受HF-DBS治疗期间多巴胺能药物的使用量可减少达50%⁸。除了在运动障碍治疗中取得成功外，HF-DBS在临床中也显示出对精神疾病治疗以及认知增强的强大作用^2,9,10,11。值得注意的是，HFS用于治疗其他精神障碍的研究目前正处于不同阶段，为患者带来了巨大希望¹²。

尽管许多研究已表明，局灶性高频刺激（HFS）在整个大脑中均具有局部和远端效应¹³，其神经生物学和分子机制仍不明确^2,14在临床中，治疗性高频深部脑刺激（HF-DBS）通常长期用于帕金森病和慢性疼痛的治疗。 等等。 关于高频深部脑刺激（HF-DBS）治疗产生疗效的机制，存在多种观点。其中一种可能是，高频刺激（HFS）电流通过反复去极化植入电极周围区域的轴突，从而调节神经元网络活动。此外，HF-DBS 可能改变输出神经元及其投射靶区的放电频率。同时，HF-DBS 还可能引发长期的突触可塑性改变，包括长时程增强（LTP）和长时程抑制（LTD），这些变化可能有助于症状的改善。然而，目前尚不清楚 HFS 是否影响调控成体神经发生等细胞过程的关键分子事件。 体内多项研究表明，啮齿类动物中的高频刺激（HFS）能够模拟临床应用的深部脑刺激（DBS）所产生的类似神经反应。^15,16为了理解高频深部脑刺激（HF-DBS）的潜在细胞机制，本研究首先建立了一个 体内 在小鼠中以急性（一天）或慢性（五天）方式进行HFS方法学研究。其次，我们建立了激活分析方法学，以确定HF-DBS干预后神经元活动及神经发生的改变。

由于神经干细胞在胚胎发育期间产生神经元的能力较强，且这一过程在成年期持续进行，海马体齿状回的亚颗粒层是成年神经发生的主要区域之一。神经发生过程受到多种生理和病理因素的影响。在某些癫痫病例中，海马体神经发生显著减少^17,18。此外，单次电休克治疗可显著增加齿状回的神经元生成¹⁹。这些观察结果表明，电生理活动在调控成年神经发生及海马神经元突触可塑性中起着关键作用。因此，为了进一步阐明高频深部脑刺激（HF-DBS）对神经元活动和神经发生的影响，我们首先开展即刻早期基因（IEG）c-fos的免疫染色实验，该基因是反映经验诱导的短期神经元活动的公认标志物²⁰。同时检测Notch1信号通路，以监测高频刺激（HFS）施加后的信号激活情况^21,22。此外，我们还通过多种方式在HF-DBS诱导后进行BrdU标记分析，以检测神经元的生成情况，尽管BrdU染色也可作为胶质发生的一个标志。

在本研究中，采用两种高频刺激（HFS）方法，分别直接和间接靶向激活海马齿状回（DG）。电极可直接植入DG，或植入内侧穿通通路（medial perforant path, PP），后者通过投射激活DG神经元。对于高频深部脑刺激（HF-DBS）的诱导，采用可编程刺激器进行持续刺激。 通过 将固定电极置于小鼠头部。为了确定高频刺激（HFS）对神经元激活和神经发生的影响，我们检测了以下指标的表达水平： c-fos 并通过免疫荧光染色检测海马DG区Notch1的表达以及BrdU掺入阳性神经元的数量，以评估HFS处理后的神经发生情况。特别地，分别比较了高频深部脑刺激（HF-DBS）在急性与慢性刺激模式下，以及直接与间接刺激模式下对DG区神经发生的影响。

方案

动物实验程序遵循中国北京基础医学研究所（中国北京）的机构指南以及中国政府关于实验动物护理和使用的法规。小鼠（成年雄性，26 ~ 30 g）饲养于恒温23 °C环境中，并自由获取水和食物 随意摄取在12小时光照/12小时黑暗循环条件下饲养（光照开启时间为上午7:00）。所有实验操作均在光照周期内进行。

1. 手术准备

注意：自定义电极采用 Halpern 报告中所述方法稍作修改后自行制备²³。

1. 使用2根铜微丝（外径为200 µm）作为平行双极电极。将电极相互缠绕，形成用于刺激的圆柱形电极。
   注意：此处电极在PP或DG内的长度根据核团的解剖深度进行调整。
2. 使用环氧乙烷消毒柜对电极进行灭菌。操作和储存自制的双通道微丝电极时应避免任何污染。在任何外科植入手术前，电极必须严格灭菌。
3. 对手术器械进行高压灭菌。
4. 手术前，通过腹腔注射戊巴比妥钠（20 - 50 mg/kg），使小鼠达到外科麻醉水平。
5. 向小鼠注射无菌普鲁卡因青霉素G混悬液（75,000 U，肌内注射）和镇痛剂（卡洛芬，0.05 - 1 mg/kg，皮下注射），分别以降低感染和疼痛的风险²⁴。
6. 动物麻醉后，在双眼涂抹眼用润滑剂，防止角膜干燥。通过夹捏脚趾时动物的反射情况判断镇静和麻醉深度，仅在无反应时开始手术。
   注意：兽用眼膏是防止眼睛干燥的另一种选择。
7. 使用电动剃毛器或剃须刀片剃除小鼠头部顶部大部分毛发，用70%酒精和碘伏溶液交替擦拭三次对剃毛区域进行消毒，并在碘伏干燥后开始手术。

2. 高频刺激手术^25,26

注意：在此步骤中，将电极单侧植入背侧齿状回（DG）或内侧内嗅皮层（PP）区域，这些区域是海马体的一部分，在情景学习和记忆中具有关键作用。

1. 将麻醉后的小鼠置于立体定位仪上。为固定小鼠头部，应正确对齐耳杆并迅速安装。轻柔拧紧耳杆，使其支撑居中头部并轻微固定小鼠。
2. 使用恒温垫将动物体温维持在 37 ± 0.5 °C。
3. 用镊子夹住小鼠耳前的皮肤，用灭菌剪刀剪开，去除约1厘米的皮肤² 小鼠颅骨顶部的皮肤区域。
   注意：可在切开的皮肤边缘观察到少量出血。
4. 用棉签去除颅骨表面的肌肉和其他附着物，暴露颅骨表面。使用棉签和解剖凿彻底清除颅骨表面的所有骨膜、肌腱和结缔组织，以清晰辨认矢状缝和人字缝。
5. 确定前囟点（bregma）和后囟点（lambda）。前囟点位于颅顶上方中线处冠状缝与矢状缝的交点。后囟点位于人字缝与矢状缝的交汇处。以前囟点作为原点，用于确定其他核团的位置。
6. 在确定颅骨上的前囟（bregma）和后囟（lambda）位置后，将这两点调整至水平位置。确保这两点在背腹方向上的高度基本一致（任何误差应 < 0.05 mm）。同时，以相同方式确保颅骨在内侧-外侧方向上保持水平²⁶.
7. 对于单侧手术，将自制的双通道铜丝微电极安装到立体定向手术架的旋转电极夹持器上。
8. 首先将电极垂直置于前囟点上方，并设为原点位置。使用数显立体定位仪确定前后（AP）、内外（ML）和背腹（DV）坐标。
   注意：为防止电极弯曲，操作过程中切勿使电极尖端接触颅骨。
9. 将电极轻柔地移动至正确位置（图1A，DG 区为 AP-2.1/ML ± 1.0，PP 区为 AP-3.8/ML ± 3.0²⁷ 颅骨上方无任何接触。确定电极插入位点后，使用背腹向立体定位调节装置抬高电极 holder，并用黑色记号笔标记该位置。
   注意：相对于立体定位坐标的精确位置可能因小鼠品系、体重和性别而异。应使用同性别成年小鼠以尽量减少位置差异。如有可能，应通过术前解剖学扫描在个体受试者基础上确定目标位置²⁷.
10. 使用手持式显微操作仪辅助的钻头（钻孔直径 = 0.5 mm）在标记位置精确钻孔。钻孔前用70%乙醇对钻头尖端进行消毒。沿Z轴方向将微型钻头向上移动0.8–1.0 mm穿过颅骨，X-Y位置保持不变。手术过程中使用无菌棉球止血。
    注意：为避免钻孔过程中过度钻削和产生过多热量，应确保钻速为15,000 - 18,000转/分钟（RPM），并每隔8 - 10秒频繁将钻头从骨窗中退出。
11. 继续钻孔直至暴露硬脑膜。使用弯针清除钻孔过程中产生的骨屑，并在硬脑膜上刺出一个小孔，注意不要损伤下方的软脑组织。
    注意：为避免损伤脑组织，弯曲的钝头针也可替换为精细的钝头镊子。
12. 为确认钻孔是否已准确位于目标位置，需通过调整立体定位手术架降低电极高度，确保电极可顺利穿过颅骨钻孔，且不接触任何障碍物。若条件满足，则将电极缓慢插入至目标深度，从内侧副乳头体（PP）至齿状回（DG）（PP-DG）区域，齿状回（DG）插入深度为1.8 mm，副乳头体（PP）插入深度为3.0 mm。
    注意：在电极植入过程中，使用无菌棉拭子擦去钻孔处溢出的脑脊液或血液。
13. 将微丝电极插入颅骨孔后，使用小刮刀取适量牙科水泥固定电极。待水泥逐渐变稠时，将其塑形，包裹电极及颅骨螺钉，形成光滑平整的保护帽。清创并消毒伤口边缘。
14. 将电极从电极夹持器上取下。将小鼠从立体定位仪上移除，并放回温暖的饲养笼中。
    注意：手术后，需等待动物从麻醉中充分恢复意识后，方可将其放回笼中。
15. 让小鼠自由活动，并在笼中恢复2天。然后，将植入小鼠脑内的电极连接至可编程刺激器。 通过 导联。按照所示设置软件界面 图2设置HFS参数为6组，每组6串，每串6个脉冲，频率为400 Hz（图1B，组间间隔100毫秒，系列间间隔20秒²⁸将刺激强度设置为 200 μA。
16. 按照设定的时间持续给予HFS刺激。每天给予2次刺激，分别在上午8:00和晚上8:00进行。
17. 对照组小鼠植入电极但不进行刺激。
18. 对于 c-fos 染色，对实验小鼠进行急性刺激（每天2次）。对于BrdU标记，将实验小鼠分为急性刺激组（每天施加2次）和慢性刺激组（5天内施加10次，每天2次）。在刺激过程中，确保小鼠处于清醒状态。注意确保导线未发生扭转。
    注意：在实验程序的最后一天，急性刺激组的小鼠被同时进行刺激。
19. 刺激结束后，小心地将电极针从电极夹持器和记录系统的连接器上断开。

3. 免疫荧光染色与溴脱氧尿苷标记²⁹

1. 对于 c-fos 在最后一次高频深部脑刺激（HF-DBS）后约3小时，通过腹腔注射戊巴比妥（20–50 mg/kg，I.P.）麻醉小鼠，使其达到外科手术麻醉水平，随后进行Notch1染色。
2. BrdU标记：在最后一次高频深部脑刺激（HF-DBS）后约12小时，以2小时为间隔，向对照组和刺激组小鼠分别给予6次BrdU注射（50 mg/kg，溶于0.9%生理盐水，腹腔注射）。末次注射后36小时，通过腹腔注射戊巴比妥（20 - 50 mg/kg）麻醉小鼠，使其达到手术麻醉水平。
3. 使用手术刀在肋骨处切开，暴露心脏，随后将一根22号钝头灌注针插入左心室。在右心房处做一小切口。经心脏灌注50 mL冰冷的磷酸盐缓冲液（PBS），随后灌注50 mL冰冷的含4%多聚甲醛（PFA）的1×PBS溶液（pH 7.4）。
   注意：当小鼠血液被PFA替换时，将PBS切换为PFA 体内 被替换，直至流出液体变澄清。良好的灌注可通过肝脏变清来判断。一旦观察到固定震颤，即应停止灌注。³⁰.
4. 用眼科剪将小鼠断头，于皮肤上做切口并暴露颅骨。用镊子轻微敲除部分颅骨，小心剥离出完整的小鼠脑组织。将脑组织在4%多聚甲醛中后固定2天，随后转移至4 °C的30%蔗糖溶液中过夜。
5. 使用冷冻切片机将脑组织切成20 µm厚的冠状切片。用毛笔转移切片并贴附于载玻片上，于-20 °C保存。
   注意：电极位置错误或机械损伤过重的动物将被排除在后续分析之外。
6. 将切片转移至不含固定剂的常规 PBS（0.1 M，pH 7.4）中。用 PBS 洗涤切片，每次 5 分钟，重复 3–4 次，以去除残留的固定剂。对于 BrdU 标记组，将切片在 2 N HCl 中 37 °C 孵育 30 分钟，然后在 0.1 M 硼酸盐缓冲液（pH 8.4，10 分钟）中漂洗。随后用 PBS 洗涤切片 2 次，每次 5 分钟。
   注意：随后进行免疫染色。
7. 用封闭液（1% 正常山羊血清，3% 牛血清白蛋白）孵育切片 <BSA> ，0.5% Triton X-100 和 0.02% 叠氮化钠的 1×PBS 溶液中，室温（RT）孵育 1 小时。
8. 将切片与抗-c-fos 多克隆抗体（1:500；兔源）、抗 Notch1 抗体（1:50；山羊源）或抗 BrdU 抗体（1:800；大鼠源），加入封闭液中，4 °C 过夜孵育。
9. 用 PBS 清洗切片 3 次，然后在室温下用 Alexa Fluor 568 标记的山羊抗兔 IgG（1:500）、Alexa Fluor 488 标记的驴抗山羊 IgG（1:1,000）或 Alexa Fluor 488 标记的驴抗大鼠 IgG（1:500）二抗孵育 1 小时。
10. 用 PBS 洗涤样本 3 次（每次 10 分钟）。使用含 DAPI 的抗荧光淬灭封片剂覆盖免疫标记的脑切片。将切片自然晾干，避光保存于 4 °C。
11. 使用高分辨率多通道（连续）扫描共聚焦显微镜，获取脑组织中受刺激侧与未受刺激侧海马区域的图像。对照组与实验组的成像参数应保持一致。
12. 使用高倍物镜（20倍空气物镜，数值孔径0.45）进行马赛克成像，通过电动载物台获取相邻视野的连续三维（XYZ）图像，并利用适当的软件将这些图像拼接，生成大范围的复合图像。
    注：拼接功能包含真实的拼接与平滑选项，可优化无缝图像效果。使用拼接功能可快速、简便地制备复合图像，以覆盖大范围区域。
13. 对于 c-fos 并进行 Notch1 染色，对免疫荧光密度进行阳性核的定量分析²¹ 拼接图像的。在海马齿状回的头侧、背侧和腹侧亚区中随机选择3个区域，以双盲方式测量免疫荧光密度，使用 Image J 软件（http://rsb.info.nih.gov/ij/）³¹.
14. 对于BrdU标记，以双盲方式分析穿过背侧海马（相对于前囟-1.7 mm至-2.7 mm）钻孔点周围的脑切片。
15. 仅计数齿状回（DG）中 BrdU 阳性的神经元。计数时应包括位于颗粒细胞层内 2 个细胞直径范围内的细胞。
    注意：此处使用40倍空气镜进行计数。每只动物随机选取3–5个脑片进行计数，取平均值并表示为每齿状回（DG）的平均数¹⁹.

结果

直接对海马齿状回（DG）亚区进行高频深部脑刺激（HF-DBS），或刺激穿通通路（PP）亚区以间接激活DG 通过 使用立体定位调整插入电极后，用戊巴比妥麻醉啮齿类动物，并在最后一次高频深部脑刺激（HF-DBS）刺激后3小时采样 c-fos 以及 Notch1 免疫染色。对于 BrdU 染色，在 HF-DBS 刺激 1 天或 5 天后，末次注射 BrdU 36 小时，用戊巴比妥麻醉啮齿动物以制备脑切片。 图3 表明表达的 c-fos 在DG的同侧显著增加。此外， c-fos 与未接受高频深部脑刺激（HF-DBS）的对照组相比，DG对侧的表达也上调，后者几乎不表达a c-fos 信号。根据脑切片中Notch1特异性的免疫荧光染色结果，如图所示 补充图1我们进一步证明，通过PP区神经元去极化的诱导，高频刺激（HFS）后也可激活成年海马齿状回（DG）中的Notch1信号通路（亦可参考作为原始数据提供的...

讨论

自20世纪90年代以来，高频深部脑刺激（HF-DBS）技术已被广泛用作治疗多种神经系统疾病的有效工具。迄今为止，HF-DBS的标志性应用在于治疗帕金森病和原发性震颤，这一进展在临床和科研领域均引起了广泛关注与兴趣。目前，多个研究团队正在开展多种类型的HF-DBS研究，探索其在特定神经及精神疾病治疗中的应用。^32,33一些研究目前正处于不同阶段的临床试验中^2,34尽管高频深部脑刺激（HF-DBS）应能带来显著益处，但即使在脑内定位完全准确的情况下，仍可能出现刺激相关的副作用，例如情绪和思维的负面改变。 等等。，这些反应是可逆的，通过调整刺激参数可以避免。

除了过去几十年临床试验积累的HF-DBS技术取得的重大进展外，在活体动物中开展HF-DBS研究也为理解电刺激所引发的生理变化和神经生物学机制提供了机会。在本论文中，我们描述了一种改良...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
脑立体定位仪	Stoelting	51730D	用于小鼠颅内立体定位植入
刺激器	A-M systems	Model 3800	MultiStim 8通道可编程刺激器
牙科钻机	Saeshin Precision Co., Ltd	STRONG 90	用于钻孔和开颅手术
环钻	Meisinger	HM1 005#	用于钻孔和开颅手术
Digidata 1550 数字转换器	Molecular Devices	AXON 1550	高分辨率数据采集
冷冻切片机	Thermo Fisher Scientific	Thermo Cryotome FSE	用于切割样本的冷冻切片
共聚焦显微镜	Olympus	FV-1200	日本制造，配备20倍物镜（NA 0.45）
小鼠手术器械	F.S.T.	14084-08,11254-20,16109-14	剪刀、镊子、骨剪、持针器等
戊巴比妥钠	R&D systems	4579	腹腔注射剂量为20–50 mg/kg
青霉素G	Sigma-Aldrich	P3032	肌内注射剂量为75,000 U
卡洛芬	Sigma-Aldrich	SML1713	皮下注射剂量为5–10 mg/kg
4% 多聚甲醛（PFA）	北京索莱宝科技有限公司	P1110	组织固定的储存液
磷酸盐缓冲液（PBS）	Invitrogen	10010023	pH 7.4，每瓶500 ml储存
Tissue-Tek O.C.T. 包埋剂	Sakura	4583	由水溶性乙二醇和树脂组成的配方
抗BrdU抗体	Abcam	ab6326	稀释比例：1/800
抗c-fos抗体	Abcam	ab209794	稀释比例：1/500
驴抗兔IgG（Alexa Fluor 568）	Thermo Fisher Scientific	A11036	稀释比例：1/500
驴抗大鼠IgG（Alexa Fluor 488）	Jackson ImmunoResearch	712-546-150	稀释比例：1/500
含DAPI的抗荧光淬灭封片剂	Vector Laboratories	H-1200	用于DAPI复染
抗Notch1抗体（C-20）	Santa Cruz Biotech	sc-6014	稀释比例：1/50
驴抗山羊IgG（Alexa Fluor 488）	Abcam	ab150073	稀释比例：1/1000