一种通过高频刺激激活小鼠齿状回的侵入性方法

摘要

本方案展示了如何在小鼠中建立可靠的高频刺激（HFS）方法。通过HFS直接和间接地对海马齿状回中的神经元进行电刺激。 体内神经元活动和分子信号传导通过以下方式检测 c-fos 以及Notch1免疫荧光染色；神经发生通过溴脱氧尿苷标记实验进行定量。

摘要

利用植入电极针对不同脑区进行的高频电刺激（HFS）已被证实是治疗多种神经性和精神类疾病的有效方法。针对脑深部区域的高频刺激，即脑深部电刺激（DBS），在临床试验中正变得越来越重要。近年来，高频脑深部电刺激（HF-DBS）手术领域的进展开始将这种侵入性技术的应用拓展至其他领域，例如重度抑郁症（MDD）、强迫症（OCD）等疾病的治疗。

尽管适应症不断扩展，高频深部脑刺激（HF-DBS）产生有益效应的潜在机制仍不明确。为解决这一问题，一种方法是使用植入式电极，通过高频刺激（HFS）稀疏激活分布于不同区域的神经元亚群。已有报道表明，丘脑前核的高频刺激在临床上可用于治疗难治性癫痫。其潜在机制可能与神经发生增加和神经元活动改变有关。因此，我们感兴趣的是，在小鼠齿状回（DG）中，通过检测高频刺激（HFS）治疗前后神经元活动及神经发生的变化，来探索其生理学改变。

在本文中，我们描述了在小鼠中以急性或慢性方式直接或间接靶向激活齿状回（DG）的高频刺激（HFS）方法。此外，我们还详细阐述了用于制备脑切片的实验方案，以进行c-fos和Notch1免疫荧光染色来监测神经元活动及信号通路的激活，并通过溴脱氧尿苷（BrdU）标记来确定高频深部脑刺激（HF-DBS）诱导后的神经发生情况。HF-DBS处理后神经元活动的激活和神经发生的增加提供了直接的神经生物学证据，并具有潜在的治疗益处。特别是，该方法可经修改后应用于靶向其他感兴趣的脑区，如基底神经节和丘脑下核区域，以针对临床特定的脑部疾病开展研究。

引言

高频深部脑刺激（HF-DBS）是一种用于脑内电刺激的神经外科技术，自19世纪70年代以来不断发展¹。20世纪80年代末，高频刺激（HFS）首次被用作帕金森病及其他运动障碍类疾病的潜在治疗干预手段²。在过去的几十年中，HF-DBS被越来越广泛地应用于目前传统治疗策略无法治愈的脑部疾病。特别是由于HFS电极精准度的提高、疗效显著以及副作用极小，过去几十年中接受HF-DBS治疗的脑部疾病种类显著增加^3,4,5。例如，HF-DBS已获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准，用于治疗帕金森病（PD）、阿尔茨海默型痴呆、原发性震颤及其他类型的运动障碍^2,6,7。在帕金森病患者中，接受HF-DBS治疗期间多巴胺能药物的使用量可减少达50%⁸。除了在运动障碍治疗中取得成功外，HF-DBS在临床中也显示出对精神疾病治疗以及认知增强的强大作用^2,

方案

动物实验程序遵循中国北京基础医学研究所（中国北京）的机构指南以及中国政府关于实验动物护理和使用的法规。小鼠（成年雄性，26 ~ 30 g）饲养于恒温23 °C环境中，并自由获取水和食物 随意摄取在12小时光照/12小时黑暗循环条件下饲养（光照开启时间为上午7:00）。所有实验操作均在光照周期内进行。

1. 手术准备

注意：自定义电极采用 Halpern 报告中所述方法稍作修改后自行制备²³。

1. 使用2根铜微丝（外径为200 µm）作为平行双极电极。将电极相互缠绕，形成用于刺激的圆柱形电极。
   注意：此处电极在PP或DG内的长度根据核团的解剖深度进行调整。
2. 使用环氧乙烷消毒柜对电极进行灭菌。操作和储存自制的双通道微丝电极时应避免任何污染。在任何外科植入手术前，电极必须严格灭菌。
3. 对手术器械进行高压灭菌。
4. 手术前，通过腹腔注射戊巴比妥钠（20 - 50 mg/kg），使小鼠达到外科麻醉水平。
5. 向小鼠注射无菌普鲁卡因青霉素G混悬液（75,000 U，肌内注射）和镇痛剂（卡洛芬，0.05 - 1 mg/kg，皮下注射），分别以降低感染和疼痛的风险²⁴。
6. 动物麻醉后，在双眼涂抹....

结果

直接对海马齿状回（DG）亚区进行高频深部脑刺激（HF-DBS），或刺激穿通路（PP）亚区以间接激活DG 通过 使用立体定位调整插入电极后，将啮齿类动物用戊巴比妥麻醉，并在最后一次高频深部脑刺激（HF-DBS）刺激后3小时采样。 c-fos 以及 Notch1 免疫染色。对于 BrdU 染色，在 HF-DBS 刺激 1 天或 5 天后，末次注射 BrdU 36 小时，用戊巴比妥麻醉啮齿动物以制备脑切片。 图3 表明表达的 c-fos 在DG同侧显著增加。此外， c-fos 海马齿状回对侧的表达也较无高频深部脑刺激（HF-DBS）刺激的对照组显著上调，后者几乎不表达a c-fos 信号。根据脑切片中Notch1特异性免疫荧光染色结果，如图所示 补充图1我们进一步证明，通过PP神经元去极化诱导，HFS刺激后成年海马齿状回（DG）中的Notch1信号通路亦可被激活（亦参见作为补充材料提供的原始数据）.......

讨论

自20世纪90年代以来，高频深部脑刺激（HF-DBS）技术已被广泛用作治疗多种神经系统疾病的有效工具。迄今为止，HF-DBS的标志性应用在于治疗帕金森病和原发性震颤，这一进展在临床和科研领域均引起了广泛关注与兴趣。目前，多个研究团队正在开展多种类型的HF-DBS研究，探索其在特定神经及精神疾病治疗中的应用。^32,33一些研究目前正处于不同阶段的临床试验中^2,34尽管高频深部脑刺激（HF-DBS）应能带来显著益处，但即使在脑内定位完全准确的情况下，仍可能出现刺激相关的副作用，例如情绪和思维的负面改变。 等等。，这些反应是可逆的，通过调整刺激参数可以避免。

除了过去几十年临床试验积累的HF-DBS技术取得的重大进展外，在活体动物中开展HF-DBS研究也为理解电刺激所引发的生理变化和神经生物学机制提供了机会。在本论文中，我们描述了一种改良.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
脑立体定位仪	Stoelting	51730D	用于小鼠颅内立体定位植入
刺激器	A-M systems	Model 3800	MultiStim 8通道可编程刺激器
牙科钻机	Saeshin Precision Co., Ltd	STRONG 90	用于钻孔和开颅手术
环钻	Meisinger	HM1 005#	用于钻孔和开颅手术
Digidata 1550 数字转换器	Molecular Devices	AXON 1550	高分辨率数据采集
冷冻切片机	Thermo Fisher Scientific	Thermo Cryotome FSE	用于切割样本的冷冻切片
共聚焦显微镜	Olympus	FV-1200	日本制造，配备20倍物镜（NA 0.45）
小鼠手术器械	F.S.T.	14084-08,11254-20,16109-14	剪刀、镊子、骨剪、持针器等
戊巴比妥钠	R&D systems	4579	腹腔注射剂量为20–50 mg/kg
青霉素G	Sigma-Aldrich	P3032	肌内注射剂量为75,000 U
卡洛芬	Sigma-Aldrich	SML1713	皮下注射剂量为5–10 mg/kg
4% 多聚甲醛（PFA）	北京索莱宝科技有限公司	P1110	组织固定的储存液
磷酸盐缓冲液（PBS）	Invitrogen	10010023	pH 7.4，每瓶500 ml储存
Tissue-Tek O.C.T. 包埋剂	Sakura	4583	由水溶性乙二醇和树脂组成的配方
抗BrdU抗体	Abcam	ab6326	稀释比例：1/800
抗c-fos抗体	Abcam	ab209794	稀释比例：1/500
驴抗兔IgG（Alexa Fluor 568）	Thermo Fisher Scientific	A11036	稀释比例：1/500
驴抗大鼠IgG（Alexa Fluor 488）	Jackson ImmunoResearch	712-546-150	稀释比例：1/500
含DAPI的抗荧光淬灭封片剂	Vector Laboratories	H-1200	用于DAPI复染
抗Notch1抗体（C-20）	Santa Cruz Biotech	sc-6014	稀释比例：1/50
驴抗山羊IgG（Alexa Fluor 488）	Abcam	ab150073	稀释比例：1/1000