体内 微透析技术已能够从清醒、自由活动的动物脑组织间液（ISF）中收集存在的分子。为了分析ISF中相对较大的分子，本文重点介绍使用具有高分子量截留膜探针的微透析实验方案。
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摘要
摘要
体内 微透析是一种基于透析原理的强大技术，可用于从清醒、自由活动的动物中收集脑间质液（ISF）。尽管微透析是一种成熟的方法，通常用于检测氨基酸或神经递质等相对较小的分子，但近年来也已用于通过使用高分子量截留膜探针来评估ISF中较大分子的动态变化。当使用此类探针时，微透析必须以推-拉模式运行，以避免探针内部积聚压力。本文提供了详细的实验步骤，包括立体定位手术以及如何建立微透析系统以从ISF中收集蛋白质。在微透析过程中，药物可通过全身给药或直接灌注进入ISF。反向微透析是一种将化合物直接注入ISF的技术。将药物加入微透析灌流液缓冲液中，可使其通过探针扩散进入ISF，同时实现ISF的采集。作者以tau蛋白为例，展示了通过反向微透析给予苦味毒素刺激神经元活动后，其水平的变化情况。文中还描述了微透析技术的优点与局限性，并介绍了将其与其他体内 方法结合使用的扩展应用。
引言
脑间质液（ISF）约占全脑体积的15%–20%，为信号转导、底物运输和代谢废物清除提供了关键的微环境1。因此，从活体动物中采集ISF的能力将对多种生物学过程及疾病机制的研究产生重要意义。体内微透析是少数几种能够从清醒、自由活动的动物脑内采集并定量分析ISF中细胞外分子的方法之一，因而在神经科学研究领域具有重要应用价值2,3。该方法通过将带有半透膜的微透析探针植入脑组织，并以相对缓慢的流速（0.1–5 µL/min）持续灌注缓冲液。在灌注过程中，ISF中的细胞外分子依据浓度梯度被动扩散进入探针，并被收集为透析液。尽管本文主要介绍脑内ISF的采样方法，但其基本原理和操作流程经适当调整后，亦可适用于其他器官。
微透析技术最早于20世纪60年代初期被采用，此后被广泛用于收集脑组织中的小分子物质，包括氨基酸或神经递质。然而，近年来市场上出现了具有高分子量截留膜（100 kDa–3 MDa）的微透析探针，使其应用范围扩展至脑间质液（ISF）中相对较大的蛋白质4,5,6,
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方案
所有动物实验均经东京大学医学研究生院机构动物护理和使用委员会审查并批准。
1. 术前准备
- 手术开始前，用70%乙醇擦拭所有物品以维持无菌条件。 建议使用加热垫提供保温支持。
- 通过腹腔注射水合氯醛（400 mg/kg）对小鼠进行麻醉。通过脚趾夹捏试验确认麻醉效果。 建议在麻醉诱导时使用缓释型美洛昔康，并在恢复期每12小时给予一次丁丙诺啡，持续至少24小时 。
- 使用手术剪刀剃除毛发。利用耳杆和鼻夹将小鼠固定在小鼠与新生大鼠适配器上。
注意：此步骤中必须确保小鼠头部牢固固定，不得左右移动。 - 在麻醉期间，于眼睛表面涂抹兽用眼膏以防止干燥。
2. 用于导管套管植入的立体定位手术
- 将小鼠和新生大鼠适配器安装到立体定位仪上。使用手术刀在颅骨上方的皮肤上做矢状切口。用湿润的棉签擦去颅骨上的血液和结缔组织。
- 使用脑图谱确定目标脑区的坐标。在开始测量前，确保中线笔直，以便钻头在前后方向移动时始终位于中线缝线上。
注：本文使用坐标（前后方向：-3.1 mm，内外侧方向：-2.5 mm，背腹方向：-1.2 mm，12度）定位后部海马区。 - 调平颅骨前后方向
- 将钻头安装在立体定位架的操纵臂上。降低钻头直至其轻....
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结果
在逆向微透析中，为了刺激或抑制神经元活动，已使用毕叩毒素（picrotoxin，GABAA受体拮抗剂）或河豚毒素（tetrodotoxin，Na+通道阻断剂）11,12,13。已有研究表明，神经元活动的增强可促进tau蛋白的释放13,14。与这些先前观察结果一致，在清醒的C57B6/J小鼠中，通过逆向微透析给予50 µM毕叩毒素（PTX）后，采用ELISA法测得的细胞外液（ISF）内源性tau蛋白水平较溶剂对照组（DMSO）升高（详见讨论部分）（图2）。
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讨论
使用高分子量截留膜进行微透析时，必须采用推拉模式操作，因此流速的准确性和恒定性至关重要。流速不准确可能导致气泡产生以及样品浓度不一致。如果流速不稳定，请检查所有连接处是否漏液。若问题仍然存在，则可能需要更换新的探针和管路后重新开始实验。
微透析探针由灌注缓冲液持续灌注，因此细胞外分子没有足够时间在灌注液中达到完全平衡。结果，透析液中的浓度远低于其在组织间液（ISF）中的实际浓度。为了估算ISF中分子的真实浓度，常采用零流速法3,5,15。该方法通过改变流速来测定浓度，浓度与流速之间呈反比关系。因此，可通过将指数曲线外推至理论上的零流速，从而确定目标分子的浓度，该点代表分子的完全回收。然而，回收率可能受到多种因素影响，如分子与膜的相互作用、分子的疏水性或其他蛋白的相互作用，需注意的是，理论零流速下的浓度未必完全等同于其在ISF中的真实浓度。
探.......
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致谢
本研究得到了文部科学省创新领域研究项目（脑蛋白老化与痴呆控制）（15H01552）以及青年科学家研究项目（B）（16K20969）的资助。作者感谢David M. Holtzman博士和John R. Cirrito博士在本方法开发过程中提供的技术指导。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Univentor 820 微量采样器 | Univentor | 8303002 | 带制冷功能的组分收集器 |
| 注射泵 | KD scientific | KDS-101 | |
| 滚压泵 | Eicom 微透析 | ERP-10 | |
| Raturn 独立系统 | BASi | MD-1409 | 自由活动系统 |
| 双物种笼具套件 | BASi | CX-1600 | |
| AtmosLM 微透析探针（轴长 8 mm，膜长 2 mm） | Eicom 微透析 | PEP-8-02 | 探针、引导套管、假探针和立体定位适配器的轴长应保持一致。 |
| 微透析引导套管（轴长 8 mm） | Eicom 微透析 | PEG-8 | |
| 微透析假探针（轴长 8 mm） | Eicom 微透析 | PED-8 | |
| 颅骨螺钉 | BASi | MD-1310 | |
| Super Bond C&B 套装 | Sunmedical | 牙科水泥 | |
| 带数字显示控制台的小动物立体定位仪 | Kopf | Model 940 | 立体定位装置 |
| 小鼠和新生大鼠适配器 | Stoelting | 51625 | |
| 小鼠立体定位用标准耳杆及橡胶尖端 | Stoelting | 51648 | |
| 牛血清白蛋白溶液 | Sigma | A7284-50ML | 30% BSA 溶液 |
| FEP 管路（70 cm） | Eicom 微透析 | JF-10-70 | 内体积 = 0.5 µL/cm |
| 特氟龙管路（50 cm） | Eicom 微透析 | JT-10-50 | 内体积 = 0.08 µL/cm |
| Byton 管 | Eicom 微透析 | JB-30 | |
| Intramedic 鲁尔穿刺接头 23G | BD | 427565 | 钝端针头 |
| 滚压管 | Eicom 微透析 | RT-5S | 内体积 = 4 µL |
| 螺帽 | Eicom 微透析 | AC-5 | |
| 0.25 mL 带盖微量离心管 | QSP | 503-Q | 组分收集器用管 |
| 立体定位适配器（轴长 8 mm） | Eicom 微透析 | PESG-8 | |
| 连接针 | Eicom 微透析 | RTJ | |
| 小鼠动物颈圈 | BASi | MD-1365 | |
| 高速旋转微型电机套件 | FOREDOM | K.1070 | 钻机 |
| 荷包牡丹碱 | Sigma | P1675 | |
| 用于颅骨螺钉的螺丝刀 | |||
| 手术刀 | |||
| 棉签 | |||
| 手术剪毛器 |
参考文献
- Lei, Y., Han, H., Yuan, F., Javeed, A., Zhao, Y. The brain interstitial system: Anatomy, modeling, in vivo measurement, and applications. Progress in Neurobiology. 157, 230-246 (2017).
- Kushikata, T., Hirota, K. Neuropeptide microdialysis in free....
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