开花植物上的杀菌剂喷洒可能会使独居蜂暴露于高浓度的花粉携带杀菌剂残留物中。通过基于实验室的实验涉及 体外-饲养的蜜蜂幼虫，本研究探讨了取食来自寄主和非寄主植物的经杀菌剂处理的花粉所产生的交互效应。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
尽管独居蜂为野生植物和栽培作物提供了至关重要的授粉服务，但这一物种多样性丰富的类群在农药监管研究中却长期被忽视。若在蜜蜂采集花粉以储备巢穴期间，于其寄主植物上或附近喷洒杀菌剂，则其暴露于杀菌剂残留的风险可能尤为显著。对于某些物种而言 Osmia 以特定植物花粉为食的独居蜂（寡食性），由于无法利用非寄主植物的花粉，可能增加其受杀菌剂毒害的风险。本文描述了成功饲养寡食性壁蜂所采用的实验方案。 Osmia ribifloris 在标准化实验室条件下，于细胞培养板中从卵期至预蛹期进行广义上的培养。 体外-饲养的蜜蜂随后被用于研究杀菌剂暴露和花粉来源对蜜蜂适应性的影响。该实验采用2 × 2全交叉析因设计，考察杀菌剂暴露和花粉来源对幼虫适应性的影响，包括预蛹生物量、幼虫发育时间和存活率，以量化其主效应及交互效应。该技术的一个主要优势在于使用 体外-饲养的蜜蜂可降低自然背景变异性，并允许同时操控多个实验参数。本方案描述了一种多功能工具，可用于检验涉及影响蜜蜂健康的一系列因素的假设。要实现显著且持久的保护成效，深入理解驱动蜜蜂种群衰退的生理与环境因素之间的复杂相互作用将至关重要。
引言
由于蜜蜂是昆虫传粉者中的主要类群1，其全球性种群衰退对粮食安全和生态系统稳定性构成了威胁2,3,4,5,6,7。无论是人工饲养还是野生蜂群的种群数量下降，均归因于若干共同的风险因素，包括栖息地破碎化、新出现的寄生虫和病原体、遗传多样性丧失以及外来入侵物种的引入3,4,7,8,9,10,11,12。特别是杀虫剂（例如新烟碱类）使用量的急剧增加，已被直接证实对蜜蜂产生有....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
1. 准备杀菌剂暴露实验用丙环唑溶液
- 实验当天，通过将适量市售14.3%丙环唑溶解于无菌水中，配制0.1倍稀释的杀菌剂溶液。所有处理均须使用新鲜配制的杀菌剂溶液。
- 添加 23 µL 每克花粉饲料添加0.1倍稀释的杀菌剂溶液，以达到此前在蜜蜂采集花粉中报道的丙环唑最高浓度24 （0.361 PPM 或 µg 活性成分克数-1 花粉的
2. 从切叶蜂（Osmia）巢管中采集卵和寄主花粉团
- 使用灭菌的解剖刀解剖新筑巢的芦苇管中的切叶蜂（Osmia），沿芦苇长度方向将其切开成两部分，以暴露各个独立的巢室。
注意：每个蜂巢可能包含8至14个巢室，每个巢室内含有一枚卵。 - 通过肉眼检查芦苇，根据已发表的指南77识别含有雄性卵的巢室。使用灭菌的弯头针将每一份花粉食料连同其对应的卵从巢管中取出，并置于洁净的称量舟中。
- 使用洁净的细毛画笔轻轻将卵与食料分离，并使用标准实验室天平记录花粉食料及卵的鲜重。计算雄性花粉食料的平均重量。
- 后续操作应尽快完成，以尽量减少因暴露于过高温度或脱水环境而对卵造成损伤的风险。
3. 准备受体植物花粉....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
幼虫适应性通过三个指标进行量化：（i）幼虫发育时间，（ii）预蛹期生物量，以及（iii）存活率。采用双因素方差分析（ANOVA），以杀菌剂暴露（两个水平：无杀菌剂、有杀菌剂）和花粉来源（两个水平：寄主花粉、非寄主花粉）作为自变量，幼虫发育时间为因变量。杀菌剂暴露的主效应不显著（F1,28 = 1.24，P = 0.28），其中经杀菌剂处理组（平均值 ± 标准误）为 28.14 ± 1.98 天（N = 14），未处理组为 25.39 ± 1.65 天（N = 18）。然而，花粉来源的主效应显示，以寄主花粉饲养的幼虫与以非寄主花粉饲养的幼虫在发育时间上存在显著差异（寄主花粉组：20.00 ± 0.50 天，N = 16；非寄主花粉组：33.19 ± 0.81 天，N = 16）（F1,28 = 179.83，P < 0.001）。经Bonferroni校正的事后比较表明，在寄主花粉（.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
在实验室条件下，将蜜蜂饲养于其天然巢管之外，可对与幼虫适应性相关的多种假设进行检验。鉴于仍存在一些未明因素导致蜜蜂死亡，利用体外（in vitro）实验开展风险评估研究，有助于识别此类物种丰富的野生传粉昆虫可能面临的风险，并为管理措施提供科学依据12,38,49,76,81,82。
通常，较短的发育时间以及较高的预蛹期生物量与较高的幼虫适合度相关。在所有处理组中，幼虫发育持续时间与预蛹期生物量呈负相关。然而，在四个组之间，幼虫发育持续时间与预蛹期生物量存在显著差异。未接受任何杀菌剂处理且可摄食寄主花粉的幼虫具有最短的幼虫发育时间以及最高的预蛹期生物量。相比之下，摄食经杀菌剂.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢 Kimball Clark 和 Tim Krogh 提供 Osmia 巢管材料，感谢 Meredith Nesbitt 和 Molly Bidwell 在实验室中的协助，感谢 Cameron Currie 博士、Christelle Guédot 博士、Terry Griswold 博士、Michael Branstetter 博士以及三位匿名审稿人提出的宝贵意见，这些意见显著改进了本文稿。本研究得到了美国农业部农业研究局拨款资金（当前研究信息系统编号 #3655-21220-001）、威斯康星州农业、贸易和消费者保护部（编号 #197199）、美国国家科学基金会（资助号 DEB-1442148）、美国能源部大湖生物能源研究中心（美国能源部科学办公室 BER DE-FC02-07ER64494）的支持。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| O. ribifloris sensu lato (s.l.) 的卵 | 美国犹他州戴维斯县凯斯维尔 | ||
| 切叶蜂巢管 | Nativebees.com | NA | 新鲜封口的巢管 |
| 解剖工具组 | VWR | 89259-964 | 使用前需灭菌 |
| 尖嘴钳 | Husky | 1006 | |
| 6孔细胞培养板 | VWR | 10062-892 | 无菌密封 |
| 48孔细胞培养板 | VWR | 10062-898 | 无菌密封 |
| 培养皿 | VWR | 25373100 | 无菌密封 |
| 方形称量舟 | VWR | 10770-448 | |
| 骆驼毛刷 | Bioquip | 1153A | |
| 锡坩埚 | EA Consumables | D1021 | 使用前需灭菌 |
| 蔗糖 | VWR | 470302-808 | |
| 丙环唑 14.3 | Quali-Ppro | 60207-90-1 | 丙环唑 14.3% |
| 蜜蜂花粉 | Bee energised | 897098001244 | 未经处理的天然原生花粉 |
| 微量天平 | VWR | 10204-990 | |
| 球磨仪 | LAB SYNERGY INC. | 30334913 | |
| 木棒 | VWR | 470146908 | 使用前需灭菌 |
| 封口胶带 | VWR | 89097-912 | |
| 显微镜 | VWR | 89403-384 | |
| 种植托盘 | VWR | 470150-632 | |
| 乙醇 | VWR | BDH1158-4LP | |
| 离心管 | VWR | 21008936 | |
| 微量注射器 | Cole-Palmer | UX-07940-07 | |
| 橡胶镊子 | Amazon | B0135HWPN4 | |
| 注射器针头 | VWR | 89219-334 | |
| 冷冻干燥机 | Labcono | LFZ-1L | |
| 统计分析软件 | SPSS | Version 21.0 |
参考文献
- Klein, A. -M., et al. Importance of pollinators in changing landscapes for world crops. P Roy Soc Lond B Bio. 274 (1608), 303-313 (2007).
- Biesmeijer, J. C. J., et al. Parallel declines in pollinators and insect-pollinated plants in Britain ....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
