利用细胞系中基于多重CRISPR的增强子干扰解析增强子功能

摘要

本方案描述了使用失活融合蛋白SID4X-dCas9-KRAB（也称为增强子干扰，Enhancer-i）对增强子进行多重靶向设计与操作的步骤。该方案可用于鉴定调控基因表达的增强子，并有助于解析调控同一靶基因的多个增强子之间的相互关系。

摘要

多个增强子通常共同调控同一个基因，但对于大多数基因而言，目前仍不清楚哪些增强子对基因表达是必需的，以及这些增强子如何协同作用以产生转录响应。由于已鉴定出数百万个增强子，因此需要高通量工具在全基因组范围内确定增强子的功能。目前研究增强子功能的方法包括利用具有核酸酶活性的Cas9进行基因删除，但该技术难以研究多个增强子的组合效应，因为必须依次构建多个克隆细胞系。本文介绍Enhancer-i，一种基于CRISPR干扰的技术，可在内源位点同时对多个增强子进行功能分析。Enhancer-i利用两个抑制结构域——SID和KRAB，与无核酸酶活性的Cas9融合，通过在靶向位点诱导组蛋白去乙酰化实现增强子失活。本实验方案采用向导RNA的瞬时转染，以实现靶区域的瞬时失活，特别适用于在组织培养条件下阻断可诱导的转录响应。Enhancer-i在基因组靶向和全局基因表达影响方面均具有高度特异性。通过本方案获得的结果有助于理解某个增强子是否参与基因表达、其贡献程度如何，以及这种贡献如何受到邻近其他增强子的影响。

引言

ENCODE¹、Roadmap Epigenomics² 和 FANTOM³ 等大规模测序项目已在数百种细胞类型中鉴定了人类基因组中数百万个潜在的增强子。据估计，每个启动子平均与4.9个增强子相关联，而每个增强子平均与2.4个基因发生相互作用³，这表明基因表达通常是多个分散调控相互作用整合的结果。目前仍存在一个重要挑战，即不仅需要明确单个增强子如何影响基因表达，还需阐明它们如何协同作用以调控基因表达。遗传学方法通常用于在从果蝇（Drosophila）⁴ 到小鼠⁵ 等模式生物中鉴定增强子之间的关系。然而，这些实验在研究多个基因上的多个增强子时耗时较长且通量较低。

大规模研究增强子功能的一种方法是采用高通量并行报告基因检测。这类检测能够同时筛选成千上万条DNA序列驱动报告基因表达的能力⁶。尽管这些检测表明，仅DNA序列本身就足以传递基因调控信息⁷，但其局限性在于检测是在非天然的染色质环境之外进行的，并且使用了异源启动子。此外，高通量并行报告基因检测中所分析的DNA序列长度通常小于200个碱基对，可能遗漏相关的邻近序列。更重要的是，由于报告基因检测一次只能测量一条序列的活性，因此无法反映增强子之间可能存在的复杂相互关系。因此，尽管高通量并行报告基因检测能够揭示DNA序列的内在活性，却未必能反映该DNA序列在基因组环境中的真实功能。

近年来开发的 CRISPR/Cas9 工具⁸ 促进了基因调控的研究，因其能够在内源性位点上删除增强子。然而，同时删除多个增强子可能导致基因组不稳定，且在单个细胞系中连续生成多个增强子缺失耗时较长。此外，在修复后，缺失位点会形成新的基因组序列，这些新序列可能获得调控功能。一种 Cas9 的改良版本已被专门开发用于调控基因表达，该版本依赖于将激活^9,10 或抑制^11,12 结构域融合至核酸酶失活的 Cas9（dCas9）上。这些融合蛋白非常适合同时研究多个基因位点，因为它们不会直接改变 DNA 序列，而是通过调控表观遗传状态来解析调控区域的功能。其中应用最广泛的抑制性融合结构是 KRAB，它可招募 KAP1 共抑制复合物，促进与基因沉默相关的组蛋白 H3 赖氨酸 9 三甲基化（H3K9me3）的沉积¹³。dCas9-KRAB 也被称为 CRISPR 干扰技术¹⁴，已被用于靶向并筛选单个增强子对基因表达的贡献^15,16；然而，该技术尚未针对同时靶向多个区域进行优化。一种用于增强子的多重 CRISPR 干扰方法 Mosaic-seq¹⁷ 采用单细胞 RNA 测序作为读出手段，但该技术成本较高，且由于单细胞 RNA 测序灵敏度较低，仅适用于高表达基因的研究。

我们旨在开发一种基于CRISPR干扰的技术，用于在雌激素转录应答背景下解析组合性增强子的功能。大约一半的雌激素响应基因在其附近含有两个或更多由雌激素受体α（ER）结合的增强子¹⁸，这表明多个增强子可能共同参与雌激素应答过程，而要理解其调控逻辑，则需要同时靶向多个增强子。由于早期在启动子区域使用CRISPR干扰的研究表明，并非所有启动子对KRAB介导的抑制均表现出同等程度的响应¹⁹，我们推测将一个不同的抑制结构域连接到dCas9上，可能有助于失活多种类型的增强子。我们选择了Mad1的Sin3a相互作用结构域（SID）²⁰，因为它能够招募组蛋白去乙酰化酶²¹，从而去除与转录活性相关的组蛋白乙酰基团。重要的是，SID结构域在与dCas9²²和TALEs²³融合时已被证明可有效降低基因表达，且Sin3a在多种增强子序列环境中均被证实是一种强效的抑制性共因子²⁴。我们利用SID4x-dCas9-KRAB（Enhancer-i）靶向了10个不同的ER结合增强子，鉴定了在4个基因上对雌激素转录应答所必需的ER结合位点（ERBS）¹⁸。此外，我们还靶向了增强子的组合，以鉴定在驱动雌激素转录应答中协同作用的位点。我们发现，最多可同时靶向约50个位点，并检测到可观察的基因表达变化。通过ChIP-seq和RNA-seq分析，我们证明Enhancer-i是一种高度特异性的技术，可用于同时研究多个增强子。

在本实验方案中，我们描述了执行Enhancer-i的各个步骤。Enhancer-i是一种灵活的技术，可在组织培养条件下同时对多个增强子进行功能研究。Enhancer-i的结果与基因敲除高度一致，但其作用为依赖组蛋白去乙酰化酶（HDACs）的瞬时失活。本方案通过瞬时转染递送向导RNA，而非通过病毒载体实现稳定整合，从而避免了H3K9me3的沉积及其可能的扩散。本方案详细说明了通过Gibson组装进行向导RNA设计与克隆、利用脂质体转染法转染向导RNA，以及通过qPCR分析基因表达变化的方法。我们还提供了在基因组和转录组水平上评估Enhancer-i靶向特异性的相关方法。尽管该技术最初是为研究人癌细胞系中由雌激素受体（ER）结合的增强子对基因调控的作用而开发，但其同样适用于解析任何哺乳动物增强子的功能。

方案

1. 生成稳定表达 SID4X-dCas9-KRAB 的细胞系

注意：此处提供的转染条件和药物浓度已针对在补充有10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的RPMI 1640培养基（完全RPMI）中培养的Ishikawa细胞（一种子宫内膜癌细胞系）进行了优化。其他细胞系可能需要不同的转染条件和药物浓度。用户也可在野生型细胞中进行瞬时转染实验，而非构建稳定细胞系，共转染表达SID4X-dCas9-KRAB的质粒以及表达向导RNA的质粒；然而，由于SID4X-dCas9-KRAB的表达水平在不同转染间可能存在差异，瞬时转染的结果可能较难重复。

1. 在6孔板中每孔接种至少2个孔的Ishikawa细胞，细胞汇合度为30–50%（约300,000个Ishikawa细胞），每孔加入3 mL完全RPMI培养基。
   1. 吸弃细胞培养液，用1×PBS（pH 7.4）洗涤细胞一次。吸弃PBS，加入胰蛋白酶（10 cm培养皿加4 mL，T-75培养瓶加5 mL）。
   2. 在37 °C下孵育细胞约5分钟，每2分钟检查一次细胞脱落情况，并轻轻摇动容器。
   3. 待细胞脱落后，用移液器将胰蛋白酶消化的细胞上下吹打数次，并沿容器壁轻轻吹打，以释放任何仍附着的细胞。
   4. 将细胞转移至15 mL锥形管中，在250 × g离心5分钟。
   5. 吸除胰蛋白酶，加入5–10 mL培养基重悬细胞。必要时使用P1000移液器吹打分散细胞团块。
   6. 计数细胞并确定每孔接种约300,000个细胞所需的体积，总体积为3 mL。将细胞加入6孔板的2个独立孔中，每孔补加完全RPMI培养基至3 mL。
   7. 接种后前15分钟内，每隔5分钟轻轻摇动培养板一次，以确保细胞在板上均匀分布。使用显微镜检查，确认细胞已从孔中央分散开来。
2. 铺板后24小时内，使用适用于目标细胞系的转染试剂进行以下转染操作。对于Ishikawa细胞，采用如下所述的操作步骤。
   注意：本实验方案默认使用基于阳离子脂质体的转染试剂。对于对这些试剂高度敏感或脂质体转染效率较低的细胞类型，电穿孔可作为替代方法。在开展Enhancer-i实验之前，必须针对目标细胞系优化转染条件。
   1. 在1.7 mL Eppendorf管中，将2.5 μg SID4X-dCas9-KRAB质粒和800 ng表达荧光蛋白的质粒溶于无血清培养基中，使管中终体积为155 µL，质粒终浓度为0.020 µg/µL。
   2. 在另一管中，将3.3 µg不含新霉素抗性盒的质粒（如pCMV-GFP）溶于无血清培养基中，调整终体积至155 µL，使质粒终浓度为0.020 µg/µL。
   3. 每管涡旋振荡片刻，然后使用微量离心机离心。
   4. 加入9.9 µL转染试剂（材料表向每个试管中加入）适量。低速短暂涡旋混匀，然后用微量离心机离心。
   5. 将试管在室温下孵育至少5分钟，但不超过20分钟。
   6. 在生物安全柜中，将150 µL制备好的DNA:试剂混合物逐滴加入6孔板的一个孔中。对另一管制备好的DNA:试剂混合物重复此操作。轻轻摇动培养板混匀，然后将培养板放回培养箱中。
3. 转染后第2天更换培养基，并加入G418至终浓度600 ng/μL。该浓度可能需要根据细胞类型进行优化。
4. 每隔一天更换一次完全RPMI培养基，并补充G418，持续2至4周，直至对照转染细胞死亡，含SID4X-dCas9-KRAB的孔中细胞汇合。细胞恢复所需的准确时间取决于细胞的倍增时间。
5. 当细胞达到汇合状态时，将细胞传代至含有较低浓度G418的完全RPMI培养基中的T-25或T-75培养瓶（Ishikawa细胞使用300 ng/μL G418）。在此传代过程中，制备两份细胞 aliquot，每份约100,000个细胞（大约为十分之一）^th 将6孔板中的细胞分别加入2个1.7 mL离心管中，用于RNA和DNA的提取。离心（5分钟，250 × g），用移液器吸除胰蛋白酶，将离心管于-20 °C保存，以备后续使用。
6. 使用市售试剂盒提取基因组DNA，并使用“pAC95_PCR”或“SID4X_PCR”引物进行PCR扩增（表1) 以验证融合蛋白在细胞系中的存在。使用来自亲本细胞系的基因组DNA作为阴性对照，SID4x-dCas9-KRAB质粒DNA作为阳性对照。采用高保真聚合酶预混液，加入50–100 ng基因组DNA，并按以下扩增条件进行PCR：98 °C预变性30 s，25个循环（98 °C变性10 s，58 °C退火30 s，72 °C延伸2 min），72 °C最终延伸5 min，4 °C保存。
7. 为了在RNA水平上验证融合蛋白的表达，使用商业化试剂盒从细胞系中提取RNA后进行qPCR检测。采用“dCas9_qPCR”引物（表1），以及本实验方案第6.3步所提供的一步法qPCR方案。
8. 为验证融合蛋白在蛋白水平的表达，对细胞系裂解液进行蛋白质印迹（Western blot）检测。使用抗-FLAG或抗-HA抗体检测融合蛋白。

2. 引导 RNA 设计

注意：本实验方案专为 Church 实验室构建并由 Addgene 提供的 U6 引导 RNA 克隆载体（Addgene 41824）设计。为了构建含有嘌呤霉素抗性且克隆策略与 41824 相同的载体版本，我们将该载体中的多克隆位点转移至 pGL3-U6-sgRNA-PGK-嘌呤霉素载体（Addgene 51133）中。Addgene 41824 或我们带有嘌呤霉素抗性的版本（Addgene 106404）均适用于下述克隆策略。

1. 获取每个目标调控区域的 600 - 900 个碱基对的 DNA 序列。参考转录因子结合位点和/或染色质可及性信息，以确定目标区域的位置（图 2A）。
   注意：虽然 图 2A 中的示例包含上游和下游增强子，但也可靶向位于内含子内的调控元件。
2. 将所有获得的序列以 FASTA 格式存入一个文本文件中。
3. 确定至少一个在实验条件下预期不会发生变化的阴性对照区域，例如在目标细胞系中不表达的基因的启动子。获取该区域的 DNA 序列，并以 FASTA 格式添加至文本文件中。
   注意：我们使用靶向 IL1RN 启动子的向导 RNA²⁵ 作为所有靶向区域的阴性对照。用户也可选择靠近目标区域但不含转录因子结合位点的基因间序列作为阴性对照。然而，若同时靶向多个位点，使用单一阴性对照区域可简化实验设计并便于结果解读。若靶向的增强子位于内含子中，可额外选择同一基因座内不含潜在调控元件的内含子区域作为阴性对照，因为 dCas9 融合蛋白可能干扰转录过程。
4. 确定阳性对照区域，例如目标调控区域可能作用的启动子，或在目标细胞系中高度转录的基因的启动子。获取这些区域的 DNA 序列，并以 FASTA 格式添加至文本文件中。
5. 使用如 e-crisp²⁶（http://www.e-crisp.org/E-CRISP/）等程序分析上述 DNA 序列，筛选脱靶效应较低（理想情况下为 0-3 个）的向导 RNA。向导 RNA 由位于原间隔序列邻近基序（PAM）上游的 20 个核苷酸组成，对于来自 S. pyogenes 的 dCas9，PAM 序列为“NGG”。
   1. 在 e-crisp 网站上，使用下拉菜单选择目标物种。基因组组装版本显示在物种名称右侧。
   2. 选择 Input is FASTA sequence 单选按钮。复制上述 FASTA 序列并粘贴到对话框中。确保每条序列均包含 FASTA 标题。
      注意：最多可同时查询 50 条序列。
   3. 在下拉菜单中选择 Medium 单选按钮和 Single design 选项。
   4. 点击 Start sgRNA search 按钮。新浏览器标签页将打开并显示结果。点击 Download an Excel formatted tabular report for all query sequences together 按钮下载候选序列。
   5. 使用 Excel 或文本编辑程序打开表格报告。
6. 使用 UCSC 基因组浏览器通过 BLAT 将候选全长 gRNA 序列（23 个碱基对）比对至基因组。
   1. 在浏览器中访问 UCSC 基因组浏览器网站（http://genome.ucsc.edu）。在 Our tools 部分找到 BLAT 并点击，BLAT 搜索工具将打开。
   2. 在 BLAT Search Genome 文本下方的下拉菜单中选择目标物种和基因组组装版本。
   3. 将 e-crisp 生成的表格报告中的向导 RNA 序列复制并粘贴到对话框中。确保每条序列具有唯一的 FASTA 标题，然后点击对话框底部的 Submit 按钮。
      注意：最多可一次分析 25 条序列。在 BLAT Search Results 页面，每条向导 RNA 的比对结果将以行显示。理想情况下，每条向导 RNA 应仅有一条比对结果，表明其唯一性。
   4. 应尽可能避免选择在基因组中多处比对上的向导 RNA。 
   5. 为分析向导 RNA 在目标区域内的定位与分布情况，点击某条查询向导 RNA 的 ACTIONS 部分下的 Browser 链接。基因组浏览器将打开并以所选向导 RNA 为中心。使用页面顶部的 Zoom out 按钮，可观察 e-crisp 在目标区域内鉴定出的其他向导 RNA 的分布情况。
7. 选择 4 条尽可能不重叠且在目标区域内分布均匀的向导 RNA 序列（图 2B）。若目标区域超过 600 bp，可考虑增加 1 - 2 条额外向导 RNA。避免选择含有同聚物重复序列或极端 GC 含量的向导 RNA，因为这些特征可能阻碍向导 RNA 的克隆过程并降低其靶向效率。
8. 选定向导 RNA 后，创建一个文件，其中包含每条目标向导 RNA 的全长序列（23 个核苷酸），然后去除 5’ 端的第一个核苷酸以及 3’ 端的 PAM 序列（NGG）。此步骤有助于寡核苷酸订购。
9. 在寡核苷酸序列的 5’ 端添加以下序列：GTGGAAAGGACGAAACACCG。
10. 在寡核苷酸序列的 3’ 端添加以下序列：GTTTTAGAGCTAGAAATAGC。
    注意：最终序列应为 59 个核苷酸长，形式如下：GTGGAAAGGACGAAACACCG-靶序列（19 nt）-GTTTTAGAGCTAGAAATAGC。
11. 确保每个拟通过 Enhancer-i 靶向的调控元件均设计有至少 4 条独特的寡核苷酸。订购这些序列的同时，还需订购 Table 1 中列出的“U6_internal”引物。

3. 指导RNA克隆

注意：通过吉布森组装（Gibson assembly）进行向导RNA克隆在我们的实验中已被证明具有很高的效率，每块平板可产生数百个菌落，而仅含载体的对照组中几乎没有或完全无菌落生长。这种高效率对于在混合克隆过程中维持文库复杂性至关重要。吉布森组装克隆的另一个优势在于，用户无需担心所要插入U6克隆载体的向导RNA序列中是否存在限制性内切酶切割位点。尽管如此，如有需要，本实验方案也可调整用于传统的基于限制性内切酶的克隆方法。

1. 使用无RNase、无DNase的超纯水将向导RNA寡核苷酸重悬至终浓度为100 μM。每个目标区域应至少包含4条独立的向导RNA寡核苷酸。
2. 针对每个感兴趣的调控区域，将对应于该区域的所有寡核苷酸混合成一个池。在Eppendorf管中，为每个区域加入5 μL已重悬的单个向导RNA寡核苷酸。充分涡旋混匀后，取出1 μL并用超纯水稀释1:200。
   注意：如有需要，可进一步合并针对单个调控区域的这些池，以生成可同时靶向多个区域的复合池。单个池中最多可同时靶向50个调控区域（图3C）。
3. 使用U6引物进行短片段PCR，以便在吉布森组装前为寡核苷酸添加同源序列。每条寡核苷酸将添加约40个碱基，产生约100 bp的产物，其两端均含有足以与U6载体发生同源重组的序列。
   1. 针对每个向导RNA池，使用高保真聚合酶预混液配制20 μL的PCR反应体系，包含以下组分：1 μL来自步骤3.2的稀释后寡核苷酸池、1 μL U6正向引物（10 μM）、1 μL U6反向引物（10 μM），并用超纯水补足至20 μL。
   2. 在PCR仪中按以下条件孵育：98 °C预变性30 s，进行10个循环（98 °C变性10 s，55 °C退火30 s，72 °C延伸2 min），72 °C最终延伸5 min，然后保持在4 °C。
   3. 取5 μL反应产物在1–2%琼脂糖凝胶上电泳，同时使用低分子量DNA标记。最终产物大小应约为100个碱基对（图2C）。
   4. 使用基于离心柱的DNA纯化试剂盒对延伸反应产物进行纯化，并用试剂盒提供的洗脱缓冲液洗脱至20 μL。
      注意：由于产物较短，应避免使用基于磁珠的纯化方法，因其设计上会排除小于100 bp的小片段。
   5. 使用荧光计或分光光度计对纯化后的DNA进行定量（预期产量为10–20 ng/μL）。向导RNA插入片段可于-20 °C保存，或立即用于与线性化U6载体的吉布森组装。
4. 为准备用于吉布森组装的U6克隆载体，进行限制性内切酶消化。若需进行多个吉布森组装反应，建议设置多个消化反应以确保获得足够的切割载体产量。
   1. 在20 μL反应体系中，使用20单位AflII酶和1 μg质粒DNA，并加入相应的限制性内切酶缓冲液。在37 °C孵育1–2小时。
   2. 使用磁珠或基于离心柱的DNA纯化试剂盒对消化产物进行纯化，并用20 μL洗脱缓冲液洗脱。使用荧光计或分光光度计对纯化后的DNA进行定量。样品可于-20 °C冷冻保存以备后续使用。
5. 对已准备好的载体和插入片段进行吉布森组装。
   1. 在冰上配制吉布森组装反应体系。每个20 μL反应中加入50 ng载体和7 ng插入片段。将插入片段用超纯水稀释1:10以方便移液操作。同时设置仅含载体的对照反应，加入50 ng载体并以水替代插入片段。
   2. 在50 °C孵育吉布森组装反应15分钟，随后置于4 °C保存。
   3. 将组装完成的产物转移至冰上，并在冰上用超纯水将产物稀释1:4。例如，将5 μL吉布森组装产物加入15 μL超纯水中。
6. 转化稀释后的吉布森组装产物。
   1. 将高效感受态细胞在冰上解冻，并为每次转化分装25 μL。若需构建靶向多个位点的复合池，应将足够数量的感受态细胞分装至不同离心管中，以对同一复合gRNA池进行多次独立转化。
   2. 针对每个稀释后的产物，取1 μL加入含有25 μL感受态细胞的1.7 mL Eppendorf管中。通过轻弹管壁混匀，随后将离心管置于冰上孵育30分钟。
   3. 在42 °C热激30秒，立即转移至冰上冷却2分钟。
   4. 加入300 μL SOC培养基（2%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、10 mM NaCl、2.5 mM KCl、10 mM MgCl₂、10 mM MgSO₄和20 mM葡萄糖），并在37 °C、300 rpm振荡条件下培养1小时使细胞恢复。在此期间，将含氨苄青霉素/羧苄青霉素的琼脂平板放入37 °C培养箱中预热。每次转化使用一个平板。
   5. 取50 μL菌液涂布于平板，并将平板置于37 °C培养箱中过夜培养。对于靶向单个位点的gRNA池，可直接将菌液接种至含氨苄青霉素/羧苄青霉素（1 mg/mL）的3–5 mL LB液体培养基（材料表）中，在37 °C、250 rpm振荡条件下过夜培养，用于质粒小提。
7. 收集菌体并提取DNA。
   1. 对于靶向多个位点的大规模向导RNA文库，使用细胞刮刀将每个平板上的所有菌落刮下，分别收集至一个大提质粒（maxiprep）体系（150 mL液体培养物）。可通过向50 mL离心管中加入约5 mL含相应抗生素的LB培养基，再将菌落刮入管中以辅助操作。对于靶向单个位点的文库，则将菌落刮入小提质粒（miniprep）体系（3–5 mL液体培养物）。
   2. 在37 °C、250 rpm振荡条件下，加入相应抗生素孵育培养物3–5小时。
   3. 使用可获得无内毒素质粒的试剂盒进行DNA提取。
   4. 使用荧光计或分光光度计对DNA进行定量。提取的质粒可立即用于转染，或于-20 °C保存以备后续使用。
8. 为验证靶向单个位点的小规模gRNA池中U6载体内是否存在向导RNA序列，可使用Sanger测序法，引物为表1中列出的“U6_PCR_R”引物 。由于向导RNA为混合序列，19个碱基的gRNA靶序列区域将出现碱基混合信号，但其周围的U6启动子及向导RNA骨架序列应保持完整。

4. 增强子-i的转染

注意：为了在Ishikawa细胞中成功利用Enhancer-i阻断雌激素反应，转染前必须将细胞在不含酚红的RPMI培养基（含10%活性炭处理的胎牛血清和1%青霉素/链霉素）中培养5至7天，以去除雌激素。若需阻断雌激素反应，转染期间及之后也应继续在此类培养基中培养细胞。建议使用不含酚红的胰蛋白酶，在完全不含酚红的RPMI培养基中进行细胞传代。

1. 转染前一天，将细胞（野生型或稳定表达 SID4X-dCas9-KRAB 的细胞）以 30–50% 汇合度（Ishikawa 细胞约为每孔 60,000 个）接种于 24 孔板中。接种足够数量的细胞，以便进行重复转染，并设置转染对照向导 RNA 的孔。 接种细胞后，轻轻摇动培养板，使细胞在孔内均匀分布，操作同步骤 1.1.7。
   注意：本方案假设使用基于阳离子脂质体的转染试剂。对于对这些试剂高度敏感的细胞类型，电穿孔可作为替代方法。在进行 Enhancer-i 实验前，必须针对目标细胞系优化转染条件。
2. 次日，按照所选转染试剂的说明书准备转染。对于 Ishikawa 细胞，每个 24 孔板孔使用总量为 550 ng 的质粒。将质粒用无血清培养基稀释至终浓度为 0.020 μg/μL（转染两个孔时，52 μL 总体积中含 1.1 μg DNA）。每 1 μg DNA 使用 3 μL 转染试剂，涡旋混匀并按步骤 1.2 所述进行孵育。向每孔加入 25 μL 最终混合物。
   注意：若需靶向多个位点组合，每个单独位点使用等质量的质粒，剩余质量用对照质粒补足（空向导 RNA 克隆载体，或靶向阴性对照区域如 IL1RN 启动子的向导 RNA）。对于瞬时转染，使用 Cas9 融合蛋白质粒与向导 RNA 质粒 3:2 的比例。可添加含荧光报告基因的质粒以监测转染效率。
3. 转染后 36 小时，更换培养基，使用不含酚红的 RPMI 培养基，添加 10% 去除活性炭的胎牛血清和 1% 青霉素/链霉素（适用于 Ishikawa 细胞），并加入嘌呤霉素（终浓度：1 μg/mL）和新霉素（终浓度：300 ng/mL）。若细胞对转染试剂敏感，可提前换液，但抗生素不得早于转染后 24 小时添加。
   注意：添加抗生素后至少等待 24 小时再收获细胞。Enhancer-i 引起的基因表达变化最早可在转染后 48 小时检测到，最长可持续至转染后 5 天。若使用已去除雌激素处理的 Ishikawa 细胞，应在抗生素处理次日进行 10 nM 17β-雌二醇（E2）诱导 8 小时，随后立即收获细胞。

5. 细胞收获与RNA提取

1. 配制含有1% β-巯基乙醇（BME）的裂解缓冲液。确保裂解缓冲液与BME的混合液体积充足（每孔收获需300 μL）。
2. 使用真空抽吸装置吸除培养基。
3. 用等体积的1× PBS（500 μL）洗涤细胞一次，并抽吸尽可能去除PBS。
4. 使用多通道移液器向每孔加入300 μL裂解-BME溶液。上下吹打8–10次，转移至深孔板或置于冰上的1.7 mL Eppendorf离心管中。可立即进行RNA提取，或在-80 °C冷冻裂解物以备后续处理。
5. 为从裂解物中提取RNA，使用包含DNase处理步骤的市售试剂盒。用推荐的最小体积的超纯水（无RNase，无DNase）或洗脱缓冲液进行洗脱，并对RNA进行定量。对于少量样本，可使用荧光计或分光光度计；对于大量样本，可使用特异性荧光探针并在酶标仪上检测RNA含量。样本可在定量前或定量后于-80 °C保存。

6. 使用一步法 qPCR 和 RNA-seq 定量基因表达变化

1. 获取目的基因以及至少一个看家基因的qPCR引物，该看家基因的表达水平应接近目标基因，并且在不同实验条件下表达保持稳定。理想情况下，这些引物应跨越外显子-外显子连接区，以避免扩增基因组DNA。
   1. 使用来自目标细胞系的RNA对这些引物进行测试。通过熔解曲线分析验证是否仅产生单一产物。若未获得单一产物，则测试其他引物对。
2. 针对每个Enhancer-i处理组和对照向导RNA处理组的样本，确定该样本中需要检测的基因数量。该基因集合应包括看家基因，例如 CTCF 或 GAPDH。
3. 设置qPCR反应。
   1. 将所有样本用纯水稀释至相同浓度，确保每个反应可加入50 ng总RNA，并保留足够稀释后的RNA用于所有反应。例如，将RNA稀释至约16.6 ng/μL，并在每个反应中加入3 μL RNA。在配制主混合液时，将RNA保持在冰上。
   2. 使用市售的一步法qPCR试剂盒，为每个待测基因分别配制主混合液。反应体系为20 μL，每种引物各加入1 μL（10 μM储存液）。在冰上配制这些反应。
   3. 在适用于热循环仪的反应板中，先加入RNA样本，再加入主混合液。用封板膜密封后，通过涡旋或移液轻轻混匀。短暂离心（140 × g，60 s），确保液体沉降至孔底。
   4. 将反应板放入热循环仪中进行孵育，程序如下（或按照试剂盒说明）：48 °C孵育30 min，95 °C预变性10 min，随后进行40个循环（95 °C变性15 s，60 °C退火/延伸1 min）。
4. 获取每个样本中各检测基因的Ct值。采用比较Ct法分析基因表达的变化。
   1. 对每个样本，用目的基因的Ct值减去看家基因的Ct值，得到标准化后的ΔCt值。
   2. 对于对照处理组的样本，计算每个基因标准化Ct值的平均值。随后，通过将Enhancer-i处理组样本中每个基因的标准化Ct值与对应基因在对照组样本中的标准化Ct值相减，计算以2为底的对数尺度下的倍数抑制（log2 fold repression）。
5. 为评估Enhancer-i处理后基因表达的全局变化，使用与用户测序平台兼容的市售试剂盒制备RNA测序样本。起始RNA量约为500 ng，并为至少2个生物学重复制备文库。

7. 使用 ChIP-seq 验证 SID4X-dCas9-KRAB 对基因组特定位点的靶向性

注意：SID4X-dCas9-KRAB 融合蛋白同时含有 FLAG 表位标签和 HA 表位标签，但 ChIP-seq 实验中使用抗 FLAG 抗体可获得最佳结果。如有需要，用户可针对可能受 Enhancer-i 影响的转录因子，或针对 H3K27ac（一种增强子活性标志，其水平可被 Enhancer-i 降低）进行额外的 ChIP-seq 实验。然而，每个 ChIP-seq 实验需要 10 × 10⁶ 个细胞，因此请合理规划实验。

1. 用Enhancer-i文库转染细胞。
   1. 在直径15 cm的组织培养皿中接种10 × 10⁶个细胞。每个培养皿代表针对一个目标因子的1次ChIP-seq实验。
   2. 次日，每皿使用20 μg总DNA进行转染。对于稳定表达SID4X-dCas9-KRAB的细胞系，DNA应包含靶向所有目标位点的向导RNA质粒文库，以及可选的表达荧光蛋白的质粒。对于瞬时转染，使用3:2比例的dCas9融合蛋白与向导RNA文库。若需进行其他转录因子或组蛋白修饰的ChIP-seq，应在另一培养皿中至少额外进行一次对照向导RNA转染。 
   3. 转染后24–48小时，用嘌呤霉素（1 μg/mL）和新霉素（300 ng/mL）处理培养皿。收获染色质前至少等待24小时。
2. 从培养皿中收获染色质。
   注意：为研究Enhancer-i对Ishikawa细胞中雌激素受体（ER）基因组结合的影响，可在收获前对转染了对照向导RNA和Enhancer-i的培养皿进行1小时10 nM E2处理。为研究Enhancer-i对H3K27ac的影响，可在收获前进行8小时10 nM E2诱导。
   1. 向每个培养皿中加入500 μL 37%甲醛（终浓度1%），轻轻摇晃培养皿，室温静置10分钟。
   2. 加入1 mL 2.5 M甘氨酸（终浓度125 mM），轻轻摇晃培养皿。
   3. 倒掉含甲醛和甘氨酸的培养基，加入等体积（约20 mL）冰冷的1× PBS。
   4. 倒掉PBS，使用真空抽吸器 尽可能吸除残留PBS，将培养皿置于冰上。
   5. 向每个培养皿中加入3–5 mL冰冷的1× PBS或Farnham裂解缓冲液（5 mM PIPES pH 8.0，85 mM KCl，0.5% NP-40），并加入1×蛋白酶抑制剂（使用前新鲜添加） 。用细胞刮刀刮取细胞，并将溶液转移至冰上的15 mL锥形管中。
   6. 在4 °C、1000 × g条件下离心5分钟，沉淀染色质。弃去上清，将沉淀物储存于-80 °C以备后续使用，或使用抗FLAG抗体，或针对其他目标转录因子或组蛋白修饰（如H3K27ac、H3K9me3）的抗体，继续进行所选的ChIP-seq实验流程。

结果

图1展示了本实验方案中所述工作流程的示意图。为了确定靠近雌激素调控基因MMP17的内质网结合增强子的功能（根据ChIP-seq结果，该基因附近存在3个结合位点，见图2A），针对每个区域设计了向导RNA（gRNA）。在设计gRNA时，选取每个ER结合位点周围600–900 bp的序列区域，并将其输入gRNA设计程序。将预测脱靶位点数量为0–2的候选gRNA序列通过BLAT比对至人类基因组。最终选择4个不重叠且覆盖ChIP-seq和DNaseI超敏感位点所定义区域的gRNA用于靶向操作（图2B）。在每条gRNA序列两端添加额外序列（表1），以方便后续克隆操作，合成长度为59个核苷酸的片段。收到合成产物后，将gRNA按位点稀释并混合，随后进行短片段PCR扩增，以在Gibson组装前引入同源序列。 图2C展示了使用“U6_internal”引物（表1）进行短片段PCR后预期获得的gRNA产物：该反应会在59 bp的gRNA片段两端各添加20个碱基对，最终生成约100 bp的序列。完成Gibson组装后，将这些gRNA文库转化至细菌中，并于次日提取质粒小量制备物（miniprep）。图2D展示了一项增强子功能解析实验的结果，该实验利用Enhancer-i单独或联合靶向MMP17附近的多个增强子区域。Enhancer-i靶向的位点以黑色六边形标示。针对指定靶位点的gRNA质粒被转染至稳定表达SID4X-dCas9-KRAB的雌激素剥夺Ishikawa细胞系中。两天后更换培养基，并加入嘌呤霉素以富集成功转染的细胞。次日，对细胞进行10 nM雌二醇处理8小时后收集细胞。提取RNA后进行一步法qPCR检测。在此示例中，位点1和位点2对于MMP17完整的雌激素响应是必需的，而位点3在此条件下无显著贡献（图2D，泳道ii–iv）。当仅有位点2或位点3被激活时（vi和vii），其雌激素响应水平与无任何位点被激活时（viii）相似，表明这两个位点无法独立发挥作用。位点1自身可介导部分基因表达（v），但当位点1和位点2同时激活时，观察到最高的转录活性（iv）。

为了同时操控靠近4个不同基因的10个增强子（图3A），我们构建了复杂的向导RNA混合池，其中包含42条增强子向导RNA和16条启动子向导RNA。在初始向导RNA延伸PCR之前（步骤3.3），将向导RNA寡核苷酸混合，PCR产物经纯化后，通过Gibson组装方法与空载的嘌呤霉素U6克隆载体连接。Gibson组装完成后，进行多次独立转化并涂布平板。将平板上的菌落刮入LB培养基中，培养2–4小时后进行大提质粒。当这些向导RNA混合物转染至稳定表达SID4X-dCas9-KRAB的雌激素剥夺Ishikawa细胞系并按前述方法处理后，qPCR结果显示基因表达出现代表性下调（图3B）（见图2D）。由Enhancer-i介导的下调效果与靶向假定目标基因启动子所获得的效果相似。图3C展示了向导RNA稀释对Enhancer-i介导的雌激素反应抑制的影响。靶向靠近G0S2基因增强子的向导RNA混合物即使稀释至1:50，仍能显著降低基因表达，表明Enhancer-i可同时靶向多达50个位点。然而，这种抑制效应会随着稀释而减弱，说明除非采用更灵敏的检测方法，否则无法同时靶向数百个位点。

图1. 使用Enhancer-i进行多重增强子解析的实验流程示意图。 使用e-crisp设计向导RNA（红色和蓝色），并通过UCSC基因组浏览器进行筛选。选择四个覆盖目标区域（由ChIP-seq定义的转录因子结合位点）的向导RNA。按目标区域（红色和蓝色）混合的向导RNA寡核苷酸经PCR扩增，以添加同源区域（橙色），随后进行Gibson组装和转化。将所得质粒混合物通过脂质体转染法转染至稳定表达SID4X-dCas9-KRAB的细胞系，或与SID4X-dCas9-KRAB质粒共同转染至野生型细胞中。向导RNA质粒混合物可单独转染以逐个靶向特定位点，也可联合转染以同时靶向多个位点。转染后，使用抗生素处理细胞以富集含有向导RNA的细胞。转染约72小时后收集细胞。提取核酸用于qPCR、RNA-seq或ChIP-seq分析。请点击此处查看该图的放大版本。

图2. MMP17 的向导RNA设计与增强子解析。 (A) 基因组浏览器截图，显示靠近 MMP17 基因、被ERα结合的增强子区域（灰色），为靶向目标。本图经Carleton 等¹⁸ 修改而来。 (B) 针对3个结合位点的向导RNA设计¹⁸。ChIP-seq定义的ER结合位点为目标区域，4条向导RNA覆盖该区域。DNaseI敏感性信号跨越该结合位点，也可用于指导向导RNA靶序列的设计。ChIP-seq和DNaseI HS数据均来自经10 nM雌二醇处理1小时的Ishikawa细胞。 (C) 已准备好用于Gibson组装的代表性向导RNA序列，经过短片段PCR扩增以添加同源区域。 (D) 使用Enhancer-i靶向特定区域并经8小时10 nM雌二醇处理后，通过qPCR检测的MMP17相对表达水平。表达量以CTCF为内参，并相对于未接受雌二醇处理的细胞中MMP17的表达水平进行归一化。对照向导RNA靶向IL1RN基因的启动子区域。所有误差线表示标准误（SEM），双星号表示配对t检验中p <0.01，单星号表示p <0.05。本图经Carleton 等¹⁸ 修改而来。 请点击此处查看本图的放大版本。

图3. 利用混合型Enhancer-i同时靶向不同基因附近的多个增强子 (A) Enhancer-i 中拟靶向的结合位点与启动子的示意图 （B） E2处理后，转染Enhancer-i质粒池（绿色）、Promoter-i质粒池（蓝色）或对照gRNA（白色）的Ishikawa细胞中基因表达水平的qPCR检测结果¹⁸. 使用Enhancer-i后，所有基因均表现出显著下调。该图改编自Carleton。 等.¹⁸. (C) 对...的影响 G0S2 E2处理后，转染不同量靶向引导RNA的Ishikawa细胞中的表达水平 G0S2即使使用少量的引导RNA（1:50稀释），仍可观察到显著降低，表明可能同时靶向多达50个位点。所有误差线均表示标准误（SEM），双星号表示 p <0.01 和单个星号表示 p <0.05，在配对 t 检验中。 请点击此处以查看此图的放大版本。

名称	序列
U6_internal_F	TTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCG
U6_internal_R	GACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAAC
U6_PCR_F	CCAATTCAGTCGACTGGATCCGGTA
U6_PCR_R	AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCA
gRNA_qPCR_F	GCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCG
gRNA_qPCR_R	AAAAAGCACCGACTCGGTGCC
dCas9_qPCR_F	GTGACCGAGGGAATGAGAAA
dCas9_qPCR_R	AGCTGCTTCACGGTCACTTT
pAC95_PCR_F	AGAAGAGAAAGGTGGAGGCC
pAC95_PCR_R	CGTCACCGCATGTTAGAAGG
SID4X_PCR_F	CAATAGAAACTGGGCTTGTCG
SID4X_PCR_R	TCGTGCTTCTTATCCTCTTCC

表1. 用于向导RNA扩增和测序、qPCR以及融合蛋白检测的引物。

讨论

本方案描述了一种简单且灵活的方法，用于在内源基因组位点上解析增强子功能，而无需对DNA序列进行物理性改造。尽管该方法在概念上与先前发表的使用dCas9-KRAB²⁷的CRISPR干扰方案相似，但增强子干扰（Enhancer-i）在三个方面与这些方案存在主要差异。首先，Enhancer-i利用MAD1的SIN3A相互作用域²⁰实现增强子失活。使用组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂可逆转增强子的失活，表明其失活的主要机制依赖于HDAC。与使用dCas9-KRAB的CRISPR干扰不同，Enhancer-i不会导致H3K9me3的沉积。这可能是因为Enhancer-i依赖于向导RNA的瞬时导入，并在转染后3天收获细胞；而在CRISPR干扰中，转导后7天可观察到H3K9me3水平升高¹²。最后，Enhancer-i方案提供了一种可同时靶向多个位点并监测靶向效率的策略。在Mosaic-seq¹⁷中，虽然也使用dCas9-KRAB同时靶向多个增强子，但该技术依赖单细胞RNA测序来识别基因表达变化，由于单细胞RNA-seq灵敏度较低，许多基因（如雌激素响应基因）无法被检测到。Enhancer-i为研究任意基因的增强子提供了可靠的方法，既可单独分析，也可组合分析。

Enhancer-i 实验中最关键的步骤是转染，应针对目标细胞系对转染条件进行优化。本方案依赖嘌呤霉素处理来富集转染细胞，但共转染向导RNA与荧光蛋白，并通过流式细胞术分选荧光阳性细胞，可能对某些细胞类型而言是更优的富集方法。我们建议通过qPCR检测向导RNA和SID4x-dCas9-KRAB的表达水平，以排查问题并确认转染效果。若向导RNA水平较低（循环阈值） >30），用户还可考虑其他向导RNA制备策略，例如 体外 转录²⁸也有可能尽管gRNA水平较高，但向导RNA对SID4x-dCas9-KRAB蛋白的靶向效率较低，此时可能需要选择不同的向导RNA序列。通过在染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）中使用经Enhancer-i处理细胞的染色质与融合蛋白进行检测，可监控靶向效率。若在目标区域检测到较强的SID4x-dCas9-KRAB信号，但其假定靶基因的表达未发生改变，则表明该区域在所研究的条件下可能不参与调控该基因的表达。

Enhancer-i 的一个潜在局限性在于，如果同时靶向过多位点，可能会累积脱靶效应。尽管如此，与RNAi相比，用于基因敲低的CRISPR干扰策略具有更少的脱靶效应²⁹，尤其是在使用表达dCas9-KRAB的多克隆细胞系时。虽然我们在同时靶向10个位点时观察到了SID4X-dCas9-KRAB的脱靶基因组结合现象，但尚未发现这些结合事件导致了基因表达的变化。由于某些增强子可能与多个启动子和/或其他增强子发生相互作用，因此靶向单个增强子可能导致多个基因的表达发生变化，但目前尚不清楚这种形式的基因调控是否普遍存在。为了确认所观察到的表达变化是由特异性靶向某一增强子引起而非脱靶效应所致，用户可针对同一区域使用两组不同的非重叠向导RNA进行Enhancer-i实验。此外，利用具有核酸酶活性的Cas9对该区域进行基因敲除，可进一步验证其对基因表达的影响。

由于Enhancer-i通过组蛋白去乙酰化发挥作用，其失活能力可能仅限于具有显著组蛋白乙酰化水平的增强子。存在多种其他抑制性融合蛋白，可能在靶向特定增强子时更为有效。将DNA甲基转移酶与dCas9融合后，当靶向远端增强子时可降低基因表达³⁰，但这种抑制通常不具备瞬时性。另一种抑制性融合蛋白利用GATA1的伴侣蛋白（Friend of GATA1, FOG1）结构域，可导致组蛋白H3第27位赖氨酸的三甲基化，并在多种细胞系和启动子上实现与dCas9-KRAB相当的基因表达抑制水平³¹。有趣的是，在dCas9上增加FOG1拷贝数反而会降低其在启动子处的抑制潜力，提示单个SID结构域可能比Enhancer-i当前使用的4个拷贝提供更强的增强子失活效果。某些基因座可能受益于上述dCas9融合蛋白的不同组合进行双重靶向。例如，同时转导dCas9-DNMT3a和dCas9-KRAB可实现稳定且长期的基因抑制³²。目前大多数抑制性融合蛋白仅被用于单个基因座的靶向，尚不清楚哪一种在同时调控多个增强子时最为有效。

增强子-i技术虽然适用于研究少数基因的增强子组合，但如果用户希望研究数百个基因的潜在增强子，则其通量仍有一定局限性。该技术未来的应用将结合基于成像的技术，以同时定量多个样本中的多个基因。重要的是，这些技术可与来自裂解液的RNA分子直接检测兼容，从而无需耗时的RNA分离步骤。这些改进将有助于对更大规模的增强子集合进行功能解析。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
ZR 96孔快速RNA试剂盒	Zymo Research	R1053
Power SYBR Green RNA-to-CT 一步法	应用生物系统公司	4389986
AflII 限制性内切酶	NEB	R0520S
Phusion 高保真 PCR 预混液（含 HF 缓冲液）	NEB	M0531L
NEBuilder HiFi DNA 组装预混液	NEB	E2621L
FuGENE HD	Promega	E2312
DNA 纯化 & 浓缩试剂盒	Zymo Research	D4013
Buffer RLT Plus	Qiagen	1053393
β-雌二醇	Sigma-Aldrich	E2758
人：Ishikawa 细胞	ECACC	99040201
H3K27ac 兔多克隆抗体	Active Motif	39133
H3K9me3 兔多克隆抗体	Abcam	ab8898
FLAG小鼠单克隆抗体	Sigma-Aldrich	F1804
ERα 兔多克隆抗体	Santa Cruz	sc-544
pGL3-U6-PGK-Puro 质粒	Addgene	51133	沈 et al.，2014
gRNA_cloningVector 质粒	Addgene	41824	Mali 等，2013
AflII U6 嘌呤霉素质粒	Addgene	106404	Carleton 等，2017
SID4X-dCas9-KRAB 质粒	Addgene	106399	Carleton 等，2017
2-巯基乙醇	Sigma-Aldrich	M6250-10ML
UltraPure 无 DNase/RNase 灭菌蒸馏水	赛默飞世尔科技	10977-023
Opti-MEM I 低血清培养基	Gibco	31985070
KAPA Stranded mRNA-Seq 试剂盒，含 KAPA mRNA 捕获磁珠	Kapa Biosystems	KK8420
Pierce 蛋白酶与磷酸酶抑制剂迷你片剂	赛默飞世尔科技	A32959
甲醛溶液	Sigma-Aldrich	252549-25ML
遗传霉素选择性抗生素（G418硫酸盐）（50 mg/mL）	赛默飞世尔科技	10131035
LB肉汤	赛默飞世尔科技	10855001
Quick-DNA Miniprep 试剂盒	Zymo Research	D3020
Quick-Load Purple 2-Log DNA Ladder	NEB	N0050S