方法文章

RNA原位杂交法定量分析小鼠脑切片中的替代前 mRNA 拼接方法

DOI：

10.3791/57889

⸱

2018年8月26日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Genetics and Genome Sciences, Case Western Reserve University, 2Department of Endocrinology, Dongfang Hospital of Beijing University of Chinese Medicine, 3Case Comprehensive Cancer Center, Case Western Reserve University, 4Center for RNA Science and Therapeutics, Case Western Reserve University

本文内容

摘要

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本文介绍了一种利用短反义寡核苷酸检测小鼠脑部替代前 mRNA 拼接模式的原位杂交协议。

摘要

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替代剪接 (AS) 发生在超过90% 的人类基因。一个交替拼接的外显子的表达模式通常是以特定于细胞类型的方式来调节的。由于表达模式通常由 RT PCR 和 rna 序列分析, 使用 rna 样本从细胞的数量分离。原位检测作为一种特定的生物结构的表达模式, 可以通过 RNA原位杂交 (用外显子特异探针) 进行。然而, 这种特殊用途的使用是有限的, 因为替代外显子通常太短, 以设计显子特定的探针。在本报告中, BaseScope 的使用, 最近开发的技术, 采用短反义寡核苷酸在 RNA, 被描述为分析模式在小鼠脑科。用神经纤维瘤1型 (Nf1) 的外显子23a 作为例, 说明短外显子-显像结合探针在小鼠脑切片 RNA 分析中表现出高特异性的鲁棒杂交信号。更重要的是, 用外显子包含和跳过特定探针检测到的信号可以用来可靠地计算在小鼠大脑不同解剖区域Nf1外显子23a 表达式的值拼接的百分比。给出了分析的实验协议和计算方法。结果表明, BaseScope 提供了一个强大的新的工具来评估作为表达模式的原位。

引言

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替代剪接 (AS) 是一个常见的过程中发生的前 mRNA 成熟。在这个过程中, 一个外显子可以是差异包括在成熟的 mRNA。因此, 通过作为, 一个基因可以产生许多基因编码为不同的蛋白质产品。据估计, 人类基因的92–94% 可替代剪接1,2。基因突变导致的不正常的选择性剪接模式与大量疾病有关, 包括肌萎缩侧索硬化、强直营养不良和癌症3、4。因此, 调查和更好地了解替代剪接调控机制, 以寻求新的人类疾病治疗, 是至关重要的。

通常是以特定于细胞类型的方式来调节的。确定特定基因在给定生物系统中的表达模式是很重要的。然而, 当一个包含许多不同类型细胞的复杂器官 (如大脑或心脏) 被研究时, 这就变得复杂了。在这种情况下, 一个理想的检测系统的选择是 RNA原位杂交 (用组织切片), 因此, 作为特定基因的表达模式可以在许多细胞类型同时检测。事实上, 外显子特定的探针被用来评估替代外显子5,6,7的表达水平。但是, 由于以下原因, 这种方法不太适合....

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方案

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这里所描述的所有涉及老鼠的实验都得到了西方储备大学机构动物护理和使用委员会的批准。2016-0068 号议定书 (PI: 华娄) 的标题是 "在脊椎动物发展中替代性前基因剪接的作用"。

注: 本议定书所用的所有设备、试剂和用品的信息都列在材料表中。

1. 制备福尔马林固定石蜡嵌入 (FFPE) 切片

  1. 弄死 1 CD1 鼠和 1 C57BL/6J 小鼠颈椎脱位。小心切开用手术剪刀和镊子打开头骨。用勺子把大脑移开。
    注: 5 月大的 CD1 雄性小鼠和3月大的 C57BL/6J 雄性小鼠被使用并显示出相似的结果。
    1. 用 PBS 洗脑。通过将整个大脑放在福尔马林溶液的50毫升内, 用含有10% 福尔马林室温 (RT) 的溶液将整个大脑固定在30小时内。
    2. 改变固定的解决方案, pbs 和孵化的大脑在 pbs 过夜4摄氏度。使用标准程序18对二甲苯和石蜡进行脱水和嵌入。
  2. 使用切片将嵌入的组织切成5µm 的部分。首先将石蜡带放在 RT 水浴中, 然后在45摄氏度的水浴中传播丝带。
    1. 当丝带上的皱纹和褶皱消失后, 立即在玻璃滑梯上装上部分。空气干燥幻灯片隔夜在....

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结果

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BaseScope 使用三小鼠菌株: CD1 野生型小鼠, C57BL/6J 野生型小鼠, Nf123/23 , C57BL/6J 背景下的突变小鼠, 其中外显子23a 被包括在所有细胞类型, 由于工程剪接网站突变14,15。

作为第一步, 测试系统使用公司提供的试剂进行检测: 有3T3 细胞的幻灯片, 以及阴性和阳性的探针。如图 3所示, 当使用负控制探头时, 没有检测到信号, 而使用正控探针时检测到许多有斑点的点。

接下来, 使用鼠标大脑部分和Nf1特定的探头进行检测, 这些探针设计用于探测包含.......

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讨论

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这项通信报告的使用 BaseScope RNA, 以检查作为表达模式的小鼠脑科。结果表明, 小于50核苷酸的反感外显子-显子结探针能更准确地靶向外显子夹杂和跳过亚型。此外, 由此产生的信号可以用来计算一个替代外显子的 PSI。

在程序中测试了一些变体。例如, 通过恒温器切片生成的冰冻组织切片进行了测试, 并证明其在该协议中的应用是成功的。然而, 在这种情况下, deparaffinization 步骤在2.1 被改变为洗涤 OCT 与 PBS 5 分钟。此外, 虽然使用由加法器提供的杂交烤箱是非常方便的, 使用一个简单的孵化器设置在40°c 结合一个滑动染色托盘用于免疫组化提供了可比的结果。重要的是要保持在盒子里的水分, 包括湿滤纸在整个过程中。

这个程序有一个限制。目前, 在同一组织幻灯片上执行多色标签是不可行的。因此, 不同的探头只能用于相邻切割, 不同的部分。为了获得准确的 PSI 值, 必须确保探针杂交的潜伏期、信号放大和检测对每个组织切片都是相同的。在未来, 使用多色探针在同一组织幻灯片, 如使用的 RNAscope.......

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披露

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作者没有什么可透露的。

致谢

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这项工作得到了美国心脏协会 (P50CA150964 援助 0365274B)、国家癌症研究所 [胃肠孢子到 Z.W.]、国立卫生研究院的支持 (研究基础设施共享的仪器授权 S10RR031845位于西储大学的光镜成像设备] 和中国奖学金理事会 [X.G.]。
作者感谢理查德. 李在光镜成像核心为他的帮助与幻灯片扫描。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
设备
杂交炉Advanced Cell Diagnostics241000ACD
湿度控制盘（带盖）Advanced Cell Diagnostics310012
染色架Advanced Cell Diagnostics310017
热板Fisher Scientific1160049SH
Imperial III 通用培养箱Lab-Line302
载玻片扫描仪LeicaSCN400
名称Company目录号>评论
试剂
预处理试剂盒Advanced Cell Diagnostics322381
过氧化氢Advanced Cell Diagnostics2000899
蛋白酶 III*Advanced Cell Diagnostics2000901
10x 靶标检索Advanced Cell Diagnostics2002555
BaseScope Detection Reagent KitAdvanced Cell Diagnostics Advanced Cell Diagnostics332910
AMP 0高级细胞诊断2001814
AMP 1高级细胞诊断2001815
AMP 2高级细胞诊断2001816
AMP 3高级细胞诊断2001817
AMP 4高级细胞诊断16229B
AMP 5-REDAdvanced Cell Diagnostics16229C
AMP 6-REDAdvanced Cell Diagnostics2001820
Fast RED-AAdvanced Cell Diagnostics2001821
Fast RED-BAdvanced Cell Diagnostics16230F
50x 洗涤缓冲液Advanced Cell Diagnostics310091
阴性对照探针 - 小鼠 DapB-1ZZ高级细胞诊断701021
阳性对照探针 - 小鼠 （mm）-PPIB-1ZZ高级细胞诊断701081
对照滑片小鼠 3T3 细胞沉淀高级细胞诊断310045
名称公司目录号评论
其他用品
加湿纸先进的细胞诊断310015
洗衣架美国 Master Tech Scientific9837976
洗碗美国 Master Tech ScientificLWS20WH
疏水屏障笔矢量实验室H-4000
载玻片Fisher Scientific12-550-15
盖玻片，24 mm x 50 mmFisher Scientific12--545-F
名称<strong>Company目录号评论
化学品
氢氧化铵Fisher Scientific002689
100% 乙醇 （EtOH）Decon Labs2805
甲醛溶液Fisher ScientificSF94-4
苏木精 I美国 Master Tech Scientific17012359
封片培养基Vector LabsH-5000
二甲苯Fisher Scientific173942

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, E. T., et al. Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes. Nature. 456, 470-476 (2008).
  2. Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcrip....

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Alternative Splicing AnalysisRNA In Situ HybridizationBaseScope TechnologyExon Inclusion DetectionExon Skipping DetectionPercent Spliced In CalculationMouse Brain SectionsNF1 Exon 23aProbe HybridizationSignal Amplification

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