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方法文章

一种用于人体脂肪的微生理平台：夹心式白色脂肪组织

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DOI：

10.3791/57909

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2018年8月15日

 ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, Louisiana State University Health Sciences Center, 2Department of Surgery, Louisiana State University Health Sciences Center

本文内容

摘要

目前，白色脂肪组织（WAT）的主要原代培养模型存在关键缺陷，阻碍了药物开发和代谢研究的进展。本文介绍了一种通过将WAT夹在间充质细胞层之间来构建脂肪组织微生理系统的方法。该结构为WAT的原代培养提供了一个稳定且可调节的平台。

摘要

白色脂肪组织（WAT）在调节体重和日常健康中发挥着关键作用。然而，现有的原代培养模型存在显著局限性，均未能真实再现脂肪组织微环境，或使WAT的存活时间超过两周。可靠原代培养模型的缺乏严重阻碍了WAT代谢研究和药物开发。为此，我们依据美国国立卫生研究院（NIH）微生理系统标准，开发了一种新型WAT原代培养平台，称为“SWAT”（夹心式白色脂肪组织）。通过将切碎的WAT细胞簇夹在脂肪来源的基质细胞层之间，我们克服了脂肪细胞天然的浮力问题。在此结构中，WAT样本在体外培养中可存活超过八周。SWAT保留了完整的细胞外基质（ECM）、细胞间接触以及物理压力 体内 WAT 条件下；此外，SWAT 能够维持稳定的转录谱、对外源性化学信号的敏感性以及完整的组织功能。SWAT 是一种简单、可重复且高效的原代脂肪组织培养方法。该技术有望成为研究 WAT 生理学、病理生理学、代谢过程及药物开发的广泛应用平台。

引言

脂肪组织是肥胖症的主要器官，其在美国每年直接医疗费用介于1470亿至2100亿美元之间1。脂肪组织的积聚还会导致心脏病、2型糖尿病以及某些癌症等其他主要死亡原因2。体外培养模型对于代谢研究和药物开发至关重要，但目前的脂肪组织研究模型存在重大缺陷。脂肪细胞是脆弱、具有浮力且终末分化的细胞，无法贴附于细胞培养塑料表面，因此不能采用常规的细胞培养方法进行培养。自20世纪70年代以来，已有多种方法被尝试用于克服这些障碍，包括使用玻璃盖玻片、顶壁培养、悬浮培养以及细胞外基质等方法3,4,5,6,7。然而，这些方法常伴随细胞死亡和去分化现象，通常仅用于不超过两周的研究周期。此外，这些模型并未尝试重建天然脂肪组织微环境，因其未能维持完整的细胞外基质（ECM）、脂肪细胞与基质支持细胞之间的相互作用，以及体内白色脂肪组织（WAT）中细胞间相互施加的收缩力。

由于目前尚无公认的金标准原代脂肪细胞培养方法，脂肪组织研究主要依赖于分化后的前脂肪细胞（diffAds）。diffAds 具有多房脂滴、贴壁生长且代谢活跃的特性。相比之下，原代白色脂肪细胞为单房脂滴、非贴壁生长，且代谢活性相对较低。现有脂肪细胞培养模型无法有效模拟健康成熟脂肪组织的生理状态，这很可能是导致目前尚无经 FDA 批准、可直接靶向脂肪细胞的药物问世的重要原因。事实上，缺乏生理性 体外 器官模型在大多数器官和疾病中都是一个主要问题。

在其宣布启动微生理系统（Microphysiological Systems, MPS）计划的立场文件中，美国国立卫生研究院（National Institutes of Health, NIH）报告称，2013年所有人类药物临床试验的成功率在II期临床试验中仅为18%，在III期临床试验中为50%8MPS 项目旨在直接解决 体外 单培养体系用于模拟人体生理功能。美国国立卫生研究院（NIH）将器官芯片系统（MPSs）定义为由人源原代细胞或干细胞组成的多细胞三维结构培养系统，可重现器官功能。与简化的同质性永生化细胞培养模型不同，MPSs 应能准确模拟细胞间、药物-细胞、药物-药物以及器官-药物之间的相互作用。9与短期原代培养方法不同，美国国立卫生研究院（NIH）标准要求微生理系统（MPS）在培养中可持续维持超过4周。8有关MPS项目的更多详情，请参见美国国立卫生研究院（NIH）的RFAs（#RFA-TR-18-001）10.

我们开发了一种简单、新颖、可调且低成本的脂肪类微生理系统，称为 "夹层状白色脂肪组织" （SWAT）11通过克服脂肪细胞的天然浮力 "三明治法" 在脂肪来源的基质细胞（ADSCs）层之间加入切碎的原代脂肪组织（图1）。所形成的三维结构通过在成熟脂肪细胞周围包裹天然的脂肪细胞支持细胞群体，重现了细胞间的相互接触以及天然的脂肪组织微环境。SWAT 已通过实验证实可维持8周的细胞存活率，并具有对外源信号的响应能力、分泌脂肪因子的能力以及在动物模型中的移植整合能力。

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方案

所有操作均按照LSUHSC-NO机构审查委员会（IRB）批准的方案#8759和#9189执行。所有动物实验均按照LSUHSC-NO机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的方案#3285执行。

1. 夹心细胞片的接种

注意：见图1。

  1. 在组织培养板（6 cm 或 6 孔板）中以约 80% 汇合度接种 ADSCs。每制备一孔 SWAT，需接种一孔常规组织培养板以及一孔相应尺寸的聚(N-异丙基丙烯酰胺)（pNIPAAm）包被的组织培养塑料板。
    注意：因此，进行一次SWAT实验需要在一个6孔标准组织培养板（底层）和一个6孔pNIPAAm涂层组织培养板（上层）上分别接种细胞。pNIPAAm涂层板可从商业途径购买，也可在实验室自行制备。12,13,14.
  2. 将ADSCs在37 °C和5% CO₂条件下培养2 在添加了10% FBS和1×青霉素/链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中. 每2天更换一次培养基。
  3. 待细胞融合至100%并呈现条纹状排列（约6–8天）。
    注意：这些细胞需要作为一个完整且连续的细胞层发挥作用，以稳定漂浮的脂肪组织。若细胞融合度不足，在接种白色脂肪组织（WAT）时会发生碎片化。

2. SWAT 物资的准备

  1. 准备若干份10 mL的1×Hank's平衡盐溶液（HBSS）；根据所需培养板的数量准备足量溶液，并留有余量。
  2. 为SWAT接种准备活塞装置。使用简单的丙烯酸塑料制作活塞，由连接至圆形圆盘的杆部构成。确保其可放入组织培养孔的周长范围内（直径：<6 cm用于6 cm培养皿，<3.5 cm用于6孔板；近似质量：6 cm培养皿用为6.7 g，6孔板用为5.1 g）。
    1. 额外准备若干活塞，以确保在个别活塞出现问题时实验仍能顺利进行。
    2. 用实验室胶带在活塞圆盘边缘至少缠绕两圈，以防止明胶溶液泄漏。
    3. 用70%乙醇喷洒生物安全柜（BSC），并在其中的15 mL锥形管架上放置空的、未加盖的15 mL锥形管；这些管子有助于固定明胶活塞的位置。
    4. 将每个缠好胶带的活塞充分喷洒70%乙醇，然后放入架子上的15 mL锥形管中。同时喷洒金属垫圈（近似质量为6.3 g），并将其与一对钩形镊子一起放置在架子上；这些垫圈将在SWAT接种过程中为活塞增加重量。
    5. 关闭生物安全柜的滑动窗，打开紫外灯以促进干燥和灭菌。
      注意：理想情况下，应在SWAT接种前24小时完成此步骤。若无法提前，也可在组织采集/SWAT接种当天进行，但需预留15–45分钟用于紫外干燥/灭菌。

3. 明胶冲头的制备——应用于上层细胞片

  1. 将水浴锅加热至 75 °C。
  2. 通过将 0.75 g 明胶粉末加入 10 mL 的 1× HBSS 储备液中来制备明胶溶液。在通风橱内加入 100 µL 的 1 M NaOH 以调节溶液 pH 值。
    1. 将 10 mL 储备液放入水浴锅中，每 5 分钟剧烈振荡一次，直至粉末完全溶解。建议在将明胶加入加热的水浴后尽快使其溶解。
    2. 开启生物安全柜风机，关闭紫外灯，并升起前窗。喷洒消毒生物安全柜表面，准备过滤所需材料（5 mL 带锁扣注射器和 0.2 µm 注射式滤器）。准备多个滤器，以便高效过滤足量明胶用于涂布活塞。
  3. 当明胶溶液达到均匀状态后，过滤该溶液并将其涂布于活塞上。用注射器吸取明胶溶液，通过注射式滤器将明胶涂布在塑料活塞上（6 孔板约需 2.5 mL，6 cm 培养皿约需 4.5 mL），静置使其凝固（约 20 分钟）。
  4. 明胶完全凝固后，揭开活塞边缘的胶带。使用弯头镊子小心去除活塞外缘的明胶（i.e., 弯月面的凸起边缘部分），确保活塞中心残留的明胶表面完全平整，以最大化与 ADSC 细胞片的接触面积。
  5. 去除多余明胶后，轻柔地将明胶活塞置于 pNIPAAm 涂层的 ADSC 培养板上。使用金属垫圈压住活塞。在放置活塞时避免对细胞片造成剪切损伤。
  6. 在室温下使活塞与细胞片共置 1.5 小时。随后将培养板/活塞置于冰水浴中孵育 1.5 小时，以完成细胞片从 pNIPAAm 涂层培养板表面的解离。
    1. 在冰浴孵育过程中需格外小心，避免冰水浴中的水污染细胞培养基。
    2. 孵育结束后，清洁 pNIPAAm 涂层培养板底部，去除非无菌水分。

4. 白色脂肪组织处理

  1. 从手术室收集人脂肪组织时，将所有样本置于冰上的无菌容器中，直至准备接种SWAT。向脂肪组织容器中加入无菌维持培养基（如磷酸盐缓冲液，PBS），以保持组织稳定性。
  2. 为每个待接种的孔/培养皿准备1.5 mL离心管，并向其中加入冷的细胞培养基（6孔板每孔100 µL，6 cm培养皿每皿200 µL）。
  3. 切碎脂肪组织。
    1. 对于固态脂肪组织片段，按以下步骤操作：
      1. 用无菌PBS清洗大块脂肪组织3次，并尽可能去除PBS。
      2. 使用镊子和无菌刀片粗略切碎组织，并尽可能去除血管和筋膜（详见讨论部分）。
      3. 用刀片进一步精细切碎脂肪，直至组织呈浓稠液态状。
        注：理想情况下，组织应呈现均一状态，无可见的独立WAT片段，但并非总能实现。
    2. 按以下步骤处理吸脂物：
      1. 在生物安全柜内，将无菌纱布覆盖于烧杯口并用胶带固定，并将该烧杯置于更大的烧杯内，以收集多余液体。
      2. 使用25 mL移液管吸取所需量的吸脂物，将其加至无菌纱布表面。直接向该表面加入PBS，以清洗吸脂脂肪并去除多余的血液和脂质残留物。
      3. 使用镊子回收滤下的组织，转移至无菌切碎表面，并对吸脂物进行切碎处理。
  4. 使用无菌刀片切去p1000移液枪头的远端，以便转移切碎的组织；此举可最大限度减少可能导致脂肪细胞裂解的剪切应力。当达到合适的组织稠度后，将所需体积的切碎组织转移至各1.5 mL离心管中（6孔板每管300–400 µL，6 cm培养皿每管500–600 µL）。在管中短暂混匀切碎的WAT与培养基。
  5. 取出基础ADSC培养板，弃去或吸除原有培养基，并用各1.5 mL管中的WAT/培养基混合物替换。
    1. 轻轻将pNIPAAm包被板上的明胶塞从板上取出，将其置于基础ADSC板的WAT混合物表面。在显微镜下观察pNIPAAm包被板的单层细胞，确认细胞已脱离。
  6. 在生物安全柜内将加热块预热至约37–40 °C。保持明胶塞原位，将培养板移至加热块表面。加入2–3 mL预热的培养基，以孵育细胞并促进明胶融化。
  7. 约30分钟后，轻轻从板表面移除明胶塞。盖上基础组织培养板的盖子，并转移至细胞培养箱。待明胶在37 °C完全液化后，吸除并更换细胞培养基。
  8. 将SWAT维持在37 °C、5% CO2条件下，使用不含酚红的M199培养基，添加7 µM胰岛素、30 µM地塞米松和1×青霉素/链霉素。6孔板每孔维持约2 mL培养基，6 cm培养皿每皿3 mL。每2天更换一次培养基。

5. SWAT 收获

  1. 准备胶原酶溶液（0.5 mg/mL 胶原酶，500 nM 腺苷，溶于 PBS 中），分装至 15 mL 圆锥形离心管中（每管约 10 mL）。将离心管冷冻后于 -20 °C 保存。
  2. 吸弃细胞中的任何培养基，用 PBS 洗涤 1 次，然后吸弃 PBS。将胶原酶分装液在 37 °C 水浴中解冻，完成预处理。
    注意：胶原酶溶液应 ideally 达到 37 °C；随后立即加入组织。
  3. 将SWAT板中的全部组织加入到各个分装管中。使用无菌细胞刮刀收集SWAT，并用截头的P1000移液枪头将其转移至含有胶原酶的分装管中。将组织直接加入含有胶原酶溶液的15 mL离心管中。
    1. 或者，将组织/胶原酶混合物置于50 mL锥形管中孵育；增大的表面积将进一步促进酶消化。
  4. 将样本管置于恒温振荡摇床中，呈45°角。在37 °C、200 rpm条件下孵育30–60分钟。
  5. 将一个250 µm的筛网滤器放入新的15 mL圆锥形离心管中用于收集。将消化后的脂肪细胞溶液倒入滤器中过滤。
    注意：这将允许所有细胞通过，同时滤除纤维组织。
  6. 让流穿液在室温下静置5分钟，以使相分离充分进行。
    注意：脂肪细胞将漂浮至溶液上层，而脂肪基质细胞（ASCs）则会沉降至下层。在500 × g条件下离心5分钟 g 还可以最大化细胞分离效果，或收获沉淀物中周围的ADSCs。
  7. 使用截断的 p1000 移液枪头，将脂肪细胞（胶原酶溶液顶部的漂浮层）转移至 1.5 mL 微量离心收集管中。每次吸取约 250 µL，沿管壁缓慢移液以收集脂肪细胞。
    1. 缓慢旋转离心管，同时收集脂肪细胞，以最大限度地回收黏附在管内壁的细胞。持续吸取更多细胞，直至1.5 mL 微量离心管装满。
  8. 使用连接针头（约21 G）的注射器去除分离的脂肪细胞中多余的液体。将针头浸入漂浮的脂肪细胞层下方，轻轻晃动针头以使附着在针 shaft 上的细胞脱落，然后等待脱落的脂肪细胞重新浮至液面顶部。
  9. 缓慢吸取多余液体，注意避免意外移除脂肪细胞。使用微量离心管的刻度线以确保所分离的样品体积一致（例如，。每个样品0.1 mL。
  10. 使用分离的细胞进行 DNA/RNA 提取、葡萄糖摄取实验、脂解实验， 等等。

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结果

通过在约7.6周内对单个WAT细胞簇（n = 12）进行连续明场成像，初步评估了SWAT的存活能力。在此期间，细胞簇始终固定在单层上。观察到轻微的形态学变化，个别脂肪细胞略有变形或位置移动。然而，脂肪细胞随时间推移并未出现多房性结构，表明未发生去分化，也未表现出细胞死亡的可见迹象，如细胞出泡、裂解或碎片化（图2）。通过脂质染料尼罗红（NR）对培养两周的SWAT进行染色，确认了细胞簇的脂肪细胞特性。单房性脂肪细胞簇呈现清晰的NR染色，表明这些确实是具有完整细胞膜的脂肪细胞，而非人工假象、囊肿或死亡脂肪细胞。周围ADSC层未见NR染色，表明这些细胞未积累脂质，因而自身未向脂肪细胞谱系分化（图3a）。对培养53天的SWAT进行碘化丙啶染色，在后期时间点脂肪细胞簇内未见染料摄入，表明无细胞死亡发生（图3b）。对培养51天的SWAT进行油红O（ORO）染色，脂质染色定位于固定的脂肪细胞簇内，表明即使在后期...

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讨论

本方案详细介绍了使用脂肪源性基质细胞（ADSCs）包裹人白色脂肪组织的方法；人源ADSC细胞系可通过成熟的既定方案分离获得15。然而，该系统可根据个体化研究需求进行调整（例如，使用3T3L-1细胞包裹小鼠WAT）。该操作涉及人原代组织的处理，应采取标准安全防护措施；将人组织视为生物安全二级（BSL-2）病原体（例如，HIV、HepC）进行操作。所有组织操作必须在生物安全柜（BSC）内进行。穿戴机构安全标准规定的全部适当个人防护装备（PPE），强烈建议佩戴双层手套。所有用品和废弃物在重复使用或丢弃前，须用10%次氯酸钠溶液或70%乙醇溶液彻底消毒。

SWAT 培养的首个关键步骤是获取并维持经 pNIPAAm 涂层的组织培养板。此类培养板可从商业途径获得，也可通过既定方法自行制备。12,13,14这些培养板具有温度响应性的细胞培养表面。...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢路易斯安那州立大学健康科学中心提供的机构支持，该中心为本项目提供了资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10x HBSSThermofisher14185052
明胶Sigma-aldrichG9391
胶原酶Sigma-aldrichC5138
腺苷Sigma-aldrichA9251
DMEMThermofisher11995065
M199 培养基Thermofisher11043023无酚红 
250 µm 网格滤器Pierce87791
0.2 µm 注射器滤器Celltreat229747
5 mL 鲁尔锁注射器 BD309646
金属垫圈这些是普通的金属垫圈，可在任何五金店购买。它们可为冲头背面提供适当重量，以确保细胞与明胶之间均匀接触，同时易于储存和灭菌。近似质量：6.3 g 
名称公司目录编号备注
加热设备
恒温振荡摇床VWR10020-988样品应以45°倾斜角放置，以促进胶原酶消化
加热块设定为37–40 °C，并置于生物安全柜下方
水浴锅设定为约75 °C
名称公司目录编号备注
专用塑料器皿
Upcell 培养皿（6 cm）或 6 孔板Nunc174902  或 174901这些是市售的聚异丙基丙烯酰胺（pNIPAAm）包被培养皿，可用于培养ADSC的上层细胞层。也可在实验室自行制备pNIPAAm包被的培养板。直径：<6 cm（6 cm培养皿），<3.5 cm（6孔板）；近似质量：6 cm培养皿为6.7 g，6孔板为5.1 g
塑料冲头装置可定制以适配所需的pNIPAAm包被塑料器皿（多孔板、培养皿）。其结构由连接至圆形盘片的简单杆状部分组成。可在实验室自制，或由具备丙烯酸塑料加工能力的机构加工制作

参考文献

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