本研究旨在实现对大鼠运动功能障碍的自动化定量评估。初步评估模型用于检测运动皮层内皮质微电极植入所导致的运动功能丧失。我们报道了一种追踪算法的开发与应用，该算法使用易于调整、简单且 readily available 的编码软件。
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摘要
摘要
我们最近证明，在大鼠的运动皮层植入皮层内微电极会导致立即且持续的运动功能障碍。 运动功能障碍通过开放场地网格实验手动量化，以评估粗大运动功能，同时通过梯子实验评估精细运动功能。本文中，我们介绍一种利用自主开发的卡帕多纳行为视频分析系统（Grid and Ladder Test，简称 BVAS）对视频记录的实验进行自动量化分析的技术。该程序基于简单且易于获取的编码软件（见材料表），可实现对单只动物在开放场地网格实验和梯子实验中的运动轨迹追踪。在开放场地网格追踪中，程序通过视频强度阈值化处理，追踪大鼠在3分钟网格实验期间的位置变化并分析其运动路径，随后计算并输出总移动距离、达到的最大速度、向左和向右转弯的次数，以及大鼠跨越的网格线总数等参数。在梯子实验追踪中，程序同样通过强度阈值化处理视频，追踪大鼠在梯子上的移动过程，并返回计算结果，包括大鼠穿越梯子所用时间、爪子滑落至梯阶平面以下的次数，以及因停滞或倒退导致的失败发生率。我们预期，本文开发的BVAS系统可广泛应用于多种研究场景中的运动功能分析，包括多种损伤或疾病模型。
引言
已有多种成熟方法可用于评估功能性和行为性运动及认知障碍1,2,3一些较为常用的方法包括测试精细运动功能 通过 爪子放置、迈步及肢体协调性在梯子测试中的评估4，测试大肌肉运动功能和应激行为 通过 开放旷场网格实验5,6以及恐惧、抑郁和绝望的检测 通过 强迫游泳实验7,8 或转子杆9然而，这些方法中的许多依赖于人类研究人员来 "评分" 动物或主观判断其表现。依赖主观的人工评估可能减缓数据的生成与分析速度，并为研究中故意或无意的偏倚影响提供可能10此外，对数据的主观评估也存在数据表征不准确的风险，可能源于遗忘、积极性不足、培训不当或疏忽。11.
我们近期报道了在植入皮层内微电极的大鼠中同时使用开放场地网格实验和梯子实验的研究12,13。由于这些研究结果具有新颖性，我们立即在实验室多个正在进行的研究中开始采用这些及其他功能性测试方法。考虑到随着主观评估人员数量的增加，可能无意中引入人为变异，并为了提高分析通量，我们着手开发一种自动化的计算机辅助程序来评分行为学测试，从而极大限度地减少出错的可能性。
本文报道了BVAS的开发。BVAS利用计算机分析对开放场地网格实验和梯子实验进行评分，分别作为粗大运动功能和精细运动功能的指标。该结果可用于阐明由损伤或疾病引起的潜在运动功能缺陷，而不限于特定的损伤或疾病模型。分析代码可进行调整，以适应行为测试设备的变化，或用于评分多种运动功能指标。因此，BVAS的应用范围广泛，可超越本研究的预期用途，也可超越其他实验室当前所采用方法的预期用途。
请注意，开放场地网格和梯子测试需要进行视频录制。因此，每次测试都需要一台摄像机［1080 p，最低15帧/秒（fps）］、一台笔记本电脑以及一个用于存储视频数据的房间。对于这两项测试，应将摄像机置于正中位置，确保整个装置都能完整呈现在画面中。将摄像机固定在三脚架或支架上，以防止测试过程中发生移动。尽量使视频画面的边缘与测试装置的边缘保持平行。确保由相同的人员完成所有测试操作，并且测试房间光照充足，具备温控系统。在整个测试过程中，所有动物均应在同一房间内进行测试，且房间环境应尽量保持不变。谷物或香蕉片是良好的奖励物，可用于鼓励动物完成行为测试。
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方案
所有实验程序和动物护理操作均经路易斯·斯托克斯克利夫兰退伍军人事务医疗中心机构动物护理与使用委员会批准，并遵循其规定执行。行为学检测方案 closely follows 之前发表的研究12,13。
1. 行为学测试：任务拍摄
注意：此处对动物进行了为期8周的测试，以检测是否存在任何慢性行为变化。研究持续时间取决于研究所采用的应用/损伤/疾病模型。
- 开放场地网格测试
注意：网格测试的距离为 1 m2 四周设有40 cm高的墙壁，由本实验室自行建造。底部被划分为九个方格 通过 鲜艳的彩色胶带（图1A）。使用自动化BVAS时，线条和网格的颜色必须与大鼠形成对比。本实验使用白色Sprague Dawley大鼠，因此将网格背景涂成黑色，并用亮粉色胶带制作线条。- 每周对动物进行两次测试，包括研究开始前的一周，以建立用于后续计算的基线评分。
- 每次检测开始前以及每只动物检测之间，使用基于二氧化氯的消毒剂清洁所有检测设备。
- 将动物带入测试房间，并在开始试验前让其适应环境20分钟。
- 开始录像，并将动物置于网格中央，使其背对研究人员，以开始网格实验。
- 让动物自由奔跑3分钟，同时从上方进行视频录制。
- 3分钟时间结束后停止拍摄，并将动物放回其饲养笼中。使用基于二氧化氯的消毒剂清洁网格，注意在测试前将表面彻底晾干。每只动物每次实验测试1次。
- 梯度测试
注意：梯子测试装置为实验室自制，由两块长度均为1米的丙烯酸侧板组成，侧板之间以直径3 mm的横杆连接，横杆间距为2 cm图2动物在开始正式测试前需要进行一周的梯子训练。训练与测试所用的方案没有区别。注意：训练过程无需录像。- 使用BVAS时，用黑色海报纸覆盖梯子后方的墙面，并用亮色胶带标出横档、起始线和终点线的位置，以与白色大鼠形成对比。
- 每周对动物进行两次测试，包括研究开始前一周，以建立基线评分，用于后续计算。
- 每次检测开始前以及每只动物检测之间，使用基于二氧化氯的消毒剂清洁所有检测设备。
- 将动物带入测试房间，在开始试验前让其适应环境20分钟。
- 在进行梯子行走测试前，将动物放置于清洁的临时笼具中。
注意：临时笼子是在动物的家笼用于梯子末端实验时，暂时安置动物的短期笼子。本研究中所有动物年龄相同，并在相同时间段内完成测试，因此不存在年龄偏差。此处使用的对照为从未接受过手术的 naïve 动物。 - 将梯子装置设置为连接两个笼子；起始笼为清洁的笼子，终点笼为动物的居住笼，作为动物完成跑程的激励。
- 将相机安装在三脚架上，对准梯子的纵向中心。调整三脚架高度，使相机镜头与梯子横档齐平。调整相机位置，确保横档与镜头精确对齐，这对BVAS代码中的打滑检测算法至关重要。
- 开始录像，并让大鼠以前肢握住梯子的第一级横杆以启动运行。让动物在无辅助的情况下自行移动到梯子上。
- 让动物以自己的速度从起点线移动到终点线，同时进行录像。当动物完成跑动后，停止视频录制，并将动物从梯子上移开。
- 如果动物在跑动过程中转身或停滞超过20秒，则视为一次失败的运行。当动物失败时，结束视频录制并将动物从梯子上移除。对失败的运行赋予一个惩罚分数，该分数等于术前基线测试中记录的最慢时间。
- 确保每只动物每天完成5次运行试验，每次试验之间给予1分钟的休息时间。
注意：本研究中，动物每周测试2次，持续8周。然而，具体时间安排由研究人员自行决定。
2. 文件存储与命名
注意：BVAS 代码使用特定指定的视频文件和文件夹命名规范，以确保视频能够被可靠地解析和正确分析。目前不支持其他命名规范。测试会话完成后，视频文件将保存在默认位置，并采用默认名称。
- 单个视频命名
- 为所有网格测试视频中的动物编号命名。
- 每次测试为每只动物采集5段梯子行走视频。选择全部5段视频，并使用动物的编号重命名第一段视频。例如，如果动物的编号为 "C1NS"，文件的命名方式为 "C1NS (1)", "C1NS (2)", "C1NS (3)", 等等。
- 存储文件夹命名
- 将现在以每种动物命名的视频文件分别放入各自的存储文件夹中。文件夹命名请遵循以下格式： "测试周_测试模式_MM_DD_YY".
注意：例如，如果此文件夹包含第一周的网格视频，且拍摄于1月1日st，2018年，存储这些视频的文件夹被命名为 "第1周_网格测试_01_01_18". - 将此特定命名的文件夹放入另一个文件夹中，该文件夹用于标识本组实验所属的更大规模研究。
注意：文件夹树系统对研究和测试模式的命名没有特定要求。系统唯一指定的文件夹是存放按步骤 2.2.1 命名的视频的文件夹。
- 将现在以每种动物命名的视频文件分别放入各自的存储文件夹中。文件夹命名请遵循以下格式： "测试周_测试模式_MM_DD_YY".
- 电子表格文件创建
- 使用外部电子表格程序（参见 材料表），为每个研究和测试模式创建一个新的空白电子表格文件以存储数据。
注意：该文件的命名和存储位置没有特殊要求。每个研究项目需要两个电子表格文件供系统使用，一个用于网格测试，另一个用于梯形测试。目前请将这两个文件保持空白。 - 确保在BVAS运行期间，这些电子表格文件未在任何计算机上打开。
注意：如果 BVAS 尝试打开一个已处于打开状态的电子表格文件，将导致错误。
- 使用外部电子表格程序（参见 材料表），为每个研究和测试模式创建一个新的空白电子表格文件以存储数据。
3. 系统安装
注意：BVAS 在 PC 操作系统上构建和测试，依赖于简单且易于获取的编码软件的运行时组件。目前不支持其他系统配置。
- 安装最新版本的 BVAS
- 双击标有“BVASX.XXinstaller”的安装程序图标以运行安装程序。"X.XX" 为当前版本号，目前为“BVAS3.30installer”。
注意：这是开源软件。如需获取最新版本，请联系通讯作者。 - 按照屏幕上的说明完成 BVAS 的安装。
注意：安装程序将检查系统中是否已安装正确版本的软件（例如，MATLAB Runtime），若未找到，将从互联网自动安装所需软件。 - 安装完成后，点击“BVAS.exe” 文件启动程序。
- 双击标有“BVASX.XXinstaller”的安装程序图标以运行安装程序。"X.XX" 为当前版本号，目前为“BVAS3.30installer”。
4. 系统使用
- 启动程序
- 双击 BVAS 程序图标以打开 BVAS 主菜单，该菜单提供以下选项：网格分析', '梯度分析', '梯子审阅，或‘退出'.
注意：左上角还有一个下拉菜单，标有“电子邮件设置' (图3A).
- 双击 BVAS 程序图标以打开 BVAS 主菜单，该菜单提供以下选项：网格分析', '梯度分析', '梯子审阅，或‘退出'.
- 电子邮件设置
- 点击“电子邮件设置下拉菜单中首先选择“更改电子邮件目的地'.
- 输入一个首选电子邮箱地址，以接收有关分析的更新，并选择“好的选择“取消”以保留当前已保存的电子邮件地址不变。
- 点击“发送测试邮件单击“发送测试邮件”按钮，向系统中当前保存的电子邮件地址发送一封测试邮件。关闭“邮件已发送！测试完成的弹出窗口提示。
- 开放场地网格测试分析
- 选择“网格分析从顶部菜单屏幕。
- 确保标有“单个视频/整段会话/绘图数据正在显示整个测试会话，以完成对整套测试会话视频的分析。
- 利用“…单击上方输入框旁边的“浏览”按钮，浏览文件系统以找到待分析的视频文件。选择按照步骤2.2.1中所述命名方式标注的文件夹。
- 使用下方输入框旁边的 … 按钮浏览文件系统，以选择用于存储数据的电子表格文件。
注意：除了将数据输出到电子表格文件外，每个视频的完整路径数据还存储在与步骤 4.3.3 中选定视频所在目录相同的文件夹中的数据文件（.mat）内。 - 确保第 4.3.2 步中提到的切换按钮设置为“开启”状态单个视频以完成单个视频的分析。
- 利用上方输入框旁边的 … 按钮浏览文件系统，以找到待分析视频的文件。
- 利用下方输入框旁的 … 按钮浏览文件系统，选择用于保存单个视频分析生成的数据文件（.mat）的目录。
注意：数据文件的名称将沿用视频的名称，而视频的名称则根据动物命名。 - 选择“输出数据步骤4.3.2中提到的切换开关，以输出先前已分析的网格视频数据。此类绘图数据的示例如下所示： 图1B 和 1C.
- 利用上方输入框旁边的 … 按钮浏览文件系统，选择先前创建的网格视频数据文件。选择“开始！用于生成图表和数据图。
注意：此功能还会创建一个文本文件，该文件与数据文件同名且位于同一目录中，其中包含动物的运行数据。 - 找到两个必要文件后，选择“开始！开始视频分析。请注意，'返回“按钮将重新打开顶部菜单和”退出“按钮将完全关闭程序。请选择“调试显示切换以显示跟踪算法的可视化表示图3C 和 3D).
- 选择“开始！ 开始分析过程。在审阅屏幕中检查每个视频的图像。使用“下一步和上一步如果视频超过五个，则显示页面按钮。
- 要调出手动选择菜单，请选择“编辑如果未显示绿色线条，或绿色线条未正确出现在检测区域周围的方框内，请点击“校准”按钮。如需编辑角落，点击“编辑角落”按钮。
注意：该“下一帧“按钮”将代表图像更改为相关视频的下一帧。选择“下一帧如果自动给出的帧被遮挡或失焦，请点击“调整”按钮。 - 按照代表性图像右侧的说明选择检测区域，然后点击“开始测试”输入以完成筛选过程。
注意：所选的绿色线条现在将显示在代表性图像上。 - 选择“完成以保存选择并返回审阅者界面。
- 选择中心完成单击“开始”按钮，以在正确选定每个视频的网格区域后启动完整的分析流程。运行程序直至完成，完成后将弹出成功提示。
注意：对一整段视频进行完整分析可能需要一定时间，大约每只动物10分钟。
- 梯度测试分析
注意：初始梯度测试分析的方案与步骤 4.3.10–4.3.15 中所述方案非常相似。在上述步骤之前的主要差异如下：- 选择“梯度分析从顶部菜单中选择以打开梯形分析菜单。
- 查看切换按钮中的两个选项，单个视频和完整实验过程' (图3B).
- With '完整会话选择上方的输入…按钮，以选取在步骤2.2.1中命名的含有梯子视频的文件夹。选择下方的…按钮，以指定一个目录，用于保存包含梯子视频数据的文件夹，以便后续查看。
- 如果“单个视频选择“”后，使用上方的…按钮选择单个视频文件，并选择与步骤4.4.3中相同的位置。
- 选择“开始！开始分析过程，并调出梯子测试区域评审界面。
- 按照与网格相同的方法，对ladder执行4.3.10–4.3.15步骤。运行程序，待完成后将出现成功提示。
注意：如果分析过程中出现问题，系统将向第4.2.2步中输入的电子邮件地址发送邮件。任何类型的分析完成后，系统会向同一电子邮件地址发送完成通知邮件。
- 梯形图像分析
注意：以下方案用于回顾已分析的梯子行走视频，以确认是否存在失败情况及脚掌打滑现象。注意，梯子穿越的电子表格文件需等到“梯度图像审查（步骤 4.5.1–4.5.5）已完成。- 从顶部菜单中选择“梯度图像审查这将打开梯形图审核文件选择界面。
- 单击顶部的“…”按钮，选择数据文件所在的文件夹。
注意：文件将保存在步骤 4.4.2 中选择的位置，文件命名格式如下： "M1_D1_Y1 梯子视频会话 HH_MM M2_D2_YYYY"M1、D1 和 Y1 是被分析会话的日期。 "梯度视频实验" 将进行读取 "单视频分析" 如果仅分析了一个视频。HH_MM 和 M2_D2_YYYY 分别为审查会话开始的时间和日期。 - 选择底部的 … 以选中为本研究创建的电子表格文件。
- 选择“开始！ 开始人工审核流程。
- 查看自动打开的梯形图数据审查菜单。如果检测到滑移，请使用“下一帧和最后一帧使用“上一帧”和“下一帧”按钮查看可用的连续录制帧。
- 使用滑动切换开关标记大鼠哪一侧后肢发生滑动。保持切换开关处于“开启”状态无滑脱如果检测结果为假阳性，请点击保存/继续以进入下一个检测（图2A).
- 若实验失败，使用切换按钮标明失败原因为逆行（大鼠在运行过程中掉头）或停滞（大鼠未能在规定时间内完成运行）。
- 点击“保存/继续以进入下一次检测。在最后一次检测时，点击“保存/继续完成分析并将数据保存到之前选择的电子表格文件中。关闭完成提示。
注意：审核完成后，被审核的文件夹将被重命名 "已审核 M1_D1_Y1 梯子视频会话 HH_MM M2_D2_YYYY".
5. 输出数据分析
- 网格视频数据表格文件
- 从每个网格视频对应的表格文件中找到已创建的数据。
注：列的顺序从左至右依次为：动物名称、测试日期、研究周数、总移动距离、总静止时间、达到的最大速度、右转次数、左转次数以及跨越网格线的次数（图 1D）。 - 利用这些指标量化动物的粗大运动功能，并在不同动物及不同时间点之间创建对比图。
- 从每个网格视频对应的表格文件中找到已创建的数据。
- 阶梯视频数据表格文件
- 在完成失败事件和足部打滑审查后，从每个阶梯视频对应的表格文件中找到已创建的数据。
注：列的顺序从左至右依次为：动物名称、运行编号 1–5、研究周数、测试日期、运行类型（成功或失败）、成功运行的时间、完成百分比、每只足的打滑次数以及失败模式。对于失败的运行，时间列为空，失败模式列将标注为“回退”或“停滞”（图 2B）。 - 利用这些指标量化动物的精细运动功能，并在不同动物及不同时间点之间创建对比图。
- 在完成失败事件和足部打滑审查后，从每个阶梯视频对应的表格文件中找到已创建的数据。
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结果
按照本文所述方法，大鼠每周完成2次开放旷场方格测试和梯子测试。数据由经过培训的和新手的评估人员使用BVAS系统以及手动秒表方式进行分析。所展示的结果来自一项为期8周的研究中一只未植入装置的对照动物，为每周原始得分的平均值，其中第“0”周对应基线测试。请注意，第1周未进行测试，因为该周为手术动物的休息周。由于开放旷场方格测试每天进行1次，梯子测试每天进行5次，每周进行2天测试，因此在相同的8周时间内，开放旷场方格测试共有16次试验样本，而梯子测试则有80次试验样本。
BVAS 与 手动分析：
为验证BVAS系统的稳定性并将其与人工分析结果进行对比，将系统检测的网格线穿越次数和梯子穿越时间结果与三位专家评审人员的手动分析结果进行了比较n = 3）作为“金标准”。初学者用户（n = 7）也通过人工...
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讨论
为确保分析结果可靠，实验方案中最关键的部分是保持一致的拍摄过程。如果视频的光照充足，并且如本方案第一部分所述，在正确的位置进行拍摄，系统便能够实现精确的分析。与任何图像处理问题一样，预处理阶段的工作质量将直接影响后期处理的准确性与简便性。因此，在测试过程中确保实验装置和动物处于良好的光照条件下，并尽量减少画面中的阴影或其他运动干扰，将有助于BVAS系统实现更高水平的分析准确性。
本文介绍的方案可通过开放场网格和梯子测试，高效且可重复地分析啮齿类动物粗大运动和精细运动功能的检测结果。via 该方法，数据的分析主要由无需用户干预的自动化计算机程序完成，从而降低了人为误差或分析偏倚的可能性。由于这一特点，无论经验丰富的研究人员还是新手均可使用BVAS系统并获得相同水平的准确性。BVAS程序具备自我校验功能，易于实施且使用成本低廉。此外，该程序代码可根据研究者的个性化需求进行调整。例如，开放场网格的代码可用于分析多种指标，包括总移动距离、达到的最大速度以及向左和向右转弯的次数，且有望经过简单修改后适用于水迷宫或强迫游泳任务中的轨迹追踪。代码还可进一步修改，以适应不同实验室...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究得到了美国退伍军人事务部康复研究与发展服务局的功绩评审奖 #B1495-R（授予 Jeffrey R. Capadona）以及总统科学家与工程师早期职业奖（PECASE）（授予 Jeffrey R. Capadona）的支持。此外，本工作部分得到了国防部健康事务助理部长办公室通过同行评审医学研究项目（Award No. W81XWH-15-1-0608）的支持。作者感谢 SOURCE 提供暑期科研经费支持。文中内容不代表美国退伍军人事务部或美国政府的观点。作者谨此感谢凯斯西储大学（CWRU）啮齿类动物行为核心实验室的 Hiroyuki Arakawa 在设计和测试啮齿类动物行为实验方案方面提供的指导。作者还感谢凯斯西储大学机械与航空航天工程系的 James Drake 和 Kevin Talbot 在啮齿类动物梯子测试装置的设计与制造过程中提供的帮助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 雄性Sprague Dawley大鼠，201-225 g | Charles River | CD | |
| Webcam HD Pro c920 | Logitec | 960-000764 | |
| Excel | Microsoft | N/A | |
| Matalb 2017a，计算机视觉系统工具箱 | Mathworks | N/A | |
| 旷场网格实验 | 由凯斯西储大学自主制作 | N/A | |
| 梯子实验 | 由凯斯西储大学自主制作 | N/A |
参考文献
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