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方法文章

活细胞成像观察TGF-β/Smad3信号通路 体外 和 在体 内 使用腺病毒报告系统

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DOI：

10.3791/57926

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2018年7月30日

 ,  ,  , 
1Department of Surgery (RMH), University of Melbourne

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

在此，我们介绍一种利用腺病毒报告系统对活细胞中TGF-β/Smad3信号活性进行活体成像的实验方案。该系统可实时追踪转录活性，适用于单个细胞以及细胞群体的研究。 体外 在活体动物中模型

摘要

转化生长因子β（TGF-β）信号通路调控细胞稳态所需的多种重要功能，在包括癌症在内的多种疾病中常出现过度表达。TGF-β在癌症晚期进展过程中的转移机制中具有重要作用，可激活一类具有迁移性和侵袭性的肿瘤细胞。目前的信号通路分析方法主要依赖终点模型，通常试图测量信号传导的最终状态 事后 生物学事件的发生，并不反映疾病的渐进性质。在此，我们展示了一种新型的腺病毒报告系统，该系统特异性针对TGF-β/Smad3信号通路，可在活细胞中检测转录激活。利用一种 Ad-CAGA12-Td-Tom 报告基因，我们可以在24小时内实现MDA-MB-231细胞100%的感染率 体外使用荧光报告基因可实现对活体单细胞的实时成像，并直接鉴定转录活跃的细胞。用TGF-β刺激感染细胞后，仅有一部分细胞呈现转录活性，并参与特定的生物学功能。该方法在单细胞水平上具有高特异性和高灵敏度，有助于深入理解与TGF-β信号通路相关的生物学功能 体外Smad3 转录活性也可被报告 体内 通过应用实时 Ad-CAGA12-Luc 报告基因 Ad-CAGA12-荧光素酶 可以采用与传统稳定转染的荧光素酶细胞系相同的方法进行检测。植入细胞的 Smad3 转录活性 体内 可通过传统的IVIS成像进行分析，并在肿瘤进展过程中进行活体监测，从而深入了解TGF-β信号通路的动态变化。我们的方案描述了一种优势的报告基因递送系统，可实现对活细胞中信号通路的快速高通量成像 体外 和 体内该方法可拓展至多种基于成像的检测，为基础生物学研究和治疗开发提供了一种灵敏且可重复的技术手段。

引言

转化生长因子β（Transforming Growth Factor β, TGF-β）是一种在人类发育中起关键作用的细胞因子，通过由II型和I型受体组成的异源二聚体复合物传递信号1。TGF-β与II型受体结合后，会招募并磷酸化I型受体，后者进一步磷酸化下游的Smad2/3蛋白2,3。这些被激活的Smad2/3蛋白与Smad4结合，形成复合物并转入细胞核，调控基因转录4。在稳态条件下，TGF-β/Smad信号通路受到严密调控；然而，在多种疾病中，该信号通路发生失调，常表现为过度表达，从而促进疾病进展5,6,7。近期研究表明，细胞对TGF-β的响应具有异质性，不同亚群的TGF-β/Smad活性细胞以时间依赖的方式介导生物学功能8,9。目前对TGF-β/Smad信号通路的常规细胞分析多采用固定的终点检测方法，仅能提供细胞活动的瞬时快照，并通常量化TGF-β/Smad效应的平均值10。然而，这些方法可能无法准确反映疾病进展过程中生理状态下TGF-β/Smad信号的分子行为。基于成像的活细胞分析则能够从空间和时间两个维度捕捉细胞及生物学过程的动态变化。

我们的目标是利用基于腺病毒的试剂，开发一种灵敏的高通量活细胞成像方法，用于检测TGF-β/Smad信号通路。在此，我们将表达Smad3 CAGA基序结合序列及荧光素酶（Luc）或Td-Tomato（Td-Tom）报告基因的腺病毒，感染人乳腺癌细胞系MDA-MB-231。腺病毒报告系统是一种快速且经济的质粒导入方法，可在癌细胞系中实现接近100%的感染率。此外，该系统也已成功应用于传统质粒转染难度较大的细胞系。11在本方案中，我们将描述一种可重复且非侵入性的方法，用于实现对TGFβ/Smad信号通路的活细胞成像 体内 和 体外.

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方案

所有动物实验均经墨尔本大学动物伦理委员会批准。

注意：腺病毒载体 pAd-CMV-Td-Tom、pAd-CMV-GFP 和 pAd-CAGA12-Luc/Td-Tom 的序列、构建及制备方法此前已有描述11,12,13。所有载体均可商业获取。

1. 使用50%组织培养感染剂量（TCID50）测定病毒滴度

  1. 在 10 mL DMEM + 10% FBS 培养基中制备 1 × 106 个 HEK293A 细胞。
  2. 将 100 µL 细胞悬液接种至 96 孔平底细胞培养板的每孔中。
  3. 在完全培养基中制备 1 mL 病毒储备液的 1:100 稀释液。向第 1 列每孔中加入 11 µL 稀释后的病毒液。
  4. 在 96 孔板中直接进行连续 10 倍梯度稀释，将 11 µL 稀释病毒液与 100 µL 细胞悬液混合，直至达到最终稀释度为 1 × 1012。尽管此时细胞尚未贴壁，但各孔间转移的细胞数量保持恒定。
  5. 从 104 的最高稀释度开始，将每个稀释度的 11 µL 液体移入对应列的各孔中。每次稀释均更换移液器吸头，以避免病毒颗粒交叉污染。
  6. 向第 12 列每孔中加入 11 µL 不含病毒的完全培养基，作为阴性对照。
  7. 将培养板置于 37 °C、10% CO2 条件下孵育 7 至 10 天。
  8. 使用显微镜观察，记录每列中出现细胞病变效应或细胞毒性效应的孔数。只要存在任何感染迹象，即判定该孔为阳性。
  9. 采用 Reed 和 Muench（1938）统计法14计算每个稀释度的阳性孔比例。
  10. 使用以下公式计算比例距离（PD）：(A−50)/(A−B)，其中 A 为等于或高于 50% 的反应百分比，B 为低于 50% 的反应百分比。
  11. 使用公式 10X−PD 计算 TCID50，其中 X 为产生大于 50% 反应的稀释度。
  12. 根据以下公式计算病毒滴度：0.69/(0.011 × TCID50) PFU/mL。

2. 腺病毒 MOI 的测定

  1. 在12孔板的每个孔中加入500 μL含5% FBS的DMEM培养基，接种1.0 - 1.5 × 105个MDA-MB-231细胞（细胞汇合度为35%，共6个孔）。
  2. 根据以下公式计算感染MOI为0、250、500、2500和5000时所需的Ad-CMV-Td-Tom病毒原液体积：MOI = （体积 [μL] × PFU/μL）/ 细胞数量。对于滴度为1 × 1010 PFU/mL的Ad-CMV-Td-Tom，所需病毒体积分别为0、3.75、7.5、37.5和75 μL。
  3. 将步骤2.2中计算出的Ad-CMV-Td-Tom病毒体积直接加入各孔中，用移液器充分混匀以感染细胞。
  4. 将培养板置于37 °C、10% CO2的培养箱中孵育24小时。
  5. 吸除各孔中的培养基，立即加入500 μL 10%福尔马林固定细胞5分钟。 
  6. 吸除福尔马林溶液，用500 μL PBS洗涤各孔一次。
  7. 加入500 μL Hoechst染色液，对细胞核染色5分钟。
  8. 吸除Hoechst染色液，用500 μL PBS洗涤各孔3次。
  9. 使用荧光显微镜在200倍放大下成像Td-Tomato蛋白和细胞核信号。Td-Tomato蛋白的激发波长为554 nm，Hoechst染料的激发波长为352 nm。
  10. 使用ImageJ软件分析图像，确定实现Td-Tomato15完全感染所需的合适MOI。

3. 活体单细胞中的双腺病毒转导

  1. 在12孔板的每个孔中加入500 μL含5% FBS的DMEM培养基，接种1.0 - 1.5 × 105个MDA-MB-231细胞（细胞汇合度为35%，共2孔）。
  2. 每孔加入75 μL的Ad-CMV-GFP（滴度 = 5 × 109 PFU/mL）和7.5 μL的Ad-CAGA12-Td-Tom（滴度 = 5 × 1010 PFU/mL），使MOI达到2,500，以实现100%的感染阳性率。
  3. 腺病毒感染后立即每孔加入或不加入0.25 μL的TGF-β（储存浓度为10 mg/mL，终浓度为5 ng/μL）。
  4. 将培养板置于37 °C、10% CO2的培养箱中孵育24小时。
  5. 使用相差荧光显微镜观察活细胞。GFP在470 nm激发，Td-Tomato蛋白在554 nm激发。
  6. 固定细胞，并按照步骤1.6 - 1.9所述方法对细胞核进行染色。
  7. 使用荧光显微镜观察Td-Tomato蛋白和Hoechst染色结果。Hoechst染料在352 nm激发。
  8. 使用ImageJ软件计算GFP阳性和Td-Tomato阳性细胞的百分比15。

4. 伤口愈合实验中的活体单细胞信号检测

  1. 在6孔板的每个孔中接种4 - 5 × 105个MDA-MB-231细胞，加入1 mL含5% FBS的DMEM培养基（细胞汇合度50%，共2孔）。
  2. 每孔加入22.5 μL的Ad-CAGA12-Td-Tom（滴度 = 5 × 1010 PFU/mL，MOI = 2,500）感染细胞。
  3. 将培养板置于37 °C、10% CO2的培养箱中孵育24小时。
  4. 使用P200移液器枪头在每孔细胞层上划出两条交叉的划痕。
  5. 吸去各孔中的旧培养基，每孔更换为2 mL新鲜的含5% FBS的培养基，根据实验设计加入或不加入0.5 μL TGF-β（储存浓度为10 mg/mL，终浓度为5 ng/μL）。
  6. 将培养板置于37 °C、10% CO2的培养箱中孵育5分钟，然后在相差显微镜下使用100倍放大倍数拍摄选定划痕区域的图像。
  7. 将培养板继续置于37 °C、10% CO2的培养箱中孵育24小时。
  8. 在与之前相同的位置拍摄划痕闭合情况的图像。
  9. 固定细胞，按照步骤1.6 - 1.9所述方法对细胞核进行染色，并在荧光显微镜下使用200倍放大倍数观察划痕区域和非划痕区域的Td-Tomato信号。
  10. 使用ImageJ软件15定量分析划痕区域和非划痕区域中Td-Tomato阳性细胞的百分比。

5. 体外 荧光素酶检测

  1. 在含有5%胎牛血清（FBS）的1 mL DMEM培养基中制备3 - 5 × 104个MDA-MB-231细胞的细胞悬液。
  2. 用2.5 μL的Ad-CAGA12-Luc（滴度 = 5 × 1010 PFU/mL，MOI = 2,500）感染细胞悬液。
  3. 将感染后的细胞以每孔3,000个细胞/100 µL的密度接种至96孔板中。
  4. 将培养板置于37 °C、10% CO2条件下孵育24小时。
  5. 吸除孔内旧培养基，每孔加入100 µL含或不含0.1 μL TGF-β的新鲜5% FBS培养基（TGF-β储备液浓度为1 mg/mL，终浓度为1 ng/μL），并根据需要每孔加入或不加入0.17 μL TGF-β抑制剂（储备液浓度为7 mg/mL，终浓度为12 ng/μL）（一种新型TGF-β配体捕获蛋白，Chen et al.，未发表工作）。
  6. 将培养板置于37 °C、10% CO2条件下继续孵育24小时。
  7. 解冻萤光素酶检测试剂系统的底物，并用双蒸水（DDW）配制1×细胞裂解液。
  8. 吸除96孔中的培养基，每孔加入50 μL 1×细胞裂解缓冲液，在冰上使用轨道摇床轻柔振荡裂解30分钟。
  9. 将每孔中的30 μL裂解液转移至不透光的萤光素酶检测板中，并使检测板恢复至室温。
  10. 在化学发光仪软件中创建新实验方案。选择使用1个注射器，并设置注射前后测量参数。注射前测量的测量延迟时间和积分时间均设为1秒；注射后测量时，设置注射体积为40 µL，注射后测量延迟时间为1秒，积分时间为5秒。确认设置后点击确定。
  11. 将注射管插入双蒸水（DDW）中，点击Prime设置下的Injector 1按钮，以清洗注射管。随后将注射管从DDW中取出并置于空气中，再进行两次Prime操作，彻底冲洗管内液体。将注射管插入萤光素酶底物中，再次进行两次Prime操作以准备底物。
  12. 将含有样品的不透光萤光素酶检测板放入化学发光仪中，在软件中选择Options，选中目标孔位后点击Apply，然后按下Start开始检测萤光素酶信号。
  13. 测量完成后，取出检测板并用水冲洗。将注射管置于空气中，通过反向Prime操作将残留底物回收至底物管中。随后将注射管插入DDW中，再进行两次Prime操作，彻底清洗注射管中残留的底物。

6. 活体中活细胞信号成像的细胞准备 In Vivo

  1. 肿瘤植入前 48 小时，将 2 - 3×106 个 MDA-MB-231 细胞接种至 175 cm2 培养瓶中（共 10 个培养瓶）。在含 5% 胎牛血清（FBS）的 DMEM 培养基中，于 37 °C、10% CO2 条件下培养细胞。
  2. 24 小时后，向每个培养瓶中加入 300 μL 的 Ad-CAGA12-Luc（滴度 = 5×1010 PFU/mL，MOI = 2,500）。继续培养细胞 24 小时。
  3. 在植入当天，弃去旧培养基，用 20 mL pH 7.4 的 PBS 洗涤腺病毒感染的细胞一次。向培养瓶中加入 2 mL 0.05% 胰蛋白酶-EDTA 溶液，并轻轻摇动培养瓶，使胰蛋白酶覆盖整个瓶面。将培养瓶置于 37 °C、10% CO2 的培养箱中孵育 3 分钟。
  4. 通过向培养瓶中加入 8 mL 含 FBS 的 DMEM 培养基终止胰蛋白酶消化反应。将所有细胞悬液转移至玻璃试剂瓶中。
  5. 使用血细胞计数板计数细胞数量，并将 4.8×107 个细胞分装至两个 50 mL 离心管中。
  6. 在室温下以 400 × g 离心 5 分钟，去除胰蛋白酶，然后将细胞重悬于 720 mL 新鲜的含 FBS 的 DMEM 培养基中。
  7. 将细胞悬液转移至无菌的 5 mL 离心管中，并加入 160 μL Matrigel（终浓度为 10%）。
  8. 将细胞置于冰上保存，直至进行植入操作。

7. 原位移植

  1. 称重12只SCID小鼠，并随机分为对照组和处理组（每组6只小鼠）。
  2. 在无菌生物安全柜中进行移植操作，以维持无菌环境。使用 2.5 - 4.5% 异氟烷，氧气流速为 1 L/min。将小鼠置于加热垫上，并在双眼各滴加一滴润滑性眼膏以防止角膜损伤。将小鼠以仰卧位固定在加热垫上，同时通过将小鼠鼻部置入连接异氟烷的鼻罩中以维持麻醉状态。
  3. 通过脚趾夹捏无反应确认麻醉成功，将异氟烷减至维持剂量1.5 - 2.5%浓度，以1 L/min的氧气流速维持至植入结束。
  4. 用浸有80%乙醇的棉签从两侧第四乳头处向中线方向清洁皮肤。
  5. 找到 4th 通过触诊定位乳腺脂肪垫，并挤压脂肪垫以进一步暴露组织。
  6. 用移液器反复吹打混匀细胞悬液。用27G胰岛素注射器轻柔吸取50 µL细胞混合物，分别注射至小鼠双侧乳腺脂肪垫中。
  7. 通过触诊确认脂肪垫是否肿胀以验证注射成功。轻柔地松开脂肪垫，将小鼠放回笼中。
  8. 将笼子留在加热垫上至少30分钟，以使小鼠恢复意识，然后将笼子放回饲养室3天。

8. IVIS 成像

  1. 打开 Living Image 软件。
  2. 在控制面板上点击 Initialize IVIS System 按钮以初始化 IVIS 系统。等待温度指示灯变为绿色。
  3. 在控制面板上选择 Luminescent 成像模式。
  4. 开启向麻醉室和 IVIS 系统输送的异氟烷麻醉气体。
  5. 使用 2.5 - 4.5% 异氟烷（氧气流速为 1 L/min）对小鼠进行麻醉。麻醉成功后，将异氟烷浓度调整为 1.5 - 2.5% 以维持麻醉状态。通过腹腔（i.p.）注射方式，按 150 mg/kg 体重剂量向小鼠注射 D-荧光素酶底物（D-luciferin）。
  6. 立即将小鼠转移至 IVIS 系统中，将其放置在温度可控的成像平台上，并将小鼠的鼻部插入鼻罩中。
  7. 在控制面板上点击 Sequence Setup 按钮，并选择 Medium Binning。
  8. 设置成像曝光时间如下：10 s、20 s、30 s、60 s 和 120 s。在注射荧光素酶底物后约 3 分钟开始成像，并持续成像直至信号开始下降（通常持续约 20 分钟）。
  9. 在通过鼻罩持续维持异氟烷麻醉的条件下，将小鼠从 IVIS 系统中取出，并通过瘤内注射方式给予 50 µL PBS 或 50 µL TGF-β 信号通路抑制剂（50 μg/肿瘤）。
  10. 将小鼠放回笼中，并将其置于加热垫上至少 30 分钟，随后将笼子放回动物饲养室。
  11. 在处理后的第二天，重复上述 IVIS 成像步骤。

9. 数据分析

  1. 在 Living Image 软件中打开已保存的文件。
  2. 通过 View | Image Information 查找图像信息。
  3. 选择在相近时间点拍摄且曝光时间相同的图像，并将其作为一组加载。
  4. 在 Image Adjust 中取消勾选 Individual 选项框，以归一化信号强度。
  5. 选择 Photon 模式以分析强度；在 ROI Tools 中点击 Region of Interest (ROI) 按钮，对信号强度进行定量分析。
  6. 将 ROI 圆圈拖动至包含生物发光信号的区域，然后点击 Measure 按钮以获取信号强度。

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结果

活体单细胞成像 体外

为了使用基于腺病毒的试剂准确评估单个细胞中TGF-β/Smad信号通路的激活状态，首先需要确定每种细胞系的最佳感染复数（MOI）。当100%的细胞呈现腺病毒感染阳性，且无明显细胞病变效应或细胞毒性时，即为最佳MOI。为确定该值，我们使用了一种组成型活性 Ad-CMV-Td-Tom 作为阳性感染标志的报告基因。腺病毒感染细胞的比例随着MOI从0增至5,000而呈依赖性升高。在MOI为2,500时，我们在MDA-MB-231细胞中观察到100%的Td-Tom表达（图1A，1B）。每细胞的像素强度也随MOI增加而增强，从而提高了检测转录输出的灵敏度和可检测性（图1C）。因此，采用 2,500 的工作感染复数（MOI）进行双重感染，即用 Ad-CMV...

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讨论

我们开发了一种技术，可实现对单个活细胞中TGF-β/Smad3信号通路的实时成像。利用这一新方法，我们此前已鉴定出一类具有动态TGF-β/Smad3转录活性的细胞亚群，该亚群与增强的侵袭和迁移能力相关8。与传统的TGF-β信号检测方法（如Smad3磷酸化蛋白印迹分析和TGF-β靶基因表达检测）相比，该方法能够捕捉肿瘤细胞群体内TGF-β/Smad3信号的异质性，凸显了单细胞生物学的重要性。此外，其他单细胞成像方法（如核转位检测）在活细胞中操作时可能耗时且成本较高，且并不总能反映基因转录的真实情况16,17。尽管这些方法对于研究信号转导的上游通路至关重要，腺病毒报告系统则为理解单个细胞中TGF-β/Smad3信号与其生物学功能之间的关系提供了独特视角。

重要的是，我们的方法提供了一种灵敏且可重复的技术 体内 在肿瘤进展和治疗过程中实时检测TGF-β/Smad3信号通路。类似于传统的稳定型荧光素酶

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作获得了澳大利亚国家健康与医学研究委员会（NHMRC）向 H-JZ 提供的资助。TMBW 获得了澳大利亚政府颁发的澳大利亚研究生奖学金，以及由澳大利亚扶轮健康基金会与 Templestowe 扶轮社和 Dine for a Cure 联合资助的 Ann Henderson 增补奖学金。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
DMEMThermoFisher1881024使用前在 37 °C 水浴中预热
胎牛血清Scientifix LifeFBS500-S使用前热灭活
重组人 TGF-β1PEPROTECH100-21用双蒸水（DDW）分装，配制成终浓度为 10 mg/mL
Hoechst-33258Tocris Bioscience5117用 PBS 稀释，配制成终浓度为 1 μL/mL
荧光素酶报告基因检测试剂盒Promega197897使用前用 PBS 稀释 5 倍
发光仪Promega9100-002
相差荧光显微镜OLYMPUSIX50
离心机eppendorf5810 R
VivoGl 荧光素PromegaP1041
IVIS Lumina III 活体成像系统PerkinElmerCLS136334
0.5% 胰蛋白酶-EDTA（10×）ThermoFisher15400-054用 PBS 稀释至 0.05%（1×）
细胞裂解液 5× 储存液PromegaE153A用双蒸水（DDW）稀释至 1×
10% 福尔马林Sigma-AldrichF5554-4L
HEK 293AThermoFisherR70507
MDA-MB-231ATCCCRM-HTB-26
PRKDC-SCIDAnimal Resources CentreSCIDF6
MatrigelCorning354234
异氟烷Zoetis26675-46-7
乙醇Chem-supplyEA043-10L-P
Refresh Night TimeAllergan1750D润滑性眼膏
溶液成分
磷酸盐缓冲液（PBS）NaH2PO4·2H2O（4 mM）；NaHPO4（16 mM）；NaCl（0.12 M）
FBS-DMEM 5% 热灭活胎牛血清；10 μg/mL 青霉素；100 μg/mL 链霉素

参考文献

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