活细胞成像观察TGF-β/Smad3信号通路 体外 和 在体 内 使用腺病毒报告系统

摘要

在此，我们介绍一种利用腺病毒报告系统对活细胞中TGF-β/Smad3信号活性进行活体成像的实验方案。该系统可实时追踪转录活性，适用于单个细胞以及细胞群体的研究。 体外 在活体动物中模型

摘要

转化生长因子β（TGF-β）信号通路调控细胞稳态所需的多种重要功能，在包括癌症在内的多种疾病中常出现过度表达。TGF-β在癌症晚期进展过程中的转移机制中具有重要作用，可激活一类具有迁移性和侵袭性的肿瘤细胞。目前的信号通路分析方法主要依赖终点模型，通常试图测量信号传导的最终状态 事后 生物学事件的发生，并不反映疾病的渐进性质。在此，我们展示了一种新型的腺病毒报告系统，该系统特异性针对TGF-β/Smad3信号通路，可在活细胞中检测转录激活。利用一种 Ad-CAGA₁₂-Td-Tom 报告基因，我们可以在24小时内实现MDA-MB-231细胞100%的感染率 体外使用荧光报告基因可实现对活体单细胞的实时成像，并直接鉴定转录活跃的细胞。用TGF-β刺激感染细胞后，仅有一部分细胞呈现转录活性，并参与特定的生物学功能。该方法在单细胞水平上具有高特异性和高灵敏度，有助于深入理解与TGF-β信号通路相关的生物学功能 体外Smad3 转录活性也可被报告 体内 通过应用实时 Ad-CAGA₁₂-Luc 报告基因 Ad-CAGA₁₂-荧光素酶 可以采用与传统稳定转染的荧光素酶细胞系相同的方法进行检测。植入细胞的 Smad3 转录活性 体内 可通过传统的IVIS成像进行分析，并在肿瘤进展过程中进行活体监测，从而深入了解TGF-β信号通路的动态变化。我们的方案描述了一种优势的报告基因递送系统，可实现对活细胞中信号通路的快速高通量成像 体外 和 体内该方法可拓展至多种基于成像的检测，为基础生物学研究和治疗开发提供了一种灵敏且可重复的技术手段。

引言

转化生长因子β（Transforming Growth Factor β, TGF-β）是一种在人类发育中起关键作用的细胞因子，通过由II型和I型受体组成的异源二聚体复合物传递信号¹。TGF-β与II型受体结合后，会招募并磷酸化I型受体，后者进一步磷酸化下游的Smad2/3蛋白^2,3。这些被激活的Smad2/3蛋白与Smad4结合，形成复合物并转入细胞核，调控基因转录⁴。在稳态条件下，TGF-β/Smad信号通路受到严密调控；然而，在多种疾病中，该信号通路发生失调，常表现为过度表达，从而促进疾病进展^5,6,7。近期研究表明，细胞对TGF-β的响应具有异质性，不同亚群的TGF-β/Smad活性细胞以时间依赖的方式介导生物学功能^8,9。目前对TGF-β/Smad信号通路的常规细胞分析多采用固定的终点检测方法，仅能提供细胞活动的瞬时快照，并通常量化TGF-β/Smad效应的平均值¹⁰

方案

所有动物实验均经墨尔本大学动物伦理委员会批准。

注意：腺病毒载体 pAd-CMV-Td-Tom、pAd-CMV-GFP 和 pAd-CAGA₁₂-Luc/Td-Tom 的序列、构建及制备方法此前已有描述^11,12,13。所有载体均可商业获取。

1. 使用50%组织培养感染剂量（TCID₅₀）测定病毒滴度

1. 在 10 mL DMEM + 10% FBS 培养基中制备 1 × 10⁶ 个 HEK293A 细胞。
2. 将 100 µL 细胞悬液接种至 96 孔平底细胞培养板的每孔中。
3. 在完全培养基中制备 1 mL 病毒储备液的 1:100 稀释液。向第 1 列每孔中加入 11 µL 稀释后的病毒液。
4. 在 96 孔板中直接进行连续 10 倍梯度稀释，将 11 µL 稀释病毒液与 100 µL 细胞悬液混合，直至达到最终稀释度为 1 × 10¹²。尽管此时细胞尚未贴壁，但各孔间转移的细胞数量保持恒定。
5. 从 10....

结果

活体单细胞成像 体外

为了使用基于腺病毒的试剂准确评估单个细胞中TGF-β/Smad信号通路的激活状态，首先需要确定每种细胞系的最佳感染复数（MOI）。当100%的细胞呈现腺病毒感染阳性，且无明显细胞病变效应或细胞毒性时，即为最佳MOI。为确定该值，我们使用了一种组成型活性 Ad-CMV-Td-Tom 作为阳性感染标志的报告基因。腺病毒感染细胞的比例随着MOI从0增至5,000而呈依赖性升高。在MOI为2,500时，我们在MDA-MB-231细胞中观察到100%的Td-Tom表达（图1A，1B）。每细胞的像素强度也随MOI增加而增强，从而提高了检测转录输出的灵敏度和可检测性（图1C）。因此，采用 2,500 的工作感染复数（MOI）进行双重感染，即用 Ad-CMV.......

讨论

我们开发了一种技术，可实现对单个活细胞中TGF-β/Smad3信号通路的实时成像。利用这一新方法，我们此前已鉴定出一类具有动态TGF-β/Smad3转录活性的细胞亚群，该亚群与增强的侵袭和迁移能力相关⁸。与传统的TGF-β信号检测方法（如Smad3磷酸化蛋白印迹分析和TGF-β靶基因表达检测）相比，该方法能够捕捉肿瘤细胞群体内TGF-β/Smad3信号的异质性，凸显了单细胞生物学的重要性。此外，其他单细胞成像方法（如核转位检测）在活细胞中操作时可能耗时且成本较高，且并不总能反映基因转录的真实情况^16,17。尽管这些方法对于研究信号转导的上游通路至关重要，腺病毒报告系统则为理解单个细胞中TGF-β/Smad3信号与其生物学功能之间的关系提供了独特视角。

重要的是，我们的方法提供了一种灵敏且可重复的技术 体内 在肿瘤进展和治疗过程中实时检测TGF-β/Smad3信号通路。类似于传统的稳定型荧光素酶

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM	ThermoFisher	1881024	使用前在 37 °C 水浴中预热
胎牛血清	Scientifix Life	FBS500-S	使用前热灭活
重组人 TGF-β1	PEPROTECH	100-21	用双蒸水（DDW）分装，配制成终浓度为 10 mg/mL
Hoechst-33258	Tocris Bioscience	5117	用 PBS 稀释，配制成终浓度为 1 μL/mL
荧光素酶报告基因检测试剂盒	Promega	197897	使用前用 PBS 稀释 5 倍
发光仪	Promega	9100-002
相差荧光显微镜	OLYMPUS	IX50
离心机	eppendorf	5810 R
VivoGl 荧光素	Promega	P1041
IVIS Lumina III 活体成像系统	PerkinElmer	CLS136334
0.5% 胰蛋白酶-EDTA（10×）	ThermoFisher	15400-054	用 PBS 稀释至 0.05%（1×）
细胞裂解液 5× 储存液	Promega	E153A	用双蒸水（DDW）稀释至 1×
10% 福尔马林	Sigma-Aldrich	F5554-4L
HEK 293A	ThermoFisher	R70507
MDA-MB-231	ATCC	CRM-HTB-26
PRKDC-SCID	Animal Resources Centre	SCIDF6
Matrigel	Corning	354234
异氟烷	Zoetis	26675-46-7
乙醇	Chem-supply	EA043-10L-P
Refresh Night Time	Allergan	1750D	润滑性眼膏
溶液			成分
磷酸盐缓冲液（PBS）			NaH2PO4·2H2O（4 mM）；NaHPO4（16 mM）；NaCl（0.12 M）
FBS-DMEM			5% 热灭活胎牛血清；10 μg/mL 青霉素；100 μg/mL 链霉素