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多年生草本植物实验中土壤、根际及根部微生物群落的分离与分析

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DOI：

10.3791/57932

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2018年7月24日

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1Department of Agronomy and Horticulture and Center for Plant Science Innovation, University of Nebraska-Lincoln, 2USDA-ARS, Wheat, Sorghum and Forage Research Unit, University of Nebraska-Lincoln East Campus

本文内容

摘要

本文详细描述了从田间挖掘植物根系以及将样品处理为内生圈、根际和土壤的方法，包括DNA提取和数据分析方法。本文旨在使其他实验室能够采用这些技术来研究土壤、内生圈和根际微生物组。

摘要

植物和土壤微生物组研究在理解微生物对农业生产力影响方面正变得愈发重要。本文旨在详细介绍如何快速采集田间重复试验中的土壤、根际和内生圈样本，并分析因样本类型、处理方式和植物基因型不同而可能引起的微生物群落变化。用于演示这些方法的实验包含若干重复的田间小区，种植有两种纯系的暖季型禾草（Panicum virgatum 和 柳枝稷（Andropogon gerardii） 低多样性草种混合物（A. gerardii，须芒草 和 短柄草（Bouteloua curtipendula）简而言之，植物被挖取后，将多种根系剪下并置于磷酸盐缓冲液中振荡，以收集根际。根系用冰袋运回实验室，并用次氯酸钠和乙醇（EtOH）进行表面灭菌。根际样品经滤膜过滤后，通过离心浓缩。从根团周围挖取的土壤样品装入塑料袋带回实验室，取少量用于DNA提取。从根系、土壤和根际中提取DNA，并使用针对16S rRNA基因V4区的引物进行扩增。扩增产物经测序后，利用开放获取的生物信息学工具进行分析。这些方法使研究人员能够检验微生物群落的多样性和组成如何因样品类型、处理方式和植物基因型而变化。结合这些方法与统计模型，代表性结果表明，根系、根际和土壤中的微生物群落存在显著差异。本文所呈现的方法提供了一套完整的操作流程，用于在重复的田间试验中采集样品、分离、提取、定量、扩增和测序DNA，并分析微生物群落的多样性和组成。

引言

微生物组研究对于理解与调控生态系统过程（如养分循环、有机质转化以及土壤病原菌的发育或抑制）具有重要意义1,2。该研究领域在揭示土壤微生物对天然植物群落和农业生态系统生产力影响方面也具有巨大潜力。尽管已有大量研究聚焦于自然生态系统中的土壤微生物组，但针对农业生态系统中植物根际和内生微生物的研究仍相对较少3。在内布拉斯加州，农业占据了该州大部分地区的景观主体，因此对这些种植重要农作物的土壤开展研究成为一项至关重要的科研课题。本方法学论文的目的是为研究人员提供一套标准化的实验方案，用于描述农业生态系统中存在的微生物，阐明植物根系如何改变根际和内生微生物群落，并最终理解这些微生物在土壤健康和植物生产力中所发挥的功能。

本文所述方法与其他研究者所用方法4,5略有不同，本研究旨在明确哪些微生物仅存在于根内，并探究它们与根际（即根系周围紧邻区域）外部微生物的差异。本研究所采用的扩增子测序技术可鉴定DNA样本中的微生物分类群，使研究人员能够确定微生物群落如何随样本类型或处理方式而变化。本实验方案与Lundberg et al.6所使用的高度相似方案之间的一个关键区别在于：本方案不采用超声处理，而是使用次氯酸钠和乙醇进行表面灭菌，以去除根系表面的根际物质。其他研究者也已成功应用过表面灭菌方法7,8,9,10。这些方法并不比其他方法更具优势，只是略有不同。此类方法特别适用于大规模田间试验，因为在人员充足的情况下，每天可处理超过150个田间样地，若将样本进一步划分为内生菌群、根际菌群和土壤菌群，则每日可获得约450个样本。本文详细描述了田间取样、实验室样品处理、DNA提取与测序的方法，并简要概述了后续测序数据分析的基本步骤。

方案

1. 野外地点描述

  1. 在采样期间描述实验田间地点。使用 GPS 确定田间位置（纬度、经度和海拔）。
  2. 描述采样深度、采样时间以及土壤质地。
  3. 环境因素在塑造微生物群落方面起着重要作用。记录气候信息，如年平均气温、年降水量、前些年的作物轮作情况、耕作方式、施肥方法以及田间地点的历史。自动气象站或其他设备可用于记录生长季期间的每日降雨量和温度。

2. 土壤、根际和根部田间样品的采集与处理

  1. 植物挖掘。
    1. 使用带有植物样品信息的标签纸标记一个清洗盘和一个桶。信息应包括样地编号、植物基因型和植物物种。将标记好的桶带至样地，而将清洗盘留在田间已设立的工作站处。
    2. 用铁锹将土壤刺穿至30 cm深度，切断固定植物的侧根。挖掘土壤的近似体积为18 cm3。在样地内不同区域随机选择并采集两株植物。
    3. 利用铁锹撬动，挖出植物根系，并将根团放入已标记的桶中。将装有挖掘后根团的标记桶带回田间工作站。剪除并丢弃地上部分的植物生物量。
  2. 根系去土及散土样品收集。
    1. 手动摇动根系以去除土壤，或使用铲子或手持式松土器去除根系上的土壤。在砂质非常强的土壤中，仅摇动根系即可有效去土。佩戴手套，并将根系放置在处理工作站附近。
    2. 摇动根系后，大部分土壤将落入清洗盘中。使用手持式松土器混合清洗盘中的土壤，并打碎任何土块。取一份无杂物的土壤样品，放入已标记的17.7 × 19.5 cm密封袋中，并置于阴凉处或冰上保存。
  3. 根系及根际样品收集。
    1. 使用经70%乙醇灭菌的修枝剪，从每株植物上切取4至6条不同类型的根，每条根长度约为9–12 cm。将切下的根（根据需要剪裁以适配）放入已标记的50 mL离心管中，管内预先加入35 mL经高压灭菌的磷酸盐缓冲液（NaH2PO4 6.33 g/L，无水Na2HPO4 8.5 g/L，pH = 6.5，含表面活性剂200 µl/L）。
      注：表面活性剂（见材料表）在磷酸盐缓冲液高压灭菌后加入。根团体积和根长因植物年龄和物种而异。
    2. 将离心管振荡2分钟，使根际物质从根表释放。使用经70%乙醇灭菌的镊子将根取出，在纸巾上短暂吸干，然后转移至一个新的已标记50 mL离心管中。将含有根际物质的离心管和含有根的离心管均置于冰上。

3. 实验室中田间样品的处理

  1. 田间采集后根系的表面灭菌。
    注意：从田间返回后应尽快进行表面灭菌。若无法在当天完成根系表面灭菌，需将根系在 4 °C 下保存直至处理。
    1. 向田间采集的 50 mL 根系管中加入约 35 mL 的 50% 次氯酸钠溶液 + 0.01% Tween 20。将 50 mL 管振荡 30 至 60 秒。倒去 50% 次氯酸钠溶液，加入 35 mL 70% 乙醇。再振荡 30 至 60 秒。
    2. 倒去 70% 乙醇，加入 35 mL 无菌超纯水。振荡 1 分钟。重复水洗步骤两次。
      注意：为确保我们的表面灭菌处理充分，我们对最后一次漂洗的水样进行了平板培养，未观察到细菌生长（P. Wang，未发表数据，2014）。其他研究者也采用类似方法检测根系灭菌效率9,10。
    3. 用洁净的纸巾吸干根系表面水分。每个样品使用一张新的洁净纸巾。
      注意：纸巾可在使用前进行灭菌。我们不灭菌纸巾，但每个样品使用一张独立纸巾，并在使用前保持包装密封。
    4. 使用无菌镊子和修枝剪将根系切成约 5 mm 的小段，并将切好的根段放入洁净、标记好的 15 mL 锥形管中。将样品在 -80 °C 下保存，待后续处理。
  2. 根际样品的处理。
    1. 振荡含有田间根际样品的 50 mL 管，使样品充分重悬。使用无菌的 100 µm 孔径细胞筛（见材料表），将重悬液过滤至新的 50 mL 管中。
    2. 在室温下以 3000 × g 离心 5 分钟。立即倒去并弃除上清液。
    3. 将根际沉淀物置于 50 mL 管中并置于冰上。向沉淀中加入 1.5 mL 无菌磷酸盐缓冲液（不含表面活性剂），涡旋混匀以重悬。
    4. 用移液器将重悬液转移至洁净、标记好的 2 mL 微量离心管中。在室温下以 15,871 × g 离心 2 分钟。立即倒去上清液，并将离心管倒置在洁净纸巾上沥干。
    5. 将沉淀物在 -20 °C 下保存，待后续处理。
      注意：步骤 3.2.2 至 3.2.4 的目的是减小样品管体积以便储存。相比 50 mL 管，储存更小的 2 mL 管更为节省空间。
  3. 土壤样品的处理，用于 DNA 提取和土壤分析。
    1. 使用无菌金属刮铲，将约 3 g 土壤装入洁净、标记好的 2 mL 管中用于 DNA 提取。避免混入细小根段和杂质。将该土壤样品在 -20 °C 下保存。每处理一个样品后，用 70% 乙醇冲洗金属刮铲。
    2. 在洁净的清洗盘中，将土壤袋中的土壤倒入叠放的筛组（见材料表），上层为较大孔径筛，下层为较小孔径筛，手动过筛。每处理一个样品后，使用刷子仔细清洁筛网。
    3. 取 100 至 125 g 过筛后的土壤，放入尺寸为 17.7 × 19.5 cm 的带拉链袋中，用于后续土壤理化性质和质地分析。短期储存时将土壤袋置于 4 °C 下。
  4. 土壤样品的处理，用于土壤含水量测定。
    1. 将标记好的棕色纸袋放在天平上归零。称取 40 至 45 g 过筛土壤放入棕色纸袋中。在数据表上记录纸袋与土壤的总重量，并将纸袋放入设定为 55–60 °C 的烘箱中。
    2. 72 小时后，从烘箱中取出纸袋。让土壤袋冷却至少 30 分钟，然后称重。
    3. 称重时，将天平归零，再将棕色纸袋置于天平上。使用以下公式计算每个样品的土壤含水量百分比：
      土壤含水量计算公式，静态平衡，科学分析方法。
      注意：本土壤含水量测定方法源自凯洛格生物站长期生态研究项目（KBS LTER）。KBS LTER 在其网站（https://Lter.kbs.msu.edu/）上为研究人员提供了大量已建立的实验方案。

4. DNA 提取用加工后根样品的制备。

  1. 研磨冷冻的根组织材料，使样品均匀一致。
    1. 使用干净的刮勺将液氮倒入干净的塑料烧杯和研钵中，以确保样品在整个研磨过程中保持冷冻状态。
    2. 将冷冻的组织放入研钵中，用研杵研磨成细粉。研磨过程中需持续添加液氮，以保持样品处于冷冻状态。
    3. 用刮勺将研磨后的组织转移至洁净并已标记的2 mL离心管中，于-80 °C保存。

5. 以96孔板格式从土壤和根际样品中提取DNA

  1. 将土壤样品加入96孔板。
    1. 使用70%乙醇和1%次氯酸钠溶液擦拭工作区域。操作过程中佩戴实验手套。将土壤样品从-20 °C冰箱中取出，置于冰桶中解冻。
    2. 取下DNA提取试剂盒配套的96孔提取板的密封垫盖，并将其夹在两张纸巾之间以保持清洁。为避免污染，使用粘性8联PCR管条覆盖96孔提取板的12列。
    3. 将无菌称量漏斗（SM规格）放在天平上归零，称取200至250 mg土壤。
      注：这些无菌漏斗一侧为扁平设计，可平稳放置于天平上。将漏斗装入土壤后直接放入孔中。该方法可避免样品损失，减少洒漏，并防止交叉污染。
    4. 小心掀起粘性管条以暴露提取板的第一个孔，将装有土壤的称量漏斗颈部插入相应孔中，轻柔地将土壤样品导入孔内。随后重新盖上粘性管条以封闭该孔。
    5. 对板上每个孔重复此操作，每个样品使用新的无菌漏斗，直至填满整块板。留出一个孔为空白，作为提取阴性对照。
      注：每块提取板均需留出一个空白孔作为阴性（空白）对照，用于检测试剂中可能存在的污染物11。
    6. 将密封垫盖重新盖回提取板上，并将板储存于-20 °C，待后续进行DNA提取。
  2. 将根际样品加入96孔板。
    1. 将根际样品从-20 °C冰箱中取出，置于冰桶中解冻。
    2. 参照上述步骤5.1.2准备DNA提取板。
    3. 在天平上放置一张干净纸巾，将无菌金属刮勺置于其上归零。用刮勺小心从样品管中取出部分根际沉淀物，再将刮勺放回天平，称取200至250 mg根际样品。
    4. 小心掀起粘性管条以暴露提取板的第一个孔，将装有样品的刮勺倾斜插入孔中，使用无菌牙签将根际材料刮入相应孔内。
    5. 在样品之间用水冲洗金属刮勺，随后用70%乙醇处理。对板上每个孔重复此操作，直至填满整块板，留出一个孔为空白，作为提取阴性对照。
  3. 以96孔板形式从根际和土壤样品中提取DNA。
    1. 使用专为土壤优化的试剂盒（见材料表），按照制造商提供的操作说明提取土壤和根际DNA。
      注：我们选用该特定试剂盒提取土壤和根际DNA，因其专有试剂能够有效去除土壤中的腐殖酸及其他强效PCR抑制物。
  4. DNA定量。
    1. 使用定量试剂盒（见材料表；标准品已包含在内），按照制造商提供的操作说明，对92个样品及4个浓度的标准品进行定量。
    2. 对之前从板中移出以腾出4个标准品孔位的剩余4个样品，使用定量试剂盒（见材料表），按照制造商提供的操作说明进行定量。

6. 以96孔板格式从根部样本中提取DNA。

  1. 将根部样品装入96孔板。
    1. 使用70%乙醇和1%次氯酸钠溶液擦拭工作区域。操作过程中需佩戴手套。
    2. 将研磨后的根部样品始终置于干冰桶中，保持冷冻状态。
    3. 在塑料烧杯中倒入液氮，并将防静电微量刮勺和无菌称量漏斗（型号XSM）放入烧杯中预冷。
    4. 从试剂盒提供的96孔提取珠板上取下密封垫盖，将其夹在两张纸巾之间，以保持清洁，暂不使用时备用。
      注意：我们进行DNA提取后，该试剂盒已发布更新版本，要求用户自行提供提取珠板。在材料表中，我们列出了订购这些物品所需的供应商目录信息。
    5. 为避免污染，使用粘性8联PCR管条覆盖96孔提取板的12列。
    6. 将提取珠板放置于干冰上，以保持孔内样品处于冷冻状态。
    7. 小心掀起粘性管条，暴露提取板的第一个孔，将装有样品的称量漏斗颈部插入相应孔中，加入三刮勺研磨后的根组织，然后重新盖上粘性管条以封闭该孔。
      注意：土壤和根际样品在称重前需在冰上解冻，而植物材料则需在冷冻状态下称量。冷冻的植物组织，尤其是少量样品，在不解冻的情况下难以在天平上准确称重。我们已对研磨后的根组织进行称重测试，以确定合适的刮勺数量。需注意，试剂盒制造商并未要求组织重量必须精确，但建议约为50 mg。不同类型的植物样品可能存在差异，用户需自行确定合适的用量。
    8. 重复此操作，直至填满板上所有孔。
    9. 将板储存于-20 °C，待进行DNA提取时取出使用。
  2. 根组织DNA提取。
    1. 使用专为植物优化的试剂盒（见材料表）按照制造商提供的操作说明进行DNA提取。
      注意：我们选用专为植物组织设计的该试剂盒，以从根样品中获得最大提取产量。与土壤和根际样品不同，根组织中的腐殖酸及其他污染物影响较小。
  3. 按照步骤5.4的方法对DNA进行定量。

7. 扩增并测序分离的DNA。

  1. 使用具有校对功能的聚合酶（见材料表）扩增16S基因的V4区，具体方法如Gohl等12所述。使用不同的索引引物对样本进行条形码标记，并在测序前混合。采用Gohl等12所述方法，通过两步PCR流程结合V4区引物进行测序（补充文件1）。
    注意：这些步骤的部分方法在其他文献中已有详细描述12,13,14，因此此处不再赘述。对于根部样本，添加了PNA阻断剂以减少植物组织中质体DNA的扩增，该方法此前已有完整描述15。测序过程中设置了两个对照：一个阴性对照，包含提取过程中的空白对照（见步骤5.1.5后的说明）；另一个为已知细菌DNA种群组成的模拟群落（见材料表），作为阳性对照。
    注意：大多数情况下使用MiSeq试剂盒v3，以2 × 300碱基双端模式运行。本研究中的样本使用Illumina HiSeq 2500仪器，采用快速模式下的250对读（2 × 250）模式。所有样本均在同一测序通道中完成测序。
  2. 通过微生物群落分析流程处理测序数据（USEARCH v9.2.64、QIIME v1.9.1 和 RStudio v3.4.3 16）。
    1. 使用USEARCH17准备测序数据。
      注意：USEARCH可在线获取并附有完整操作说明（https://www.drive5.com/usearch/）。
    2. 利用索引读段或条形码对测序数据进行解复用，将Illumina读段分配至各对应样本。
    3. 合并双端读段以获得一致序列。使用命令：usearch -fastq_mergepairs *R1*.fastq -relabel @ -fastq_maxdiffs 10 -fastq_minmergelen 230 -fastq_maxmergelen 320 -fastq_pctid 80 -fastqout merged.fq。
      注意：参数设置依据USEARCH使用手册。
    4. 从测序数据中去除引物序列，以避免PCR反应可能引起的引物序列错配。使用命令：usearch -fastx_truncate merge.fq -stripleft 19 -stripright 20 -fastqout stripped.fq。
    5. 对测序数据进行过滤，去除低质量读段，保留高质量的操作分类单元（OTU）序列。使用命令：usearch -fastq_filter stripped.fq -fastq_maxee 1.0 -fastaout filtered.fa。
  3. 在USEARCH中生成OTU。
    1. 进行去重复处理，识别出唯一的OTU序列集合。使用命令：usearch -fastx_uniques filtered.fa -fastaout uniques.fa -sizeout -relabel Uniq。
    2. 将序列相似度为97–100%的OTU聚类，以定义唯一的OTU。使用命令：usearch -cluster_otus uniques.fa -minsize 2 -otus otus.fa -relabel Otu。
      注意：此步骤同时去除了聚类后OTU中的单序列OTU（singletons），并剔除了测序数据中的嵌合体。
    3. 在USEARCH中创建OTU表。使用命令：usearch -usearch_global stripped.fq -db otus.fa -strand plus -id 0.97 -otutabout otutable.txt。
      注意：该命令生成一个表格，列出每个样本中所有OTU的读段数量（计数）。该OTU表用于后续分析，包括差异丰度分析和微生物多样性分析。OTU表示例见补充图2。
    4. 在QIIME v1.9.1中进行稀疏化分析18。
      注意：稀疏化曲线基于OTU表计算，用于评估测序深度是否足以充分代表微生物群落。稀疏化曲线示例如图补充图3所示。
    5. 进行α多样性分析18。使用QIIME v1.9.1中的alpha_rarefaction.py脚本计算每个样本内微生物群落的多样性。
      注意：该分析计算Shannon19、Simpson20和Chao121等多样性指数。
    6. 进行β多样性分析18,22。使用QIIME v1.9.1中的Python脚本beta_diversity_through_plots.py，基于Bray–Curtis相异度矩阵进行分析。
      注意：该分析用于比较样本间微生物群落组成的差异。
    7. 在组间进行统计分析。使用vegan软件包23 v2.4.5中的adonis和anova函数，在RStudio16中基于PERMANOVA计算的距离矩阵进行分析。使用vegan包中的capscale函数进行主坐标轴典范分析（CAP）。使用RStudio中的ggplot2软件包24 v2.2.1进行数据可视化。

结果

本文所示的代表性结果来自2012年在美国内布拉斯加州米德市附近林肯内布拉斯加大学农业研究司农场建立的野外试验点。试验开始前，该地块长期采用玉米-大豆轮作的管理方式。试验地点位于三种不同类型的土壤上，但数据分析时假设所有测定土壤性质的变化均由施加的处理措施引起。

试验地点包含两个纯种柳枝稷（P. virgatum cv Liberty）和大须芒草（A. gerardii）样地，以及一个低多样性禾草混合样地，其中包含大须芒草、印第安草（S. nutans）和“Butte”品种侧生燕麦草（B. curtipendula）。这三个暖季型禾草样地采用随机完全区组设计，重复三次。在三种不同禾草样地内嵌套设置了两种氮（N）施肥处理，分别为施用56（N1）和112（N2）kg N ha-1 的尿素。在生长季末进行微生物组取样时，施用112 kg N ha-1 的样地土壤中硝酸盐含量为8.0 ± 1.1（均值± 标准差）ppm，施用56 kg N ha-1 的样地为6.8 ± 0.7（均值+标准差）ppm硝酸盐。这些样地每年施肥一次。暖季型禾草样地被设为主区（8000 m2），氮处理为裂区（4000 m2）。大须芒草以“Bonanza”和“Goldmine”各占50:50的比例混合播种，印第安草则以“Scout”和“Warrior”各占50:50的比例混合播种。样地于2012年种植，首次施氮处理发生在2013年春季。

土壤和根系取样于2014年9月15日进行。下述工作在一个采用裂区随机设计的田间试验中开展，共设置三个重复（图1）。所有样品内生圈的平均测序深度如下：4871 ± 5711（均值 ± 标准差），根际：40726 ± 14684，土壤：38184 ± 9043。在采用所述方法的这些实验中，变异的主要来源之一是不同样品类型间微生物群落的差异（图2）。在此代表性数据集中，根际与土壤在群落组成上彼此更为相似，而与内生圈差异较大 （图2A）。然而，根际与土壤之间的微生物群落组成也存在极显著差异（p = 0.001）（图2B）。通过样品类型分析，这些实验中由样品类型解释的总变异为26%。

Alpha多样性分析表明，与土壤和根际相比，内生环境中的微生物群落多样性较低图3）。在任何区室中，不同草种之间的多样性差异仅存在于大须芒草和柳枝稷的内生菌群样本之间，其中柳枝稷的微生物物种多样性显著更高（图3）。相对丰度分析（图4) 强调了主导地位 变形菌门 随后 放线菌门 在所有样品类型中。土壤和根际也以……为主 酸杆菌门 和 绿弯菌门 而内生圈 相对丰度较高 拟杆菌门.

在本实验中，植物施用了两种不同量的氮肥，因此我们分析数据以确定是否存在处理效应。处理效应占总变异的12%，但差异未达到显著水平，尽管在排序图中两种处理看起来有所不同（图5）。这凸显了对这类数据集进行统计分析的重要性，而非依赖视觉观察或定性判断。

采用限制性排序方法对植物组织和土壤微生物组受植物影响的差异进行可视化分析。通过PERMANOVA分析确定统计学差异，以检验特定变量（如物种）是否导致样本间微生物群落组成存在显著差异。当所有样本类型合并分析时，发现植物物种对微生物群落组成具有极显著的影响（图6）。本实验中，植物物种所解释的变异量为6.7%。最后，对每种样本类型分别进行独立分析，以确定哪一类样本可能是驱动植物物种显著效应的主要因素。仅在内生菌群中，不同植物物种间的微生物群落组成表现出极显著差异（p = 0.001）（图7）。在其他样本类型中，物种效应单独分析时均不显著。在内生菌群中，物种所解释的变异百分比为27%，而在根际（18%）和土壤（15%）中较低。这进一步强调了对每种组织类型分别进行分析的重要性。

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图1：试验田设计示例。 试验田设计展示了位于美国内布拉斯加州林肯市内布拉斯加大学东部研究与推广中心梅德附近的试验地点所采用的三重复随机完全区组设计。完整地点描述请见结果部分。N1为低氮水平（56 kg N ha-1 尿素），N2（112 kg N ha-1 尿素）为施用的较高氮水平。请点击此处查看此图的放大版本。

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图2：利用2014年多年生禾草采样中不同样品类型（包括内生圈、根际和土壤）的微生物组成进行β多样性分析。 分析使用QIIME 1.9.1中的Python脚本生成Bray-Curtis相异度矩阵。基于Bray-Curtis相异度矩阵的主坐标分析（PCoA）在RStudio中进行可视化。PCoA1和PCoA2分别表示PCoA分析中解释的最大和第二大变异量。采用PERMANOVA统计分析方法确定不同样品类型之间的显著性差异，p值显示在右上角。图中每个符号代表每个样品的完整微生物群落。(A) 内生圈、根际和土壤样品类型合并分析。全部87个样品均稀疏化至每个样品486条序列。(B) 根际和土壤样品合并分析。全部59个样品均稀疏化至每个样品8231条序列。请点击此处查看该图的放大版本。

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图3：利用Shannon指数对内生圈、根际和土壤中每种物种的α多样性进行分析。 分析使用QIIME 1.9.1中的Python脚本完成。对内生圈、根际和土壤样本类型分别进行稀疏化处理，每份样本的序列数分别为486、17154和8231条。方框表示第25和第75百分位数（第一和第三四分位数）。方框内的水平线表示中位数，红色加号表示均值。须线表示剔除异常值后的数据范围（异常值以黑点表示），异常值定义为超出四分位距1.5倍以上的数据点（除边穗格兰马混合样n = 5外，其余各样本n = 6）。五种物种在内生圈中的Shannon指数均低于根际和土壤。采用非参数Wilcoxon秩和检验确定物种间的显著性差异，仅在方框上方标示出具有显著差异的结果。请点击此处查看该图的放大版本。

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图4：内生圈、根际和土壤中门水平的相对丰度。 对样品进行分析，以比较不同样品类型中微生物门的丰度（每种样品类型 n = 29）。分析使用 QIIME 1.9.1 中基于 OTU 表的 Python 脚本完成。饼图中不同的颜色代表不同的门。百分比表示每个门在各类样品中的相对丰度。门分类信息由核糖体数据库项目分类器（Ribosomal Database Project classifier, RDP）25 进行注释。请点击此处查看该图的放大版本。

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图5：以处理方式作为所有样本类型间限制因素的分析。 采用主坐标约束分析（CAP）来判断不同处理方式之间的微生物群落组成是否存在差异。每种氮处理的样本数量分别为：N1（56 kg N ha-1）组 n = 42，N2（112 kg N ha-1）组 n = 45。Bray-Curtis 相异性矩阵通过 QIIME 1.9.1 中的 Python 脚本生成。基于 Bray-Curtis 相异性矩阵的 CAP 分析在 RStudio 中以处理方式作为约束因子进行。采用 PERMANOVA 分析判断处理方式间的差异是否显著，p 值显示在右上角。请点击此处查看该图的放大版本。

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图6：以植物种类作为所有样本类型间限制因子的分析。 本分析旨在确定在所有样本类型中，不同植物种类之间的微生物群落组成是否存在差异。对所有样本类型（内生圈、根际和土壤）进行了主坐标排序分析和典范对应分析（CAP），所用数据基于Bray-Curtis相异度矩阵。Bray-Curtis相异度矩阵由QIIME 1.9.1中的Python脚本生成。在RStudio中，以植物种类作为限制因子，基于Bray-Curtis相异度矩阵进行CAP分析。采用PERMANOVA统计分析方法评估植物种类之间的显著性差异，P值显示在图的右上角。图中每个符号代表该样本的整个微生物群落。n = 18（每种植物在所有样本类型中），但侧生画眉草混合样本为n = 15。请点击此处查看该图的放大版本。

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图7：以物种作为约束因子对每种样本类型分别进行典范分析（CAP）的示例。 基于Bray-Curtis相异性矩阵对每种样本类型（内生圈、根际和土壤）进行主坐标排序及典范分析（CAP）。每种样本类型分别稀释至每个样本486、17154和8231条序列，对应内生圈、根际和土壤。使用物种作为约束排序的因子。采用PERMANOVA统计分析方法确定每种样本类型中不同植物物种间的显著性差异，p值显示在右上角。图中每个符号代表每个样本的完整微生物群落。每种样本类型的样本量为n = 29，每种植物物种在每种样本类型中的样本量为n = 6，侧穗黍混合样本除外（n = 5）。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

本文所述方法可帮助科研人员轻松进入土壤与植物宏基因组学领域。多年来，我们在开展本论文所描述的实验过程中不断优化实验流程。其中一个改进是，我们现在在前往野外采样前就预先标记试管。本实验室采用条形码系统和标签打印机。标签打印机不仅在标记试管时节省时间，而且使所有样品更易于追踪，并能准确识别，避免人为手写带来的不确定性。另一个关键点是，我们尽量在将样品带回实验室后尽快进行处理。我们的目标是在野外采样返回后的12至36小时内，完成用于DNA分析的土壤样品的冷冻、根系的灭菌与冷冻，以及根际环境样品的过滤与冷冻。DNA提取过程步骤繁多、耗时较长，尤其是土壤和根际样品的提取。为此，我们购置了一台自动化设备（Kingfisher Flex，ThermoFisher），可显著减少DNA提取过程中的人工操作时间，降低人为误差，并提高不同批次土壤、根系或根际样品处理的一致性。在处理植物材料时，重要的是需明确研究的目标根系类型，或采集多种根系类型以获得"具有代表性的样品"。在进行DNA提取时，保持根系和叶片处于冷冻状态至关重要，同时在填充96孔DNA提取板时，必须确保样品之间无交叉污染。另一个需要考虑的重要因素是在设计田间实验时应确定所需的重复数量，并尽可能采用完全随机设计26。由于田间环境变异性较高，可能需要设置较多的重复次数，才能检测到微小的差异。最后，根据我们的经验，在挖掘根系时必须确保土壤不过于潮湿。如果土壤含水量过高，不仅操作混乱，而且很难界定根际区域，也难以将土壤从根系上彻底清除。

在这些方法开发初期，我们对其中一个步骤进行了改进：不再用手摇动试管以分离根际土壤，而是改用由气体发生器驱动的涡旋振荡器，从而减轻了野外工作强度，并使每支试管的振荡时间和方式更加标准化。扩增子测序方法的一个局限性在于，其结果的分类学分辨率通常有限，许多操作分类单元（OTUs）无法鉴定，或仅能鉴定到科或属水平。该研究领域正在迅速发展，因此有必要关注不断涌现的新方法，特别是能够提升结果分辨率的数据分析技术。

这些实验方案仅适用于研究细菌和古菌，不适用于真菌。使用不同的引物进行扩增，可利用相同的DNA样本研究真菌群落。27,28这些方法无需购买大量设备，因为其操作流程可被简化。本文所述方法主要用于测定 "谁在那里"但该领域正在迅速发展，转而关注功能方面的重要问题，这些问题可通过宏基因组测序方法、微生物的分离与功能检测，或对整个微生物基因组进行测序来解答。

代表性结果突显了使用所述方法可能鉴定出的微生物群落之间的差异。通过采用β多样性方法进行数据分析22，结果显示不同样品类型之间存在组成上的差异。此类差异在大多数其他研究中也已明确观察到，即内生圈、根际和土壤中含有独特的微生物群落3。通过计算Shannon多样性指数，以确定每种植物物种的内生圈、根际和土壤中微生物物种的丰富度和均匀度。正如本研究及许多其他研究所示，α多样性在土壤中最高，在根际中略有降低，而在内生圈中则显著下降3,5,29。这些结果表明，本文所述方法适用于鉴定内生圈、根际和土壤中微生物群落组成的改变。

优势的 变形菌门 在内生环境和土壤研究中是一种常见发现30,31,32内生环境通常具有较低的微生物物种多样性，但某些微生物的相对丰度较高 变形菌门这再次表明，本研究的结果与其他文献中的发现具有一致性。本研究中处理效应无显著差异，其主要原因可能有两个：一是处理措施所造成的差异不够大，未能产生足以被检测到的显著变异；二是采样是在生长季末期进行的，此时田间可能已有足够时间将氮素消耗至相近水平，而本研究测量的正是生长季结束时的氮含量。在另一项采用相似施肥量但持续时间更长的研究中，仅检测到微生物组组成发生相对较小的变化。33其他研究已表明，氮肥会导致真菌和细菌群落发生变化34,35.

已知植物物种在其微生物组的形成中起着重要作用3,32,36，甚至在同一物种的不同基因型之间，微生物群落结构的微小差异也已被证实37。本研究发现，不同植物物种之间的微生物群落组成存在显著差异。在所有样本类型中，柳枝稷的微生物组成似乎最为独特，但物种间的差异仅在内生菌群中达到统计学显著性。若能获得更多的重复样本用于分析，根际群落组成的差异可能也会变得显著。

本文所述的野外、实验室及分析方法相结合，为研究不同因素如何影响土壤、根际以及根系内生环境中微生物群落的组成提供了一种强有力的技术手段36。微生物组研究领域尚有大量工作亟待开展，尤其是在农业耕作系统中。关于土壤微生物组如何改变作物产量的重要问题仍未完全阐明。即使是诸如轮作制度如何影响土壤微生物组、时间节点如何改变微生物组、非生物胁迫如何影响微生物组、土壤类型如何与上述因素相互作用进而改变微生物组，以及在美国特定作物或地区是否存在普遍存在的微生物等最基本的问题，目前仍属开放性课题。这些方法还可用于流行病学研究，以鉴定病原性和有益细菌的存在及其持续性。这些方法未来的另一个发展方向是将本文所述的DNA分析方法与植物和微生物的RNA及代谢物数据整合起来。进一步优化这些实验方案，还需对更多变量进行额外的改进与验证。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本手稿的撰写工作得到了美国国家科学基金会EPSCoR根系与根际微生物组创新中心项目OIA-1557417的资助。数据收集工作得到了内布拉斯加大学林肯分校农业研究与发展基金以及美国农业部哈奇基金的支持。我们还感谢美国农业部农业研究局（USDA-ARS）的支持，同时感谢美国农业部国家食品与农业研究所通过农业与食品研究倡议竞争性基金项目编号2011-68005-30411提供的资助，用于建立和管理这些试验田。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
DNeasy PowerSoil HTP 96 试剂盒Qiagen/MoBio12955-4用于土壤和根际的提取试剂盒
DNeasy PowerPlant HTP 96 试剂盒Qiagen/MoBio13496-4用于根部的提取试剂盒
D-Handle 挖掘铲，101 cm 长Fiskars9669
快速耕作锄，40 cm 长Truper34316
Ziploc 自封袋，17.7 cm × 19.5 cmZiplocNA
冷藏箱任意品牌NA
清洗盆任意品牌NA
塑料桶任意品牌NA
手套（作业和实验用）任意品牌NA
直径 20 cm 土壤筛 #8，2360 μm 网孔尺寸Dual Manufacturing Co., Chicago ILUS8-8FS
直径 20 cm 土壤筛 #4，4750 μm 网孔尺寸Dual Manufacturing Co., Chicago ILUS8-4FS
便携式发电机本田品牌性能良好NA
无菌细胞滤筛，100 μm 网孔尺寸Fisher Scientific22-363-549
NaH2PO4·H2OVWR0823
Na2HPO4VWR0404
Silwet L-77Lehman SeedsVIS-30表面活性剂
高压灭菌器任意品牌NA
干燥烘箱任意品牌NA
天平任意品牌任意型号
漂白剂CLOROX — 家用浓度NA
Tween 20任意品牌NA
液氮任意来源NA
干冰颗粒任意来源NA
乙醇任意品牌NA
11 cm 精细尖头镊子Fisher17456209
18 cm 直头标本镊VWR82027-436
13.5 cm 修枝剪Fiskars9921
2 mL 离心管任意品牌NA
15 mL 聚丙烯锥形管MIDSCIC15B
50 mL 聚丙烯锥形管MIDSCIC50B
超纯水Millipore-sigmaMilli-Q Integral, Q-POD
Qubit 2.0 荧光计InvitrogenQ32866
Qubit dsDNA HS 检测试剂盒InvitrogenQ32854用于去除样品的 DNA 定量
QuantiFluor dsDNA 检测系统PromegaE2670用于 DNA 定量
96 孔黑色带透明平底板Corning3631
pPNA PCR 阻断剂PNA BioPP01-50
mPNA PCR 阻断剂PNA BioMP01-50
微生物模拟群落 B（均匀低浓度）v5.1L 基因组 DNA，用于 16S rRNA 基因测序BEI ResourcesHM782D
8 孔粘性板条VWR89134-434
不锈钢珠，直径 3.2 mmNext AdvanceSSB32
1 mL 检测块（用于 Qiagen/MoBio DNeasy PowerPlant HTP 试剂盒的 DNA 提取板）CoStar3959
抗静电聚丙烯称量漏斗，小号，适用于土壤/根际TWD Tradewinds, INCASWF1SPK
抗静电聚丙烯称量漏斗，超小号，适用于根/叶TWD Tradewinds, INCASWFXSCS
Genie 2 数字涡旋振荡器Scientific IndustriesSI-0236
50 mL 管涡旋适配器Scientific IndustriesSI-H506
研钵（100 mL）和研杵任意品牌NA
金属微型刮勺VWR80071-672
一次性抗静电微型刮勺VWR231-0106
棕色纸袋 2#（10.95 cm × 6.19 cm × 20 cm）Duro18402
5424 离心机（适用于 2 mL 管）Eppendorf22620461
96 孔板离心机Sigma4-16S81510
50 mL 管离心转子Sigma4-16S12269 - Biosafe
KAPA HiFi DNA 聚合酶Kapa Biosystems

参考文献

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DNA 16S rRNA
多年生草本植物实验中土壤、根际及根部微生物群落的分离与分析
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