成像 FITC-葡聚糖作为胞吐作用调节的记者

Summary

在这里, 我们详细介绍了一种带电细胞成像的调节胞吐作用方法。该方法利用 FITC-葡聚糖, 在溶酶体相关细胞器中积累, 作为记者。这一简单的方法也允许区分不同模式的调节胞吐作用在细胞难以操纵基因。

Abstract

被调控的胞吐作用是一个过程, 其中储存在分泌颗粒 (SGs) 的货物是针对分泌扳机释放的。调节胞吐作用是细胞间沟通的基础, 是神经递质、激素、炎症介质和其他化合物分泌的关键机制, 由多种细胞引起。至少有三种不同的机制是已知的调节胞吐作用: 全胞吐作用, 其中一个单一的 sg 完全融合与等离子膜, 亲吻和运行胞吐作用, 其中一个单一的 sg 瞬态保险丝与等离子膜, 和复合胞吐作用, 其中在 SG 与等离子膜融合之前或之后的几个 SGs 保险丝。细胞所进行的调节胞吐作用的类型通常由分泌触发器的类型决定。然而, 在许多细胞中, 单个分泌触发器可以同时激活多种模式的调节胞吐作用。尽管它们在细胞类型和种类上的丰富和重要, 但确定不同分泌方式的机制基本上没有解决。对胞吐作用的不同模式进行调查的主要挑战之一, 是区分两者之间的困难, 并分别进行探讨。在这里, 我们描述使用荧光素异硫氰酸酯 (FITC)-葡聚糖作为胞吐作用的记者, 和活细胞成像, 以区分不同的途径, 调节胞吐作用, 侧重于复合胞吐作用, 基于鲁棒性和exocytic 事件的持续时间。

Introduction

调节胞吐作用是一个主要的机制, 使货物从分泌细胞释放, 以响应特定的触发。这些货物是预先形成的, 并被封存成分泌性的囊泡, 在其中储存, 直到触发器中继的信号, 以释放 SGs 的内容。不同类型的信号可能导致不同的调节胞吐作用模式, 或不同的调节胞吐作用模式可能同时发生。三调节胞吐作用的主要模式为: 全胞吐作用, 包括与血浆膜完全融合单一分泌颗粒;胞吐作用, 它涉及分泌颗粒与血浆膜的瞬态融合, 其次是其循环再造;和复合胞吐作用, 其特点是着融合的几个 SGs 之前 (即, 多粒胞吐作用) 或顺序 (即, 顺序胞吐作用), 以融合与等离子膜¹。复合胞吐作用被认为是最广泛的货物释放模式², 因为它允许快速分泌的货物, 包括从 SGs 在远离等离子膜。复方胞吐作用已记录在外分泌和内分泌细胞^3,4,5,6,7,8,⁹, 以及在免疫细胞。在免疫细胞中,....

Protocol

1. 筹备工作

1. RBL 培养基的制备
   1. 混合500毫升低葡萄糖 Dulbecco 的改良鹰的培养基 (DMEM) 与56毫升的胎牛血清 (血清), 5.5 毫升青霉素-链霉素-制霉菌素溶液, 5.5 毫升 l-谷氨酰胺200毫米溶液。这导致低葡萄糖 DMEM 补充10% 血清, 100 µg/毫升链霉素, 100 单位/毫升青霉素, 12 单位/毫升制霉菌素, 2 毫米 l-谷氨酰胺。
   2. 使用0.22 µm 孔径大小的顶部真空过滤器过滤介质, 并存储在4摄氏度。
2. 对 RBL 细胞的维护。
   1. 在10厘米的盘子中, 将 RBL 细胞生长到最大融合90%。如果细胞培养是健康的, 细胞应该有一个纺锤形与偶尔突起。
   2. 对于细胞分裂, 从盘子中分离细胞, 通过吸媒体和取代2毫升的 trypsine/EDTA 溶液 b. 在 5% CO₂的湿润气氛中孵育5-10 分钟, 37 摄氏度。
   3. 一旦细胞分离, 就可以通过添加2毫升培养基, 使用吸管来中和胰蛋白酶, 并将细胞分成 1:2-1:10 的比例。
3. 20x Tyrode 缓冲器的研制
   1. 在双蒸馏水 (DDW) 中, 准备20x 溶液, 54 毫米氯化钾, 20 毫米氯化镁₂, 2.74 米氯化钠, 8 毫米 NaH₂P....

Results

图 1a代表了 FITC-葡聚糖如何作为胞吐作用的记者, 并概括了 exocytic 事件的不同模式。首先, 细胞与 FITC 葡聚糖一起孵化, 这是由吞饮内化, 并归类到 SGs。由于 MCs 的 SGs 是 LROs, 他们的低 pH 值抑制 FITC 的荧光, 这里显示为黑色颗粒 (A-C, I)。当细胞由 secretagogue 和与等离子膜的 SGs 保险丝触发时, 形成一个融合孔, 允许将质子和 sgs 的碱性流出。因此, FITC 恢复了它的荧光 (a, II)。完整的胞吐作用将在短 (少于5秒) 的荧光事件中表现出来, 因为形象化 SG 的膜完全折叠成等离子膜, FITC-葡聚糖扩散到培养基中 (a, III)。在一个接吻和运行的 exocytic 事件中, sg 的膜只瞬时与等离子膜融合, 导致短暂的融合毛孔, 因此只有当 SG 迅速分离和其流明迅速重新酸化 (B,III.)。最后, 在复合胞吐作用中, 一系列的 SGs 依次熔断 (继 SG 熔接) 以及与等离子膜, 保持一个开放的聚变孔。因.......

Discussion

在这里, 我们描述如何追踪 FITC-葡聚糖的荧光加载到 SGs 可以用来专门捕捉化合物胞吐作用事件。这是通过设置显微镜, 每15秒获得一个图像, 从而确保只有长期的事件将记录一段时间, 因此不包括短事件, 将对应于完全胞吐作用或接吻和运行胞吐作用。为了建立这种方法, 我们表明, 在 RBL 细胞中表达的 Rab5 亚型的击倒, 是复合胞吐作用的关键, 消除了捕捉 FITC-葡聚糖释放事件的能力, 而细胞的整体分泌不受影响。

该方法最突出的缺点是它只适用于含有酸性 SGs 的细胞。然而, 该方法最突出的优点是, 它是基于简单的孵化细胞与 FITC 葡聚糖, 不需要转染。其他 ph 敏感的记者, 用于研究受管制的胞吐作用, 涉及 sg 的货物或 sg 膜蛋白融合到 phlourin, ph 敏感的 GFP 变种 (如 NPY-phlourin, β-hexoseaminidase phlourin, synapto-phluorin^{48, 49、}.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM 低葡萄糖	生物诱导剂	01-050-1A
胎牛血清	Gibco	12657
Pen-链球菌-制霉菌素溶液	生物诱导剂	03-032-1B
L-谷氨酰胺 200 mM 溶液	生物诱导剂	03-020-1A
FITC 右旋糖酐 150K	Sigma-Aldrich	46946-500MG-F
胰蛋白酶/EDTA 溶液 B	生物诱导剂	03-052-1A	37 &°C 温热;C 使用前的水浴
0.22 µ 的顶真空过滤器;M 孔径	Sigma-Aldrich	CLS430769-1EA
醋酸纤维素针头过滤器装置，0.22 µm 孔径	Sartorius	16534K
腔室盖玻片	Thermo Scientific	155411
康宁组织培养物处理的培养皿	Sigma-Aldrich	CLS430167
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich	A4503
抗DNP单克隆IgE	Sigma-Aldrich	D8406
DNP-HSA （Ag）	Sigma-Aldrich	A6661	避免阳光直射
Hepes 缓冲液 1M，pH 7.4	生物诱导剂	03-025-1B
CaCl2	MERK	102382
葡萄糖	BDH 实验室	284515V
氯化铵	MERK	1145
PIPES 二钾盐	Sigma-Aldrich	108321-27-3
醋酸钙水合	物Sigma-Aldrich	114460-21-8
乙酸镁四水合	Sigma-Aldrich	M5661
谷氨酸钾（L-谷氨酸钾盐一水合物）	Sigma-Aldrich	G1501
NaH2PO4	MERK	6346
NaCl	MERK	106404
MgCl2	MERK	105833
KCl	MERK	104936
电穿孔仪	BTX	ECM830
共聚焦显微镜，蔡司	蔡司	LSM 5 Pascal，Axiovert 200M	，如图 3 所示。配备电子温控 气流培养箱
共聚焦显微镜、Zeiss	Zeiss	LSM 800、Axio Observer.Z1 /7	如图 2 所示。配备 GaAsP 检测器、电子温控 气流培养箱
共聚焦显微镜、徕卡	徕卡	SP5	如图 1 所示。配备徕卡 HyD 检测器和顶级培养箱 （okolab）
RBL-2H3 细胞			在 Reuben P. Siraganian 的实验室中克隆。见参考文献 67