用于检测蛋白酶活性的纳米传感器 体内 用于无创诊断

摘要

蛋白酶是参与基本生物过程的严格调控酶类，而蛋白酶活性的失调会推动癌症等复杂疾病的进展。本方法旨在构建用于检测蛋白酶活性的纳米传感器 体内 通过产生可在宿主尿液中检测到并能区分疾病的裂解信号。

摘要

蛋白酶是一类具有多种功能的酶，专门催化肽键的水解反应，调控包括稳态和异稳态在内的广泛生物学过程。此外，失调的蛋白酶活性可驱动疾病发生发展，并作为癌症等疾病的机能性生物标志物；因此，检测蛋白酶活性的能力 体内 可为生物医学诊断提供具有临床意义的信息。本实验方案的目的是构建用于检测蛋白酶活性的纳米传感器 体内 通过在尿液中产生可量化的信号。这些蛋白酶纳米传感器由两部分组成：纳米颗粒和底物。纳米颗粒的功能是延长血液循环半衰期，并将底物递送至目标疾病部位。底物为一段短肽序列（6-8个氨基酸），设计为特异性针对目标蛋白酶或一类蛋白酶。底物共价连接于纳米颗粒表面，并以报告分子（如荧光标记物）作为末端，用于检测。当失调的蛋白酶切割该肽段底物后，报告分子被过滤至尿液中，作为蛋白酶活性的生物标志物进行定量。本文描述了一种针对基质金属蛋白酶9（MMP9）的纳米传感器构建方法，MMP9与肿瘤进展和转移相关，在小鼠模型中用于结直肠癌的检测。

引言

蛋白酶是一类多功能酶，专司肽键的水解反应，在多种生物学过程（包括稳态、异稳态及疾病）中发挥重要调控作用¹蛋白酶活性的改变与多种疾病相关，包括癌症和心血管疾病，这使得蛋白酶成为开发临床生物标志物的理想候选分子^2,3此外，蛋白酶活性在功能上与不同的发病机制、患者预后及疾病转归密切相关。⁴生物传感器的开发广泛用于检测多种生物现象和疾病，例如癌症、神经退行性疾病以及电子转移过程。^5,6,7,8,9更具体而言，已开发出基于底物的蛋白酶传感器用于检测蛋白酶活性，其中包括用于诊断成像的荧光探针¹⁰ 以及同位素标记的肽类底物用于 体外 质谱检测¹¹此外，已开发出基于活性的探针，这类探针含有类似底物的区域，可结合或修饰靶标蛋白酶¹²采用该方法时，目标蛋白酶的....

方案

研究人员所在机构的机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准是开展以下动物实验的必要条件。此外，需具备标准的动物护理设施（例如， 饲养室、无菌动物操作罩、异氟烷麻醉室以及 CO₂ 用于实施人道终点安乐死的装置）对于正确开展这些实验是必要的。相关机构的生理学研究实验室（PRL）可提供针对这些设施的专门培训与协助。所有动物实验均经佐治亚理工学院IACUC批准（方案编号：A14100）。

1. 氧化铁纳米颗粒（IONP）的合成

注意：安全事项：整个氧化铁纳米颗粒的合成过程必须在佩戴个人防护装备并在化学通风橱下进行。

1. 在15 mL锥形管中，将1 mL 30%氢氧化铵置于冰桶中冷却30 min。
2. 用去离子水清洗一个 250 mL 的锥形瓶，并加入 10 mL 双蒸水（ddH₂O）。₂O）。将烧瓶外部浸入置于搅拌/加热板上的冰浴中。使用塑料移液管通入 N₂ 气体通入 ddH₂O₂O₂ 置于烧瓶中。用 N₂ 鼓泡 15 分钟₂ 去氧。
3. 称重 224 µmol (4.5 克) 右旋糖酐（分子量 (MW) = 20 kDa）加入 50 mL 一次性无菌离心管中。加入 H₂使终体积（包括葡聚糖）为 20 mL。充分涡旋振荡以溶解葡....

结果

IONPs 群体中的大部分颗粒直径接近平均值，范围为 40 - 50 nm。聚乙二醇化（pegylation）后，该尺寸范围的颗粒在体内循环半衰期约为 6 小时¹³ in vivo（见图 2a）。若需选择特定尺寸范围的颗粒，可采用尺寸排阻色谱法分离出不同直径的 IONP 组分。透射电镜（TEM）下，这些纳米颗粒表现为由外层葡聚糖交联在一起的单个球形氧化铁纳米颗粒¹³ 。IONPs 溶液呈半透明、无沉淀，颜色为浅棕色。成功进行肽段偶联后，光谱吸收分析将显示荧光报告分子最大激发波长处出现明显的吸收峰。以 FITC 为例，该吸收峰中心位于约 488 nm（见图 2b）。典型的肽段偶联反应经 FPLC 纯化后，可获得肽段与 IONP 的摩尔比为 20 - 50。为检测探针对蛋白酶活性的感应能力，可将一份纳米传感器样品.......

讨论

本方法描述了基于活性的纳米传感器的开发，该传感器由蛋白酶底物与纳米颗粒核心偶联而成。蛋白水解切割事件被称为"药代动力学开关"，因为切割后的肽段产物小于肾脏滤过尺寸极限（5 nm）²³ ，可滤入尿液从而产生无创信号。因此，使用流体动力学半径大于5 nm的纳米颗粒或载体至关重要，任何更小的颗粒都会被肾脏迅速清除，干扰尿液信号。我们采用聚乙二醇修饰的氧化铁纳米颗粒（IONPs），因为其已获美国FDA批准，生物相容性良好，且循环半衰期为3–5小时。¹³ 在纳米传感器的构建中，另一个重要考虑因素是聚乙二醇（PEG）与肽底物的摩尔比。^24,25 提高该比例可通过空间屏蔽作用减少非靶向蛋白酶引起的非特异性切割²⁶，但也可能同时降低对靶标蛋白酶的反应活性；相反，较低的PEG与肽比例将增加蛋白酶对肽段的可及性和切割效率，从而增强检测信号，但可能同时增加.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.2 µm 注射器滤器	VWR	4652
18G 针头	VWR	89134-024
15 mL 离心管	VWR	89039-670
250 mL 锥形瓶	VWR	89000-362
搅拌子	VWR	58949-006
加热板/磁力搅拌器	VWR	97042-634
冰醋酸	VWR	97064-482
牛血清白蛋白（BSA）	Thermo Fisher	A13100
六水合三氯化铁	Sigma	236489
四水合二氯化铁	Sigma	44939
表氯醇	Sigma	45340-500ML-F
DMF	Sigma	D4551
氢氧化铵	Sigma	320145-500ML
氢氧化钠颗粒	Sigma	221465-500G
EDTA	Sigma	E9884
硼酸钠	Sigma	B9876
L-半胱氨酸	Sigma	168149-100G
Tris-HCl	Sigma	T5941
Tris 碱	Sigma	T6066
PBS 片剂	Sigma	P4417
葡聚糖	Pharmacosmos	5510 0020 9006
Amicon 15 mL 10k 滤器，24 个装	Millipore	UFC901024
Amicon 15 mL 30k 滤器，24 个装	Millipore	UFC903024
Amicon 15 mL 100k 滤器，24 个装	Millipore	UFC910024
Zetasizer Nano ZS	Malvern Panalytical	NanoZS
Slide-A-Lyzer 透析盒	LifeTech	66130
Dynabeads MyOne Tosylactivated	LifeTech	65501
SIA	Life Tech	22349
PEG 20k	Laysan Bio	MPEG-SH-20K-1g
荧光素抗体 [2A3]	GeneTex	GTX10257
Hiload 16/600 Superdex 200	GE Healthcare	45-002-490
酶标仪	Fisher	BTCYT5M
BD 胰岛素注射器	Fisher	NC0872854