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方法文章

用于检测蛋白酶活性的纳米传感器 体内 用于无创诊断

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DOI：

10.3791/57937

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2018年7月16日

 ,  , 
1Wallace H. Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Tech College of Engineering and Emory School of Medicine, 2Parker H. Petit Institute of Bioengineering and Bioscience, 3Institute for Electronics and Nanotechnology, Georgia Tech, 4Integrated Cancer Research Center, Georgia Tech, 5The Georgia Immunoengineering Consortium, Emory University and Georgia Tech

本文内容

摘要

蛋白酶是参与基本生物过程的严格调控酶类，而蛋白酶活性的失调会推动癌症等复杂疾病的进展。本方法旨在构建用于检测蛋白酶活性的纳米传感器 体内 通过产生可在宿主尿液中检测到并能区分疾病的裂解信号。

摘要

蛋白酶是一类具有多种功能的酶，专门催化肽键的水解反应，调控包括稳态和异稳态在内的广泛生物学过程。此外，失调的蛋白酶活性可驱动疾病发生发展，并作为癌症等疾病的机能性生物标志物；因此，检测蛋白酶活性的能力 体内 可为生物医学诊断提供具有临床意义的信息。本实验方案的目的是构建用于检测蛋白酶活性的纳米传感器 体内 通过在尿液中产生可量化的信号。这些蛋白酶纳米传感器由两部分组成：纳米颗粒和底物。纳米颗粒的功能是延长血液循环半衰期，并将底物递送至目标疾病部位。底物为一段短肽序列（6-8个氨基酸），设计为特异性针对目标蛋白酶或一类蛋白酶。底物共价连接于纳米颗粒表面，并以报告分子（如荧光标记物）作为末端，用于检测。当失调的蛋白酶切割该肽段底物后，报告分子被过滤至尿液中，作为蛋白酶活性的生物标志物进行定量。本文描述了一种针对基质金属蛋白酶9（MMP9）的纳米传感器构建方法，MMP9与肿瘤进展和转移相关，在小鼠模型中用于结直肠癌的检测。

引言

蛋白酶是一类多功能酶，专司肽键的水解反应，在多种生物学过程（包括稳态、异稳态及疾病）中发挥重要调控作用1蛋白酶活性的改变与多种疾病相关，包括癌症和心血管疾病，这使得蛋白酶成为开发临床生物标志物的理想候选分子2,3此外，蛋白酶活性在功能上与不同的发病机制、患者预后及疾病转归密切相关。4生物传感器的开发广泛用于检测多种生物现象和疾病，例如癌症、神经退行性疾病以及电子转移过程。5,6,7,8,9更具体而言，已开发出基于底物的蛋白酶传感器用于检测蛋白酶活性，其中包括用于诊断成像的荧光探针10 以及同位素标记的肽类底物用于 体外 质谱检测11此外，已开发出基于活性的探针，这类探针含有类似底物的区域，可结合或修饰靶标蛋白酶12采用该方法时，目标蛋白酶的活性位点被修饰后将发生不可逆抑制，分析过程需要采集组织样本，因而受到限制 体内 应用。然而，检测蛋白酶活性非常重要 体内因为蛋白酶活性的调控在很大程度上依赖于其他生物学活动的背景，例如内源性抑制剂的存在。

本研究的目的是描述可检测蛋白酶活性的基于活性的纳米传感器的构建方法 体内 通过在尿液中产生可测量的信号。该平台作为一种无创诊断工具，利用失调的蛋白酶活性作为功能性生物标志物，以区分癌症等复杂疾病。我们的纳米传感器平台由与蛋白酶底物偶联的氧化铁纳米颗粒（IONP）组成。这些底物末端连接有荧光报告分子，当蛋白酶切割底物时，荧光报告分子被释放。这些IONP在体内循环 体内，定位于疾病部位，并使底物暴露于活性疾病相关蛋白酶。切割后，荧光报告分子被释放，因其分子量较小而进入尿液，而未切割的底物仍保留在IONP上并滞留于体内。因此，蛋白酶活性的升高 体内 将导致尿液中报告分子的浓度升高（图1）。由于我们的平台是一种尿液检测，因此无需影像学平台，诊断信号在尿液中即可富集。

该平台可被设计用于检测多种疾病，包括癌症、纤维化和血栓形成13,14。本文描述了用于检测基质金属蛋白酶9（Matrix metallopeptidase 9, MMP9）活性升高的纳米传感器的设计，以作为结直肠癌的生物标志物。结直肠癌是美国癌症死亡的第二大原因，仅2014年就估计有136,800例新发病例和50,300例死亡15。结直肠肿瘤细胞产生MMP9，研究表明该酶可促进恶性进展、基质降解以及转移16。此外，我们从文献中筛选出一种适用于MMP9的肽底物（PLGVRGK）17。该平台可用于癌症的早期检测以及低成本的即时诊断13,14,18,19,20,21。

疾病相关蛋白水解通路示意图；IONP用于肾小球滤过及尿液诊断
图1：纳米传感器活性示意图 在体. 纳米传感器在体内循环并定位于疾病部位。随后，与疾病相关的蛋白酶会切割由IONPs呈递的肽底物。切割后产生的片段尺寸允许其经由肾脏清除，从而在尿液中富集。动物排尿后，可通过其报告分子对这些肽片段进行分析。 请点击此处以查看该图的放大版本。

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方案

研究人员所在机构的机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准是开展以下动物实验的必要条件。此外，需具备标准的动物护理设施（例如， 饲养室、无菌动物操作罩、异氟烷麻醉室以及 CO2 用于实施人道终点安乐死的装置）对于正确开展这些实验是必要的。相关机构的生理学研究实验室（PRL）可提供针对这些设施的专门培训与协助。所有动物实验均经佐治亚理工学院IACUC批准（方案编号：A14100）。

1. 氧化铁纳米颗粒（IONP）的合成

注意：安全事项：整个氧化铁纳米颗粒的合成过程必须在佩戴个人防护装备并在化学通风橱下进行。

  1. 在15 mL锥形管中，将1 mL 30%氢氧化铵置于冰桶中冷却30 min。
  2. 用去离子水清洗一个 250 mL 的锥形瓶，并加入 10 mL 双蒸水（ddH₂O）。2O）。将烧瓶外部浸入置于搅拌/加热板上的冰浴中。使用塑料移液管通入 N2 气体通入 ddH₂O2O₂ 置于烧瓶中。用 N₂ 鼓泡 15 分钟2 去氧。
  3. 称重 224 µmol (4.5 克) 右旋糖酐（分子量 (MW) = 20 kDa）加入 50 mL 一次性无菌离心管中。加入 H2使终体积（包括葡聚糖）为 20 mL。充分涡旋振荡以溶解葡聚糖。
  4. 称重 290 µmol (78.5 克) 六水合三氯化铁，加入葡聚糖溶液中，涡旋溶解。
  5. 将所得溶液通过滤器过滤 0.2 µm 过滤器
  6. 将1 mL 冰冻的氨水转移至9 mL 去氧水中。返回 4 °C.
  7. 称重 367 µmol (73.0 克) 四水合氯化亚铁，溶于 1 mL 无氧 ddH₂O 中2O，然后过滤 0.2 µm 过滤器
  8. 将葡聚糖-铁(III)溶液转移至250 mL锥形瓶中，并用N₂脱氧2 冰上孵育15分钟。使用以1600 rpm转速旋转的磁力搅拌子混合。
  9. 为创建均匀的氮气环境，用橡胶隔垫密封烧瓶。用18号针头刺穿隔垫，通入N₂2 插入一个单独的18号针头作为流出通道。
  10. 添加 467 µL 用1 mL注射器将铁(II)溶液加入右旋糖酐-铁(III)溶液中，同时使用磁力搅拌子以1600 rpm的速度搅拌。该铁(II)与铁(III)的比例可实现反应平衡，生成磁铁矿（Fe₃O₄）。3O4.
  11. 将冷却的稀氨水逐滴加入铁(II)-铁(III)-右旋糖酐溶液中，以引发成核过程21确保每个液滴充分混合后再加入下一个。加入1-2 mL氢氧化铵后结束反应。
  12. 停止氮气的流动2 并移除橡胶隔垫。撤去冰浴，换用温水浴，同时继续搅拌溶液。确保溶液温度达到 75 °C 孵育75分钟。
  13. 将烧瓶从搅拌/加热板上取下，并通过双层滤膜过滤溶液 0.2 µm 然后 0.1 µm 用于去除粗颗粒的滤器。
  14. 将颗粒置换到 ddH₂O 中2使用100 kDa分子量截留值（m.w.c.o.）的浓缩器去除溶液中过量的葡聚糖，此时溶液应非常黏稠。若经过2–3次离心后滤液仍呈深色，表明滤膜可能已破损，应更换滤器。
    1. 使用旋转滤器进行缓冲液置换时，离心处理 4 °C 在4800 × g下离心15分钟，弃去流出液，并向IONP溶液中加入新的缓冲液。重复3至5次。
  15. 使用分光光度计或酶标仪测定纳米颗粒的浓度。在400 nm波长处测定吸光度，并采用该波长下IONP的摩尔吸光系数（ε = 2.07 x 106 厘米-1 M-1) 以测定 IO 颗粒的浓度。
  16. 将IONPs重悬于ddH₂O中，浓度为10 mg/mL2O（通常总体积约为 3 mL），此步骤须使用聚丙烯管以确保化学相容性。加入 1.6 倍体积的 5 M NaOH，然后加入 0.65 倍体积的环氧氯丙烷。于室温下在平板振荡器上剧烈振荡混合 12 小时，以实现葡聚糖的交联。
  17. 使用带有18号针头的20 mL注射器将IONP溶液转移至50 kDa分子量截留值透析膜中。将透析膜置于4 L ddH₂O中2O 并替换 H2每隔2-3小时轻摇数次，过夜孵育。
  18. 测定浓度并将 IONPs 调整至 5 mg/mL（参见步骤 1.15）。加入氨水至终浓度为 20%（v/v），室温下振荡反应 > 12 小时以使 IONPs 表面氨基化。使用 30 kDa 分子量截留值滤器进行缓冲液置换（见 1.14）。
  19. 在最终通过快速蛋白液相色谱（FPLC）纯化前，将体积调至2.5 - 3.5 mL（参见 材料清单 用于凝胶过滤柱。
  20. 使用动态光散射（DLS）测定IONPs的流体动力学半径（预期范围10 - 100 nm，平均粒径40 - 50 nm）。取1 mL经100倍稀释的IONP样品置于比色皿中，放入仪器，利用厂商提供的软件进行测量。
    注意：通过动态光散射（DLS）测量，IONPs 的总体粒径分布范围为 10 至 100 nm，但大多数颗粒的粒径集中在平均直径 40–50 nm 附近。若需进一步限定粒径范围，可采用尺寸排阻色谱法分离不同直径的组分。IONPs 应储存于 4 °C.

2. 肽的设计、与IONP的偶联及 体外 验证

  1. 合成一种肽底物（例如， 由核心设施或商业途径获得的靶向蛋白酶，其N端带有荧光报告基团（如异硫氰酸荧光素（FITC）），C端带有半胱氨酸残基，以实现巯基介导的偶联。
    注意：在本研究中针对 MMP9 所使用的肽为 FITC-PLGVRGK-C，其中 k猫/m ~ 2.0 × 105 M-1s-1.
  2. 取0.5 mg的IONP（浓度为1 mg/mL），使用10 kDa截留分子量的离心滤膜，在偶联缓冲液（50 mM硼酸钠含1 mM EDTA，pH = 8.5）中进行缓冲液置换（参见步骤1.14）。
  3. 将琥珀酰亚胺碘乙酸酯（SIA）溶于二甲基甲酰胺（DMF）中，配制成浓度约为 30 mg/mL 的溶液，并按 500:1 的摩尔比将 SIA 加入 IONP 中。
    注意：SIA 是一种异双功能交联剂，可介导 IONPs 上的氨基与肽底物上的巯基之间的偶联。
  4. 在室温避光条件下孵育1 - 2小时。若需过夜孵育，则置于 4 °C.
  5. 使用10 kDa 分子截留量（m.w.c.o.）离心滤膜将缓冲液置换为偶联缓冲液，以去除未反应的SIA（参见步骤1.14）。
  6. 将终产物溶液调整至1 mg/mL（0.5 mL溶液）。按90:1的摩尔比（肽:IONP）将目标肽与20 kDa巯基封端的聚乙二醇（PEG）混合，PEG与IONP的摩尔比为20:1（PEG:IONP）。将该肽-PEG溶液与IONP混合。
  7. 在室温下，以最高转速在平板摇床上孵育过夜，用铝箔包裹管子以防止荧光分子发生光漂白。
  8. 以500:1（C:IONP）的摩尔比加入L-半胱氨酸，以中和任何未反应的SIA分子。在室温下孵育1小时 25 °C 在室温下以最高速度振荡。
  9. 通过FPLC进行纯化（参见1.1.19）。使用分光光度计测量样品溶液的吸光度，并根据以下方法计算肽：IONP比率。纯化后，将产物以1 mg/mL浓度储存于 4 °C 在 PBS 中。
    1. 使用分光光度计在 400 nm 处测定样品溶液的吸光度（A样本,400）以及所用荧光染料的最大吸收波长，FITC 的最大吸收波长为 488 nm（A样本，488）。在相同两个波长（400 nm 和 488 nm）下测定储备胺类 IONP 溶液的吸光度，分别记为 ANP,400 和 ANP,488.
    2. 使用公式 1 和 2 计算归一化的 A400 和 A488 值。
      平衡方程图：A<sub>400</sub> = A<sub>NP,400</sub>，用于吸收分析。          公式 1
      488 nm 处吸光度计算公式：A = ANP,400 / Asample,400 - Asample,488 - ANP,488，用于光谱分析。          公式 2
    3. A400 和 A488 表示样品的归一化值。使用这些值并根据公式3计算肽与IONP的比率。
      多肽-IONP配方，用于吸光度比值A488/A400的光谱分析方程。          方程 3
    4. 何处 离子纳米颗粒方程，εIONP，在研究示意图中，与纳米化学研究相关。 和 荧光量子产率方程符号 ε_荧光团用于光谱分析。 分别为IONP和荧光团的摩尔吸光系数。对于这些颗粒 离子纳米颗粒方程，εIONP，在研究示意图中，与纳米化学研究相关。 = 2.06 × 106 M-1cm-1 以及用于 FITC 荧光量子产率方程符号 ε_荧光团用于光谱分析。 = 72,000 M-1cm-1，因此该值为  摩尔消光系数比 εIONP/ε荧光团，光谱分析中的方程。 应为28.75。典型的多肽：IONP比例应在20:1至50:1范围内。
  10. 通过执行以下步骤验证探针的功能性： 体外 切割实验
    1. 用 PBS（1% BSA）配制 18 µL 含200 nM肽浓度的纳米颗粒溶液。混合 2 µL 目的蛋白酶（MMP9；0.1 - 1 mg/mL）。
    2. 在酶标仪中孵育 37 °C 孵育1小时，每隔1-2分钟进行荧光检测（使用相应的激发和发射波长，FITC的激发波长为485 nm，发射波长为528 nm），以监测切割反应进程。

3. 纳米传感器的施用及癌症的尿液检测

注意：有关示例模型的更多细节，请参见我们之前的报告13。

  1. 通过将圆筒形套管固定在96孔板顶部，制备用于尿液收集的代谢笼。在收集尿液期间，将小鼠放入套管内，并用培养皿盖覆盖，以防止动物逃逸。
  2. 在无菌生理盐水中配制注射溶液（最大体积200 µL），其中纳米传感器的浓度为每肽段3000 mg/kg（约50 µmol）。
  3. 对8周龄雌性裸鼠（nude mice），其携带负荷约为100–300 mm3的LS174T结肠直肠癌异种移植瘤（通常在第10天左右达到该负荷），通过尾静脉注射给予纳米传感器溶液。注射后立即把小鼠放入代谢笼中，并记录每只小鼠的注射时间。
  4. 注射后60–90分钟，从96孔板上取下圆筒形套管。固定小鼠并轻压膀胱，促使小鼠将残留尿液排入孔板。收集全部尿液（200–500 µL）。
  5. 通过免疫沉淀法分析尿液样本，以纯化尿液中的FITC并提高检测灵敏度。使用偶联了抗FITC抗体的磁珠。
    1. 首先，用包被缓冲液清洗磁珠25 mg，共清洗3次，并将最终体积调至225 µL。
      注意：每次均需新鲜配制包被缓冲液（0.1 M硼酸钠，pH 9.5）、封闭缓冲液（PBS，0.5% BSA，0.05% Tween-20，pH 7.4）和洗涤缓冲液（PBS，0.1% BSA，0.05% Tween-20，pH 7.4），每种缓冲液约需20 mL。
    2. 加入200 µL抗FITC抗体溶液（5 mg/mL）和200 µL硫酸铵溶液（3 M）。在旋转仪上37 °C孵育16–24小时。
    3. 将溶液加入磁力分离器中，弃去上清液，替换为625 静态平衡；ΣFx=0方程；力平衡；物理示意图；教学用途。Λ封闭缓冲液，在37 °C过夜孵育。随后用洗涤缓冲液清洗3次，并储存于1.25 mL洗涤缓冲液中。
    4. 将2 µL尿液与5 µL磁珠（20 mg/mL）混合，并用PBS（0.01% Tween 20）定容至总体积50 µL。孵育60分钟。
    5. 每次使用50 µL PBS（0.01% Tween 20）洗涤，利用磁力分离器在每次洗涤后收集磁珠，共洗涤两次。
    6. 用32.5 µL 5%冰醋酸洗脱两次。将合并的洗脱液（70 µL）用35 µL 2 M Tris中和，使最终pH值约为7。
    7. 在酶标仪（见材料表）上选择适当的激发和发射波长读取荧光值，通过已知浓度游离荧光素的标准曲线计算尿液中荧光报告分子的浓度。

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结果

IONPs 群体中的大部分颗粒直径接近平均值，范围为 40 - 50 nm。聚乙二醇化（pegylation）后，该尺寸范围的颗粒在体内循环半衰期约为 6 小时13 in vivo（见图 2a）。若需选择特定尺寸范围的颗粒，可采用尺寸排阻色谱法分离出不同直径的 IONP 组分。透射电镜（TEM）下，这些纳米颗粒表现为由外层葡聚糖交联在一起的单个球形氧化铁纳米颗粒13 。IONPs 溶液呈半透明、无沉淀，颜色为浅棕色。成功进行肽段偶联后，光谱吸收分析将显示荧光报告分子最大激发波长处出现明显的吸收峰。以 FITC 为例，该吸收峰中心位于约 488 nm（见图 2b）。典型的肽段偶联反应经 FPLC 纯化后，可获得肽段与 IONP 的摩尔比为 20 - 50。为检测探针对蛋白酶活性的感应能力，可将一份纳米传感器样品...

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讨论

本方法描述了基于活性的纳米传感器的开发，该传感器由蛋白酶底物与纳米颗粒核心偶联而成。蛋白水解切割事件被称为"药代动力学开关"，因为切割后的肽段产物小于肾脏滤过尺寸极限（5 nm）23 ，可滤入尿液从而产生无创信号。因此，使用流体动力学半径大于5 nm的纳米颗粒或载体至关重要，任何更小的颗粒都会被肾脏迅速清除，干扰尿液信号。我们采用聚乙二醇修饰的氧化铁纳米颗粒（IONPs），因为其已获美国FDA批准，生物相容性良好，且循环半衰期为3–5小时。13 在纳米传感器的构建中，另一个重要考虑因素是聚乙二醇（PEG）与肽底物的摩尔比。24,25 提高该比例可通过空间屏蔽作用减少非靶向蛋白酶引起的非特异性切割26，但也可能同时降低对靶标蛋白酶的反应活性；相反，较低的PEG与肽比例将增加蛋白酶对肽段的可及性和切割效率，从而增强检测信号，但可能同时增加...

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披露

Kwong 博士是 Glympse Bio 的联合创始人，并担任该公司的顾问，该公司正在开发与本文所述研究相关的产品。本研究可能影响其个人财务状况。该安排的条款已由佐治亚理工学院根据其利益冲突政策进行审查并批准。

致谢

本工作由美国国立卫生研究院（NIH）院长创新者奖资助（项目编号：DP2HD091793）。Q.D.M. 由美国国家科学基金会研究生研究奖学金项目支持（资助编号：DGE-1650044）。B.A.H. 由美国国立卫生研究院 GT BioMAT 培训项目（项目编号：5T32EB006343）以及佐治亚理工学院校长奖学金支持。G.A.K. 获得伯勒斯威康基金科学交叉领域职业奖。本文内容仅由作者负责，不一定代表美国国立卫生研究院的官方观点。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.2 µm 注射器滤器VWR4652
18G 针头VWR89134-024
15 mL 离心管VWR89039-670
250 mL 锥形瓶VWR89000-362
搅拌子VWR58949-006
加热板/磁力搅拌器VWR97042-634
冰醋酸VWR97064-482
牛血清白蛋白（BSA）Thermo FisherA13100
六水合三氯化铁Sigma236489
四水合二氯化铁Sigma44939
表氯醇Sigma45340-500ML-F
DMFSigmaD4551
氢氧化铵Sigma320145-500ML
氢氧化钠颗粒Sigma221465-500G
EDTASigmaE9884
硼酸钠SigmaB9876
L-半胱氨酸Sigma168149-100G
Tris-HClSigmaT5941
Tris 碱SigmaT6066
PBS 片剂SigmaP4417
葡聚糖Pharmacosmos5510 0020 9006
Amicon 15 mL 10k 滤器，24 个装MilliporeUFC901024
Amicon 15 mL 30k 滤器，24 个装MilliporeUFC903024
Amicon 15 mL 100k 滤器，24 个装MilliporeUFC910024
Zetasizer Nano ZSMalvern PanalyticalNanoZS
Slide-A-Lyzer 透析盒LifeTech66130
Dynabeads MyOne TosylactivatedLifeTech65501
SIALife Tech22349
PEG 20kLaysan BioMPEG-SH-20K-1g
荧光素抗体 [2A3]GeneTexGTX10257
Hiload 16/600 Superdex 200GE Healthcare45-002-490
酶标仪FisherBTCYT5M
BD 胰岛素注射器FisherNC0872854

参考文献

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