用于临床敷料评估的猪重度烧伤模型

摘要

为了准确模拟烧伤的损伤模式，需要临床观察与动物模型研究之间的相互结合。本研究建立了一种猪的重度烧伤模型，用于在生理和病理生理条件下评估一种实验性敷料的效果。

摘要

伤口愈合是一个动态的修复过程，也是人类生命中最复杂的生物学过程。烧伤后，生物通路的改变会损害炎症反应，导致伤口愈合延迟。在糖尿病患者中，伤口愈合受损常导致截肢等不良后果。因此，亟需具有促进烧伤伤口修复作用的敷料。然而，由于缺乏合适的动物模型，烧伤伤口治疗的研究十分有限。我们之前的研究已采用微创外科技术，在大鼠和猪模型中验证了伤口愈合效果。本研究旨在建立一种严重的烧伤猪模型，该模型可消除伤口收缩，并更接近人类的再上皮化和新生组织形成过程。本方案提供了在猪模型中制备一致性烧伤伤口，并评估实验性敷料对伤口愈合效果的详细操作流程。在背部对称地制造六个烧伤伤口，覆盖由四层组成的临床敷料：内层接触层为实验材料，内中间层为防水膜，外中间层为纱布，外层为胶带。实验结束后，评估伤口闭合情况、伤口面积及温哥华瘢痕量表评分。动物安乐死后，取各动物的皮肤样本进行组织学制备，并采用苏木精-伊红染色。同时检测每种敷料在伤口愈合背景下的抗菌活性。在猪模型中应用临床敷料可模拟人类伤口愈合的上皮化、细胞增殖和血管生成等生物学过程。因此，该猪模型为评估临床敷料在严重烧伤中的作用提供了一种易于掌握、成本效益高且可靠的实验方法。

引言

烧伤会启动炎症过程，并引发复杂的病理效应，这些效应在事故发生后立即影响身体的多种功能，对患者的生活质量产生负面影响。糖尿病患者中，伤口愈合受损会导致显著的发病率和死亡率^1,2。大多数烧伤患者在进行烧伤创面清创时会经历疼痛，尽管使用强效阿片类镇痛药，该过程仍被认为是极为痛苦的³。

与其他哺乳动物相比，猪在上皮化过程、细胞增殖和血管生成等方面具有多项与人类相似的解剖学和生理学特征。这使得猪在某些手术和研究中成为潜在更优的模型，常被用于在小鼠中取得有前景结果后的后续研究。这些特点促使猪在临床前测试中作为主要物种的使用日益增加。近年来，在心血管、泌尿、皮肤和消化系统相关的生物医学研究中，观察到显著增长的趋势^4,5,6。本研究旨在建立一种严重的烧伤损伤猪模型，该模型可消除伤口收缩，更接近地模拟人类的伤口愈合过程及新生组织的形成。在猪背部对称地制造六个烧伤伤口，脊柱两侧各三个。随后，在严重烧伤损伤的猪模型中评估一种实验性敷料，该模型可被调整以模拟人类的伤口愈合过程（图1）。伤口覆盖....

方案

涉及动物受试者的实验程序已获得中国台湾国防医学院动物护理委员会的批准。本研究在国防医学院实验动物中心进行。采用本方案已成功对体重在20至25 kg之间的猪进行仪器植入操作。

1. 动物对人类操作的适应

1. 动物到达设施后，应单独饲养，但允许彼此之间进行互动。
2. 提供实验动物 随意摄取 食物和水的获取
3. 在动物设施将猪转运至实验实验室之前，每天至少对猪进行一次人手操作训练，持续一周，以使其适应人类接触和运输过程。
4. 手术前至少禁食动物12小时，以防止恶心、呕吐和胃液误吸。

2. 镇静

1. 在创建烧伤伤口前，对动物进行镇静处理 通过 静脉注射 Zoletil 50（25 mg/kg）。

3. 插管与通气

1. 将动物置于桌子和/或推车上，保持胸卧位 位置
2. 使用口腔扩张器打开动物的口腔。
3. 如果猪的下颌放松不足或存在妨碍插管的吞咽反射，可使用异氟烷进行面罩麻醉以诱导镇静。
4. 手术期间通过生理信号监测仪监测血压、心率和体温，以预防潜在并发症。

4. 麻醉

....

结果

使用热铁造成30秒烧伤持续时间，产生的伤口呈圆形，边界清晰，颜色均匀苍白，周围伴有红斑环（图1D）。每只动物背部共有六个烧伤创面。烧伤创面的排列方式见图1K。创面完全覆盖含CAPS的敷料，用于评估烧伤后第0、7、21和42天的瘢痕形成深度以及再上皮化情况，再上皮化程度通过肉眼观察确定。根据肉眼观察，烧伤创面在烧伤后第42天完成再上皮化。在这些动物中，通过评估创面大小以确定创面愈合速率（图2A）。烧伤后第0、7、21和42天的创面面积分别为9、10、8和3 cm²。与烧伤第0天相比，烧伤第42天创面面积显著减小。愈合速率定义为从创面中心到创面边缘的最大平均距离除以创面完全闭合所需时间。使用含CAPS敷料处理的创面在烧伤后第42天达到73.43±6.33%的创面闭合率（图2B）。

讨论

本研究建立了一种猪的重度烧伤模型，并使用含CAPS的敷料对该模型进行了评估。我们的结果表明，该猪烧伤模型可用于监测实验性敷料的临床性能，包括其抗菌特性。同时采用VSS评分、H&E染色和抗菌试验分析了伤口愈合速率、伤口闭合情况及抗菌活性。动物烧伤模型已被开发为研究烧伤损伤病理生理学的有力工具。使用大鼠作为实验对象具有一些生物学优势，例如存在大量针对大鼠的特异性试剂，以及在获取转基因大鼠方面的实用性，有助于揭示恢复过程中活跃的分子信号通路。然而，大鼠在动物烧伤模型中的主要缺点是其无法完全模拟人类的伤口愈合过程。在人类中，再上皮化是主要的愈合方式⁸，而大鼠的伤口愈合则主要依赖快速的伤口收缩⁹。此外，大鼠不易形成增生性瘢痕或瘢痕疙瘩，进一步证实其伤口修复过程与人类存在差异。相比之下，猪近年来受到研究人员的关注，因其皮肤结构与人类皮肤相似。此外，猪与人类的伤口愈合过程均经历生理上类似的阶段，包括炎症期、增殖期、再上皮化期和重塑期。通常情况下，猪的烧伤在21天内愈合，再上皮化发生在伤后7至14天之间¹⁰

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<强>镇静：
氯胺酮	Merial	2528 ESP	10 mL 小瓶
阿扎哌隆	中国化学 &和药物	47W406	100 mL 小瓶
阿托品	东方化工厂	IN120802	1 mL 小瓶
<强>麻醉剂：
替来他明+唑拉西泮	Virbac	BC91	5 mL 小瓶
异氟烷	巴克斯特	N002A225	100 mL 小瓶
<强>外科手术：
理发剪	Moser	-	-
聚维酮碘洗液	Ever star	HA161202	4 L 桶
改良铁剂	-	-	-
0.9% 生理盐水溶液	CHI SHENG	KC130	500 mL 茄形瓶
纱布	中国外科敷料中心	MO15900080	10 x 10 cm
CAPS	CoreLeader Biotech Co., Ltd，中国台湾台北	-	-
纸质胶带	3M	NDC-8333-1530-01	2.5 cm × 9.1 m
防水膜	3M	NDC-8333-1600-40	10 cm × 10 m
粘性创可贴	年轻的化学	BH1426015	10 cm × 10 m
<强>解剖：
标准直头尖/钝剪刀（14 cm）一对	Shinetec 仪器	ST-S114	-
Halstead-蚊子（12.5 厘米）	Shinetec 仪器	ST-H012	-
手柄（#4）	Shinetec 仪器	ST-H004	-
手术刀片（#21）	Shinetec 仪器	ST-B021	-
<强>固定后处理 &和储存：
50 ml 塑料离心管	Falcon	352070	-
10% 中性缓冲福尔马林	Leica	3800604EG	-
<强>细菌生长实验
血琼脂平板（BAP）（含5%绵羊血的TSA）	CMP	-	90 mm 单层