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方法文章

用于临床敷料评估的猪重度烧伤模型

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DOI：

10.3791/57942

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2018年11月6日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Graduate Institute of Medical Sciences, National Defense Medical Center, 2Department and Graduate Institute of Biology and Anatomy, National Defense Medical Center, 3Department of Gerontological Health Care, National Taipei University of Nursing and Health Sciences, 4Division of Rheumatology/Immunology/Allergy, Department of Internal Medicine, Tri-Service General Hospital, National Defense Medical Center, 5Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Tri-Service General Hospital, 6Department of Nursing, Yuanpei University, 7Department of Physiology and Biophysics; Graduate Institute of Physiology, National Defense Medical Center, 8Division of Urology, Department of Surgery, Tri-Service General Hospital, National Defense Medical Center

本文内容

摘要

为了准确模拟烧伤的损伤模式，需要临床观察与动物模型研究之间的相互结合。本研究建立了一种猪的重度烧伤模型，用于在生理和病理生理条件下评估一种实验性敷料的效果。

摘要

伤口愈合是一个动态的修复过程，也是人类生命中最复杂的生物学过程。烧伤后，生物通路的改变会损害炎症反应，导致伤口愈合延迟。在糖尿病患者中，伤口愈合受损常导致截肢等不良后果。因此，亟需具有促进烧伤伤口修复作用的敷料。然而，由于缺乏合适的动物模型，烧伤伤口治疗的研究十分有限。我们之前的研究已采用微创外科技术，在大鼠和猪模型中验证了伤口愈合效果。本研究旨在建立一种严重的烧伤猪模型，该模型可消除伤口收缩，并更接近人类的再上皮化和新生组织形成过程。本方案提供了在猪模型中制备一致性烧伤伤口，并评估实验性敷料对伤口愈合效果的详细操作流程。在背部对称地制造六个烧伤伤口，覆盖由四层组成的临床敷料：内层接触层为实验材料，内中间层为防水膜，外中间层为纱布，外层为胶带。实验结束后，评估伤口闭合情况、伤口面积及温哥华瘢痕量表评分。动物安乐死后，取各动物的皮肤样本进行组织学制备，并采用苏木精-伊红染色。同时检测每种敷料在伤口愈合背景下的抗菌活性。在猪模型中应用临床敷料可模拟人类伤口愈合的上皮化、细胞增殖和血管生成等生物学过程。因此，该猪模型为评估临床敷料在严重烧伤中的作用提供了一种易于掌握、成本效益高且可靠的实验方法。

引言

烧伤会启动炎症过程，并引发复杂的病理效应，这些效应在事故发生后立即影响身体的多种功能，对患者的生活质量产生负面影响。糖尿病患者中，伤口愈合受损会导致显著的发病率和死亡率1,2。大多数烧伤患者在进行烧伤创面清创时会经历疼痛，尽管使用强效阿片类镇痛药，该过程仍被认为是极为痛苦的3。

与其他哺乳动物相比，猪在上皮化过程、细胞增殖和血管生成等方面具有多项与人类相似的解剖学和生理学特征。这使得猪在某些手术和研究中成为潜在更优的模型，常被用于在小鼠中取得有前景结果后的后续研究。这些特点促使猪在临床前测试中作为主要物种的使用日益增加。近年来，在心血管、泌尿、皮肤和消化系统相关的生物医学研究中，观察到显著增长的趋势4,5,6。本研究旨在建立一种严重的烧伤损伤猪模型，该模型可消除伤口收缩，更接近地模拟人类的伤口愈合过程及新生组织的形成。在猪背部对称地制造六个烧伤伤口，脊柱两侧各三个。随后，在严重烧伤损伤的猪模型中评估一种实验性敷料，该模型可被调整以模拟人类的伤口愈合过程（图1）。伤口覆盖临床敷料，该敷料由四层组成：内层接触层为实验材料，内层中间层为防水膜，外层中间层为纱布，外层为粘性胶带。防水膜可保持伤口环境湿润，同时防止细菌感染并允许气体透过敷料。外层中间的纱布覆盖在防水膜上，并由外层粘性胶带固定。实验结束后，评估伤口闭合情况、伤口面积以及温哥华瘢痕量表（VSS）评分。动物安乐死后，取各动物的皮肤样本进行组织学制备，并采用苏木精-伊红（HE）染色。本模型还评估了每种敷料在伤口愈合背景下的抗菌活性。我们之前的研究已通过微创外科技术在大鼠和猪模型中验证了伤口愈合效果7。由于每只猪背部有六个烧伤伤口，每种实验性敷料在所有位置均进行了测试和评估，以尽量减少因猪背部不同部位伤口愈合差异所带来的偏倚。因此，本研究建立的严重烧伤损伤猪模型为临床敷料的评估提供了新方法，并有助于开发烧伤治疗的新策略。本研究提供了揭示烧伤伤口愈合病理生理机制的关键工具。

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方案

涉及动物受试者的实验程序已获得中国台湾国防医学院动物护理委员会的批准。本研究在国防医学院实验动物中心进行。采用本方案已成功对体重在20至25 kg之间的猪进行仪器植入操作。

1. 动物对人类操作的适应

  1. 动物到达设施后，应单独饲养，但允许彼此之间进行互动。
  2. 提供实验动物 随意摄取 食物和水的获取
  3. 在动物设施将猪转运至实验实验室之前，每天至少对猪进行一次人手操作训练，持续一周，以使其适应人类接触和运输过程。
  4. 手术前至少禁食动物12小时，以防止恶心、呕吐和胃液误吸。

2. 镇静

  1. 在创建烧伤伤口前，对动物进行镇静处理 通过 静脉注射 Zoletil 50（25 mg/kg）。

3. 插管与通气

  1. 将动物置于桌子和/或推车上，保持胸卧位 位置
  2. 使用口腔扩张器打开动物的口腔。
  3. 如果猪的下颌放松不足或存在妨碍插管的吞咽反射，可使用异氟烷进行面罩麻醉以诱导镇静。
  4. 手术期间通过生理信号监测仪监测血压、心率和体温，以预防潜在并发症。

4. 麻醉

  1. 诱导并维持麻醉；建议通过肌肉注射替来他明和唑拉西泮（各25 mg/kg）对动物进行麻醉。
  2. 当观察到肌肉松弛，表现为下颌张力消失和眼睑反射减弱时，使用气管导管对动物进行气管插管。
  3. 在整个手术过程中，将所有猪维持在麻醉状态，异氟烷蒸发器设定为0.5–2.5%（v/v）。
  4. 术前通过夹捏后肢脚趾测试疼痛反射，以评估麻醉深度。必要时追加麻醉药物或等待数分钟。手术过程中应定期检查疼痛反射。

5. 手术部位的消毒

  1. 将动物脊柱两侧至腋窝区域的皮肤剃净并清洁，范围约为25 cm宽。
  2. 用聚维酮碘清洗剂（75 mg/mL）擦洗湿润的皮肤，持续约5分钟。
  3. 使用湿润的无菌纱布从皮肤上去除聚维酮碘皂液。
  4. 用聚维酮碘搽剂（100 mg/mL）对皮肤进行消毒。
  5. 用无菌手术巾覆盖动物，以减少细菌转移及手术部位的后续污染。

6. 烧伤创面的制备

  1. 使用外科标记笔在猪背部对称标记六个烧伤创面的中心位置，确保每个烧伤创面之间的距离大于创面半径（图1A）。
  2. 将50 mL甘油注入改装的电烙铁中，并插入电子温度计以监测温度。该热烙铁具有约9 cm2的平坦接触面（图1B）。
  3. 使用加热板将烙铁加热至137–139 °C（图1C）。
  4. 将烙铁置于已标记区域，不施加任何压力，持续30秒，以制作六个均匀的烧伤创面（图1C）。
  5. 用0.9%生理盐水冲洗烧伤创面（图1D）。
  6. 测量创面尺寸，并通过显微摄影记录创面情况（图1E）。

7. 敷料的制备

  1. 通过直接接触，用四层临床敷料的内层接触层覆盖每个伤口。该层可使用含 CAPS 的敷料或其他替代材料（图 1F）。
  2. 在临床敷料上覆盖一层防水膜，以防止细菌侵入（图 1F）。
  3. 用一层纱布（0.5 cm 厚）覆盖每个伤口，并用纸质胶带固定，作为敷料的中间层（图 1G）。
  4. 用外层粘性胶带固定纱布，并将该层延伸至躯干，以防止敷料移位（图 1H-1J）。

8. 烧伤后护理与测量

  1. 在麻醉苏醒前开始，每 8-12 小时为猪注射一次布托啡诺（0.1 mg/kg，肌内注射），持续一周，以减轻潜在疼痛。
  2. 允许猪自由进食和饮水。
  3. 在研究的前 10 天内每 2 天更换一次临床敷料，之后在 6 周研究期间每周更换两次。
  4. 每次更换敷料前清洁并测量伤口。更换敷料期间给予麻醉剂。
  5. 通过显微摄影记录伤口情况，用于比较伤口愈合速率：前 10 天每 2 天一次，之后在 6 周研究期间每周两次。
  6. 根据先前描述的方法，将伤口再上皮化或收缩程度计算为原始伤口大小的百分比。伤口闭合分析以双盲方式进行。
  7. 使用 VSS 评估烧伤瘢痕，VSS 包含四个变量：血管分布、高度（厚度）、柔韧性及色素沉着，分别在烧伤后第 0、7、21 和 42 天进行测量。每个变量有四至六个可能评分，总分范围为 0 至 14，其中 0 分表示正常皮肤。

9. 烧伤后组织的细菌生长实验

  1. 在烧伤后第0、7、21和42天对伤口进行拭子采样，用于抗菌检测。
  2. 将拭子放入100 mL的0.9%无菌生理盐水中，轻轻涡旋震荡，以获得均匀的悬浮液。
  3. 对匀浆液进行连续稀释（10−1–10−5），并分别取每种稀释液100 μL接种至选择性和非选择性培养基中。
  4. 将所有稀释液在37 °C有氧条件下培养24–72小时。
  5. 从所有稀释液中各取10 μL的等分试样，共三份，接种至补充5%羊血的血琼脂平板上，以分离需氧的革兰氏阳性菌。
  6. 将样品均匀涂布或倾注于琼脂平板表面，过夜培养，以测定菌落形成单位（CFUs）的数量。
  7. 过夜培养后读取平板结果。将羊血琼脂平板倒置，在培养皿底部使用记号笔和小尺子均分为四个象限。
  8. 将平板置于解剖显微镜载物台上，计数每个平板上的菌落。根据定义，只有菌落数不少于300 CFU时方可进行计数。
  9. 对三个重复样本中的细菌菌落分别计数，计算三个重复样本的平均值，并将该平均值乘以最终稀释倍数，确定每平板的CFU数值。

10. 安乐死与组织固定

  1. 静脉注射过量的戊巴比妥钠安乐死溶液（80–120 mg/kg）。
  2. 进行整块切除烧伤创面组织，包括下方的肌肉组织及周围未受伤的组织。
  3. 用10%中性缓冲甲醛固定组织。
    1. 将10 mL甲醛（37%）与90 mL磷酸盐缓冲液（PBS）混合，4 °C保存。
    2. 将组织转移至固定液中，并轻轻摇动容器，确保所有组织完全浸没于固定液内。固定液体积必须为组织体积的30倍。
    3. 在 4 ˚C 下固定组织过夜。
  4. 用乙醇脱水组织并包埋于石蜡块中。以下步骤在4 ˚C摇床中进行。
    1. 用 PBS 洗涤两次，每次 30 分钟。
    2. 用70%乙醇脱水8小时，80%乙醇过夜，95%乙醇脱水8小时，然后100%乙醇过夜。
    3. 将组织在100%乙醇中继续孵育8小时。
    4. 将组织在三份二甲苯中依次孵育，每份30分钟。
    5. 用新熔化的（52 °C）石蜡替换二甲苯，于52 °C烘箱中孵育1小时。
    6. 用新鲜石蜡替换原有石蜡，在52 °C的烘箱中孵育3小时，然后再次更换石蜡，并在52 °C下过夜孵育。
    7. 将组织分别用新鲜石蜡孵育两次，每次1小时，然后包埋组织并置于4 °C保存。
  5. 对石蜡包埋切片进行HE染色，然后观察 通过 一台配备100倍物镜的光学显微镜× 放大倍数.
    1. 使用旋转式切片机制作石蜡切片。
    2. 用二甲苯脱蜡，每次3分钟，共更换三次。
    3. 用100%、95%、80%和70%乙醇分别水化组织各3分钟，然后浸入蒸馏水中。
    4. 用苏木精染色10分钟，然后用流动的自来水冲洗。
    5. 用0.1%盐酸乙醇分化5分钟，然后用自来水冲洗。
    6. 用0.5%伊红染色1分钟。
    7. 用70%、80%、95%和100%乙醇分别脱水2分钟。
    8. 用二甲苯脱色，并在通风橱中干燥。

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结果

使用热铁造成30秒烧伤持续时间，产生的伤口呈圆形，边界清晰，颜色均匀苍白，周围伴有红斑环（图1D）。每只动物背部共有六个烧伤创面。烧伤创面的排列方式见图1K。创面完全覆盖含CAPS的敷料，用于评估烧伤后第0、7、21和42天的瘢痕形成深度以及再上皮化情况，再上皮化程度通过肉眼观察确定。根据肉眼观察，烧伤创面在烧伤后第42天完成再上皮化。在这些动物中，通过评估创面大小以确定创面愈合速率（图2A）。烧伤后第0、7、21和42天的创面面积分别为9、10、8和3 cm2。与烧伤第0天相比，烧伤第42天创面面积显著减小。愈合速率定义为从创面中心到创面边缘的最大平均距离除以创面完全闭合所需时间。使用含CAPS敷料处理的创面在烧伤后第42天达到73.43±6.33%的创面闭合率（图2B）。

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讨论

本研究建立了一种猪的重度烧伤模型，并使用含CAPS的敷料对该模型进行了评估。我们的结果表明，该猪烧伤模型可用于监测实验性敷料的临床性能，包括其抗菌特性。同时采用VSS评分、H&E染色和抗菌试验分析了伤口愈合速率、伤口闭合情况及抗菌活性。动物烧伤模型已被开发为研究烧伤损伤病理生理学的有力工具。使用大鼠作为实验对象具有一些生物学优势，例如存在大量针对大鼠的特异性试剂，以及在获取转基因大鼠方面的实用性，有助于揭示恢复过程中活跃的分子信号通路。然而，大鼠在动物烧伤模型中的主要缺点是其无法完全模拟人类的伤口愈合过程。在人类中，再上皮化是主要的愈合方式8，而大鼠的伤口愈合则主要依赖快速的伤口收缩9。此外，大鼠不易形成增生性瘢痕或瘢痕疙瘩，进一步证实其伤口修复过程与人类存在差异。相比之下，猪近年来受到研究人员的关注，因其皮肤结构与人类皮肤相似。此外，猪与人类的伤口愈合过程均经历生理上类似的阶段，包括炎症期、增殖期、再上皮化期和重塑期。通常情况下，猪的烧伤在21天内愈合，再上皮化发生在伤后7至14天之间10

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由台湾三军总医院；中国台湾国防医学院（TSGH-C107-042）；中国台湾科技部（MOST 106-2314-B-016 -014）；以及中国台湾国防医学院（MAB-106-055；MAB-106-010；MAB-107-064）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
<强>镇静：
氯胺酮Merial2528 ESP10 mL 小瓶
阿扎哌隆中国化学 &和药物47W406100 mL 小瓶
阿托品 东方化工厂IN1208021 mL 小瓶
<强>麻醉剂：
替来他明+唑拉西泮VirbacBC915 mL 小瓶
异氟烷巴克斯特N002A225100 mL 小瓶
<强>外科手术：
理发剪Moser--
聚维酮碘洗液Ever starHA1612024 L 桶
改良铁剂---
0.9% 生理盐水溶液CHI SHENGKC130500 mL 茄形瓶
纱布中国外科敷料中心MO1590008010 x 10 cm
CAPSCoreLeader Biotech Co., Ltd，中国台湾台北--
纸质胶带3MNDC-8333-1530-012.5 cm × 9.1 m
防水膜3MNDC-8333-1600-4010 cm × 10 m
粘性创可贴年轻的化学BH142601510 cm × 10 m
<强>解剖：
标准直头尖/钝剪刀（14 cm）一对Shinetec 仪器ST-S114-
Halstead-蚊子（12.5 厘米）Shinetec 仪器ST-H012-
手柄（#4）Shinetec 仪器ST-H004-
手术刀片（#21）Shinetec 仪器ST-B021-
<强>固定后处理 &和储存：
50 ml 塑料离心管 Falcon352070-
10% 中性缓冲福尔马林Leica3800604EG-
<强>细菌生长实验 
血琼脂平板（BAP）（含5%绵羊血的TSA） CMP-90 mm 单层

参考文献

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