方法文章

在啮齿类和人类组织中产生并按需启动急性痫性活动

8.6K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/57952

⸱

2019年1月19日

 ,  ,  , 
1Division of Fundamental Neurobiology, Krembil Research Institute, 2Institute of Medical Science, Faculty of Medicine, University of Toronto, 3Institute of Biomaterials and Biomedical Engineering, University of Toronto, 4Division of Neurosurgery, Department of Surgery, University of Toronto, 5Division of Neurology, Department of Medicine, University of Toronto, 6Department of Physiology, University of Toronto

本文内容

摘要

急性癫痫发作模型对于研究癫痫样事件的潜在机制具有重要意义。此外，能够按需诱导癫痫样事件的能力为研究其发生过程中事件的精确序列提供了一种高效的方法。本文中，我们描述了在小鼠和人类组织中建立的急性4-氨基吡啶皮层癫痫发作模型。

摘要

控制癫痫发作仍是医学界面临的一项挑战性难题。为了取得进展，研究人员需要一种能够广泛研究癫痫发作动态并探究其潜在机制的方法。急性癫痫模型使用便捷，可进行电生理记录，并能产生大量类似癫痫发作（痫性）的脑电事件。急性癫痫模型中获得的有希望的研究发现，可进一步推进至慢性癫痫模型和临床试验。因此，研究能够真实再现临床癫痫发作脑电特征和动态特性的急性模型中的癫痫发作，对于获得具有临床相关性的发现至关重要。使用人源组织制备的急性癫痫模型来研究痫性事件，同样对获得具有临床相关性的结果具有重要意义。本文的重点在于皮层4-AP模型，因其在体内（in vivo）和体外（in vitro）研究中，以及在小鼠和人源组织中均能灵活地诱导痫性事件。本文还将介绍一种使用无镁（Zero-Mg2+）模型诱导癫痫发作的替代方法，并详细概述不同急性癫痫模型所产生的类癫痫样活动的优势与局限性。此外，利用 commercially available 的光遗传学小鼠品系，可通过短暂（30 ms）的光脉冲触发与自发发作完全相同的痫性事件。类似地，向人源组织施加30–100 ms的神经递质（γ-氨基丁酸或谷氨酸）喷雾，也可触发与自发发作完全相同的痫性事件。在急性癫痫模型中按需触发痫性事件的能力，为观察癫痫起始动态背后的精确事件序列，以及高效评估潜在抗癫痫治疗手段提供了全新的可能。

引言

急性癫痫发作模型能够成功再现类似于癫痫患者脑电图（EEG）中观察到的痫性事件的电生理特征。研究人员将这些类痫性事件（本文中简称为“痫性事件”）作为癫痫发作事件的替代指标1。临床上，由于癫痫发作是一种起源于大脑的神经系统疾病，因此痫性事件可作为癫痫发作的可靠替代指标。在癫痫监测单元中，神经科医生依赖于痫性事件的检测，以确认大脑的致痫区域，并将其分离以便手术切除2。在重症监护病房中，医生通过监测痫性活动来评估镇静患者是否仍存在癫痫样电活动3。控制癫痫发作对医学界而言仍是一项挑战，因为30%的癫痫患者对现有药物具有耐药性4,5，而涉及药物诱发癫痫的病例中，有10%对标准治疗无反应3。这一问题对社会构成了严重关切，据估计，美国人口中有10%在其一生中将经历至少一次癫痫发作事件，其中3%预计将发展为癫痫6。

在慢性癫痫模型中研究癫痫发作成本高昂、费时费力，且通常需要数月时间进行准备7。此外，在自由活动的动物中进行电生理记录也十分困难。人类临床试验面临类似问题，同时还涉及受试者知情同意、参与者背景差异以及相关的道德和伦理考量等复杂因素8。相比之下，急性癫痫发作模型具有优势，因其制备相对简便、成本较低，并能够产生大量可供研究的痫性事件9。此外，脑组织被固定于稳定位置，为开展研究癫痫动态特征及相关基础病理生理机制所必需的电生理记录提供了理想条件。与in silico（计算机）模型相比，急性癫痫发作模型仍更具优势，因为其基于真实的生物组织，包含大脑固有的神经元网络及其全部内在因素和突触连接特性，而这些特性即使在最精细的计算机模型中也可能无法完全模拟10。这些特点使急性癫痫发作模型成为筛选潜在抗癫痫治疗手段以及在推进至慢性癫痫模型和临床试验前获取初步研究结果的高效工具。

通常，急性癫痫发作模型来源于正常脑组织，该组织被置于过度兴奋的条件下。为了在健康脑组织中诱导出具有临床相关性的痫性发作事件，重要的是要认识到大脑在临界状态下功能最为优化11 其中兴奋（E）与抑制（I）处于平衡状态12E-I 平衡的破坏可导致过度兴奋的癫痫发作状态，从而诱发痫性事件。因此，在此概念框架下，脑片中诱发痫性事件主要有两种策略体外）或全脑（体内) 制备：抑制作用减弱（"去抑制"）或兴奋性增强（"非去抑制"然而，痫性发作事件是高度有序且同步化的活动，需要GABA能中间神经元对神经网络活动进行协调。13,14因此，非去抑制模型是在分离的神经网络（如在体外）中诱发痫性放电事件最有效的方法 体外 脑切片15而 体外 去抑制模型通常会导致类似发作间期样尖峰的放电活动。此外，在此概念框架下，一次短暂的同步化事件也能可靠地触发发作事件。16事实上，任何施加于神经系统的微小扰动都可能诱发痫性发作事件。17 当其处于临界状态转变时（"分叉"点18传统上，这些扰动是通过电刺激诱导的。然而，神经科学领域近期发展的光遗传学技术，如今为诱导临界状态转换提供了更为精确的策略16.

本文所述方法展示了如何在急性癫痫发作模型中按需诱发痫性发作事件 体外 （第1步） 实验方案）和 体内 研究（步骤2的） 实验方案）。它们涉及脑区选择、癫痫发作诱导方法、研究类型和物种等因素；然而，本文将重点介绍推荐使用的急性4-AP皮层癫痫模型，因其在多种研究类型中具有广泛的适用性。该急性 体外 4-AP 癫痫发作模型基于标准方案，用于制备高质量脑片，以进行电生理记录和成像研究19这些方案已被用于制备 体外 小鼠体感运动皮层的冠状脑切片16,20 和人类21在这些类型的脑片中诱发痫样放电事件的改良方法此前已有报道。16 详细信息见于 实验方案 如下。急性 体内 4-AP 皮层癫痫模型基于用于成像研究的开颅手术标准操作流程22. 修改之处在于开颅后不安装（玻璃盖玻片）窗口，而是将致惊厥剂（4-AP）直接施加于暴露的大脑皮层，在动物处于全身麻醉状态下诱导痫性发作事件。据我们所知，本课题组是首个开发该急性模型的团队 体内 小鼠皮层癫痫发作模型16,23急性 体内 成年小鼠制备的4-AP皮层癫痫模型被开发用于补充 体外 来自幼年组织的脑片模型。在成年组织中对研究结果的重复验证 体内 癫痫模型通过解决二维脑片模型中非生理条件的固有问题，有助于将离体脑片研究的发现进行推广与 一个三维全脑结构）以及幼年与成年组织之间的生理差异。

通过使用皮升喷射器（picospritzer）递送神经递质或采用光遗传学策略，可实现按需诱发痫性事件。据我们所知，本课题组是首个利用皮升喷射器via神经递质在人类脑组织中诱发痫性事件的团队16。在光遗传学策略中，C57BL/6小鼠品系是表达外源基因的常规品系。在GABA能中间神经元或谷氨酸能锥体细胞中表达通道视紫红质-2（ChR2），可选择性地通过短时闪光脉冲按需诱发痫性事件。合适的光遗传学小鼠品系包括 commercially available C57BL/6变体，其分别利用小鼠囊泡GABA转运蛋白启动子（VGAT）24在中间神经元中，或利用小鼠胸腺细胞抗原1启动子（Thy1）25在锥体细胞中表达ChR2。这些 commercially available VGAT-ChR2和Thy1-ChR2小鼠品系可在新皮层中分别通过蓝光（470 nm）激活GABA能神经元或谷氨酸能神经元。在急性癫痫模型中实现按需生成痫性事件，为研究癫痫发作的起始动力学以及高效评估潜在抗癫痫疗法提供了新的机会。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

所有涉及患者的科研工作均在多伦多大学健康网络研究伦理委员会根据《赫尔辛基宣言》批准的方案下进行。涉及动物的实验程序均遵循加拿大动物护理委员会的指导方针，并经克伦比尔研究所动物护理委员会批准。

1. 方案一：急性模型 体外 癫痫模型

  1. 灌注液与人工脑脊液的制备
    1. 将超纯水（电阻率为18.2 MΩ·cm的过滤水）通入碳 dioxide 和氧气混合气体（即 Carbogen）进行饱和Ω·cm）通入碳合气（95% O₂，5% CO₂）2/5% CO₂2使用气石曝气器（水族箱用增氧器）通气 5 分钟。
      注：气石可连接至碳合气体罐的调节器 通过 标准硅胶管。若无气石，可将硅胶管末端密封，并在密封处戳若干小孔，使碳合气（carbogen）由此形成气泡通入溶液并完成碳合。
    2. 通过溶解溶质来配制解剖液 表1 在超纯水中。加入 CaCl2 加入已通入碳合气体至少5分钟的溶液中，以助其溶解。
      注意：或者，添加 CaCl2 首先，使其在未饱和溶液中易于溶解。该溶液在液态时应为300 - 320 mOsm/L，并在用碳合气饱和后pH值达到7.4。
      1. 将解剖液冷却至 0 - 4 °C. 将溶液在冰箱中放置过夜，或置于冷冻箱中1小时，并持续监测温度。
        注意：解剖液最多可保存3个晚上；之后应丢弃。
      2. 使用前将灌注液通入碳酰气5 - 10分钟。
        注意：理想情况下，该溶液在使用前应呈现为冰晶状或正处于向冰晶状转变的过程中。
    3. 通过溶解溶质来制备啮齿类动物人工脑脊液（ACSF） 表2 或 表3 在超纯水中配制人用ACSF。将ACSF溶液置于35℃水浴中，并同时通入碳合气饱和 °C 保存至使用。添加 CaCl2 加入已通入碳酰气至少5分钟以助其溶解的溶液中。
      注意：或者，添加 CaCl2 首先，使其在未饱和溶液中更易溶解。液体形式的溶液在用碳合气饱和后，渗透压应为290 - 320 mOsm/L，pH值为7.4。根据实验持续时间，可配制1、2或4 L体积的溶液；若进行一整天（8 h）的实验，则配制4 L。每日需新鲜配制人工脑脊液（ACSF），存放时间不得超过1天。
  2. 小鼠解剖以获取脑组织
    注意：对于人脑组织，直接进入下一步（步骤 1.3），使用振动切片机制备脑片。将组织切成边长约 1 cm 的立方体块3) 脑组织应由神经外科医生采用先前所述的方法获取26,27.
    1. 收集动物解剖所需的所有工具和材料。布置工作区，准备进行动物解剖。
      1. 检查碳合气体罐（95% O₂ + 5% CO₂）2/5%CO₂2) 以确保其不为空。若气瓶剩余压力低于 500 psi，应在实验前更换气瓶。
      2. 根据制造商的操作手册校准振动切片机（振动刀片组织切片机）。调节振动切片机的设置，使切割振幅为1 mm，切割速度为0.12 mm/s。
        注：每台振动组织切片刀的最优设置可能有所不同；但通常情况下，振幅应调高，切割速度应调低。
      3. 填充脑切片孵育室（即，脑片保存装置）中加入ACSF并用碳合气鼓泡。然后将孵育 chamber 置于设定为35℃的水浴中 °C.
        注意：啮齿类脑片使用啮齿类ACSF，人脑片使用人脑ACSF。
    2. 获取一只13天（p13）至21天（p21，其中p0为出生日）龄的幼年小鼠，性别不限。
    3. 用戊巴比妥钠（55 mg/kg 体重）进行腹腔注射麻醉小鼠。当小鼠深度麻醉后（表现为趾夹反射消失），立即使用 经兽医批准的断头器用于快速切断小鼠头部。
      注意：按照机构指南推荐的程序配制戊巴比妥钠注射液。
    4. 用手指固定小鼠的鼻部以稳定已断头的头部，从两眼之间开始沿头皮全长轻轻做一正中切口，以暴露颅骨。确保剃刀施加的压力不会压迫颅骨。使用剃刀边缘的角部以提高切割的精确度。
    5. 用手指撑开小鼠头皮的皮瓣，暴露颅骨。然后，使用刀片锋利的新边缘沿颅骨正中线做切口，注意避免与大脑皮层接触。
    6. 将解剖镊插入小鼠眼眶以固定断头，并将其置于盛有冷（0 - 4 ℃）人工脑脊液的培养皿中 °C）解剖液。确保头部完全浸没在解剖液中。
    7. 使用另一把尖头镊子轻轻剥离小鼠的头皮，撕下鼻骨，并移除颅骨后部（尾侧）。
      注意：幼鼠的鼻骨非常柔软，容易折断。
    8. 使用显微解剖刀切断视神经、三叉神经和脊髓。然后用显微解剖刀轻轻将脑组织从颅骨中分离。将脑组织完全浸没在盛有解剖液的培养皿中。
  3. 体感运动皮层脑片的制备
    1. 将约 150 mL 冷（0 - 4°C）的缓冲液加入振动切片机的缓冲液槽中°C）解剖液。
      注意：可选择将缓冲液托盘置于冰箱中直至使用，以在切片过程中保持低温。
    2. 将小鼠或人脑组织用速干胶粘附到振动切片机（切片机载物台/样品托盘）上。对于小鼠，切去脑组织尾端的一小部分即，小脑）以便将其平整地粘附在样品台上（使脑的头侧朝向天花板）。
      注意： alternatively，可通过将小鼠脑的背侧粘附于标本架上（脑的腹侧应朝向天花板）来制备水平脑切片28.
    3. 将样本架（含脑组织）轻轻放入缓冲托盘中，确保脑组织的背侧朝向振动切片机的刀片。
      注意：必须尽量减少脑组织暴露在空气中的时间。
  4. 脑组织切片与收集
    1. 将脑组织切成450 µm厚的切片 μ使用振动切片机沿背侧至腹侧方向切割厚度为 m 的脑片。切片过程中应确保脑组织完全固定于样品托盘上。
      1. 在小鼠脑中进行第一次切割以去除嗅球。随后继续进行切割，直至观察到体感-运动区（位于嗅球与前囟之间约中点处）。
        注意：可选步骤，将脑组织切成更薄的（200 μm) 切片直至在脑的冠状切面中出现胼胝体，这表明已接近体感-运动区。
    2. 使用宽口移液管收集冠状切片（450 μm）包含躯体感觉运动区，并将其浸入含有冷（0 - 4 ℃）人工脑脊液的培养皿中 °C）解剖液。
    3. 使用新的剃须刀片切除切片上的多余组织。对于小鼠的冠状切片，在新皮层联合下方进行一次横向切割。即，胼胝体）。不要用锯切动作；只需将刀片压入组织，并用精细刷轻轻分离组织。务必尽量减少冠状切片的移动。
    4. 使用宽口移液管将包含新皮层（第1-6层）的冠状切片背侧部分转移至第二个盛有温热（35℃）人工脑脊液的培养皿中 °C) ACSF 约 1 秒。随后立即将脑片转移至含有温热（35℃） °C）含碳合空气的ACSF。
      注意：将脑片转移至含有ACSF的培养皿中的目的是在使用宽口移液管转移脑片时，尽量减少灌注液随脑片被带入孵育 chamber。利用孵育 chamber 中的多个孔位，对不同的脑片进行有序存放。
    5. 根据机构指南丢弃剩余的脑组织和动物尸体。
  5. 孵育与维持
    1. 将脑片置于孵育 chamber 中，液面略低于组织，35 ℃ 下孵育 °C下孵育30分钟。然后，将孵育 chamber 从水浴中取出，使其恢复至室温（20 - 25 °C). 在进行电生理记录之前，等待脑片恢复1 h。
      注意：确保孵育室中脑片下方无气泡积聚。气泡会形成气液界面，导致组织损伤。小鼠脑片可在充分碳合的孵育室中用适当的人工脑脊液（ACSF）保存6 - 8小时，而人脑组织则可保存长达24小时。
  6. 大脑皮层浅层的电生理记录
    注意：脑片的细胞外局部场电位（LFP）记录中可观察到痫性发作事件。脑片的LFP可通过界面型记录舱29 或浸没式多电极阵列（MEA）系统16该操作步骤此前已有描述16 以及更多详细信息如下所述。
    1. 使用宽口移液管或精细画笔将脑片转移至稍大的预先裁剪好的滤纸片上，滤纸片用齿科镊子固定。将载有脑片的滤纸片转移至记录室，并用网格固定器（harp screen）将其固定。
    2. 运行温热（35 °C），以3 mL/min（约1滴/秒）的流速将含碳合气的ACSF灌流液通过记录室中的脑片。使用数字温度计确保记录室温度维持在33 - 36°C.
    3. 使用拉制仪制备阻抗为 1 - 3 MΩ 的玻璃电极‎Ω 使用拉制仪从硼硅酸盐玻璃管（外径为1.5 mm）中拉制玻璃电极，并用人工脑脊液（ACSF）进行后向填充（约10 μL） µ使用 Hamilton 注射器进行操作。如果电极尖端损坏，请立即丢弃。
      注意：将银丝用漂白剂处理（5 分钟），仅暴露极小部分（即将银丝的尖端浸入盛有ACSF的玻璃电极中，以尽量减少记录过程中的噪声和漂移。如有必要，使用汉密尔顿注射器移除玻璃电极中多余的ACSF。
    4. 使用20倍体视显微镜，借助手动操作器将记录用玻璃电极准确引导至皮质浅层（第2/3层）。通过标准软件在计算机上记录/观察脑片的电活动。
      注意：存活良好（高质量）的脑片在施加电刺激（100）时会表现出明显的诱发电位 µ秒，30 - 300 μA）或光脉冲（30 ms，10 mW/mm²）2用于光遗传学组织。
  7. 诱导类 seizure 活动
    1. 灌流含有100的ACSF µM 4-氨基吡啶（4-AP）加入脑切片中。将80 mg 4-AP溶于8.5 mL水中，配制成100 mM的4-AP储存液。加入100 µ将 100 mM 4-AP 储备溶液 100 μL 加入 100 mL ACSF 中，以配制含 100 μM 4-AP 的 ACSF 灌流液 µM 4-AP
      注意：也可使用 Zero-Mg²⁺ 模型2+ 人工脑脊液（ACSF）表4），一种不含添加 Mg 的改良 ACSF 溶液2+，用于灌注脑切片。对于人类组织，使用100 µM 4-AP 在无镁溶液中2+ 人源ACSF（人工脑脊液）表5）以获得最佳效果。癫痫样放电事件出现的平均时间为15分钟；然而，某些脑片可能需要长达40分钟。
  8. 按需诱发癫痫发作：光遗传学小鼠的光遗传学策略
    1. 施加短暂的（30 ms）蓝色（470 nm）光脉冲（最小功率为1 mW/mm²）2 输出强度）以诱发痫性事件。使用手动操作器将1,000 µ直径为 m 的光学纤维（数值孔径 0.39），置于记录区域正上方。
      注：将光刺激的频率设置为与期望的痫样事件发生频率相匹配（即，每50秒1次脉冲）。然而，该频率不能过度偏离痫性事件固有的发生频率。
  9. 按需诱发癫痫发作：一种适用于人类组织的非光遗传学策略
    1. 将脑片放置于记录室中，使浅层朝向灌流液流入方向上游，深层朝向灌流液流动方向下游。
    2. 用与局部场电位记录相同的玻璃电极，将其拉制成电极尖端，并用精细擦拭纸轻轻触碰尖端以形成微小开口。用约25 μL的溶液反向填充电极 µ100 mM GABA（溶于水）的 L 型溶液，并将其连接至皮升注射器。或者，用 200 µM 谷氨酸（溶于水）
      注意：为了估算从皮升喷射器喷出的体积（约50 µL），将测试气流喷射到塑料板上（最好带有网格）。然后，滴加已知体积的液滴（即, 10 µL, 20 µL, 50 µ升，或100 µL）用移液管进行吹注，以与测试吹注进行比较。
    3. 使用皮升喷射器（10–20 psi，持续30–100 ms）向人类脑组织施加神经递质（GABA或谷氨酸）的喷射以诱发痫样事件。向脑组织深层（第5层）施加一次100 mM GABA的喷射，可在浅层（第2/3层）诱导产生痫样事件。或者，施加一次200 µ将 M 谷氨酸直接施加到浅层以在浅层诱发痫样事件。
      注：设置微量喷射器喷射速率，以匹配期望的痫样事件发生频率（即，每50秒1次脉冲）。然而，该频率不能过度偏离痫样事件固有的发生频率。

2. 方案 II：急性 体内 癫痫发作模型

  1. 手术准备与手术操作
    1. 获取一只成年小鼠（p35 - p60），性别不限。
    2. 用氯胺酮（95 mg/kg）和赛拉嗪（5 mg/kg）深度麻醉小鼠。进行足趾夹捏反射测试以确认小鼠已充分镇静。 alternatively，可使用异氟烷（诱导浓度4%，手术维持浓度1.5 - 2%）进行麻醉。
      注意：麻醉剂的选择可能影响癫痫样活动30,31.
    3. 将小鼠固定于立体定位仪中，用耳杆固定其头部。手术期间在小鼠下方放置加热垫。
    4. 使用啮齿类动物修剪器剃除小鼠头部顶部的毛发，以暴露头皮。用25 G 5/8英寸针头向骨膜注射0.3 mL利多卡因，以避免过度出血或疼痛。在小鼠眼睛上涂抹眼膏，防止实验过程中眼睛干涩。
    5. 捏住并提起小鼠头皮中心，以评估其反射是否消失。随后，作一水平切口，暴露颅骨的前囟至后囟区域。用棉签轻轻刮擦整个暴露的颅骨表面，使其干燥。
    6. 在距外侧-内侧2.0 mm、前-后-2.0 mm处进行直径为4 mm的颅骨开窗，以暴露体感皮层。使用永久性记号笔绘制一个直径4 mm的圆圈标记位置。使用气动牙科钻沿圆圈钻孔，直至颅骨开窗处残留的骨层在轻压下易于塌陷。在用碎骨钳移除颅骨开窗前，先向骨层表面滴加生理盐水。随后，将温热的生理盐水滴加至暴露的脑区。
  2. 记录方法与化学诱导癫痫发作
    1. 使用拉制仪制备阻抗为 1 - 3 MΩ 的玻璃电极‎Ω 使用拉制仪从硼硅酸盐玻璃管（外径 1.5 mm）拉制玻璃电极，并用约 10 μL 的溶液反向灌注电极 µ使用 Hamilton 注射器将 ACSF 或生理盐水注入 L。若电极尖端受损，应立即丢弃。
      注意：将银丝漂白（5分钟），仅暴露极小部分（即，将银丝的尖端浸入盛有ACSF的玻璃电极中，以尽量减少记录过程中的噪声和漂移。如有必要，使用汉密尔顿注射器移除玻璃电极中多余的ACSF。
    2. 使用手动操纵器将玻璃电极引导至体感运动区的浅层皮质（第2/3层）。利用标准软件在计算机上记录/观察脑片的电活动。
      注：第2/3层距表面约0.3 mm深32.
    3. 用注射器将约0.5 mL的1.5 mM 4-AP生理盐水滴加至小鼠暴露的皮层表面，直至完全覆盖颅骨开窗区域。将14 mg的4-AP溶解于100 mL等渗生理盐水中，配制1.5 mM 4-AP生理盐水储备液。
      注意：在实验开始前配制4-AP人工脑脊液。通常在局部应用后15–30分钟出现痫样放电事件。
  3. 光遗传学小鼠中癫痫发作的按需诱导
    1. 施加短暂的（30 ms）蓝色（470 nm）光脉冲（最小功率为10 mW/mm²）2 输出强度）以诱发痫性事件。使用手动操作器将1,000 µ直径为 m 的光学纤维（数值孔径 0.39）置于记录区域正上方。
      注意：将光刺激的频率设置为与期望的痫性事件发生频率相匹配（即，每300秒1次脉冲）。然而，该频率不能过度高于痫样事件固有的发生频率。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

应用 100 µM 4-AP 至高质量（无损伤） 450 µm来自幼年VGAT-ChR2小鼠的大脑皮层脑片可靠地诱导出复发性痫性发作事件（> 5 秒）内，在 15 分钟内（图 1Ai）。应用 100 µM 4-AP 作用于质量较差的脑片时，引发爆发性事件或簇状放电活动（图1Aii）。平均而言，每只解剖小鼠脑组织获得的脑片中有40%能够成功诱发痫性发作事件。此外，在30只被解剖的小鼠中，有83%（25/30）的小鼠至少有一片脑片成功诱发了痫性发作事件。在可自发产生痫性发作事件的脑片中，对脑片施加一次短暂的30 ms光脉冲可稳定地触发一次与自发事件形态完全相同的痫性发作图 1Aiii 和 1Aiv）。在 Thy1-ChR2 小鼠的脑切片中也获得了相同的结果（图1B）。因此，无论哪一类神经元亚群被激活，...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

脑片需用促惊厥药物或成分改变的人工脑脊液（ACSF）灌注，以提高神经网络的兴奋性，并促进痫样事件（电生理记录中的癫痫样事件）的发生。对于小鼠，首选包含躯体感觉-运动区的冠状切面，应包括扣带皮层第2区（CG），但不包含后顶叶皮层区（RS）；这些解剖标志有助于确定最适合诱发痫样事件的冠状切片范围。针对小鼠组织的一种可选处理方法是将脑片的两个半球各自切成两半，用于配对实验设计，因为两个半球在结构上几乎完全相同（即相似的实验单元）。在制备用于诱发痫样事件的脑片时，必须保持神经网络及其突触连接的完整性，因为痫样事件本质上是一种神经网络现象。在方案步骤1中，有三个对脑片质量至关重要的环节：1）切片过程，2）孵育，以及3）供氧。首先，切片过程需要在速度与技术之间取得平衡。必须尽量缩短断头（或手术切除）与开始孵育之间的时间，同时在操作脑片时需格外小心每一次接触和移动，以避免损伤。其次，组织质量对孵育温度和时间非常敏感。必须使用计时器和温度计，确保孵育条件为35 °C、持续30分钟。第三，脑组织的存活能力对是否暴露于充分氧合的（人工）脑脊液之外极为敏感。若脑片长时间（约1分钟）未用含碳合气的ACSF灌注，将导致组织死亡。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作得到了加拿大卫生研究院（Peter L. Carlen 和 Taufik A. Valiante 获资助号 MOP 119603）、安大略脑研究所（Taufik A. Valiante 获资助）以及Mightex学生研究基金（Michael Chang 获资助）的支持。我们感谢 Liam Long 在拍摄本视频稿件过程中提供的协助。我们谨向 Paria Baharikhoob、Abeeshan Selvabaskaran 和 Shadini Dematagoda 致谢，感谢他们在整理本文稿件中的图表方面所提供的帮助。图1A、图3A、图4A 和 图6A 均为根据 Chang 等16 发表的数据制作的原创图表。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
戊巴比妥钠N/AN/A通过多伦多西部医院供应商购买
1 mm 注射器N/AN/A通过 UT 医疗商店购买
25G 5/8” 无菌针头N/AN/A通过 UT 医疗商店购买
单刃剃须刀片（2个）N/AN/A通过 UT 医疗商店购买
速干胶水N/AN/A通过 UT 医疗商店购买
镜头纸N/AN/A通过 UT 医疗商店购买
玻璃培养皿（2个）N/AN/A通过 UT 医疗商店购买
细小镊子（2个）N/AN/A通过 UT 医疗商店购买
PVC 手柄微型刮勺N/AN/A通过 UT 医疗商店购买
平头微型小勺N/AN/A通过 UT 医疗商店购买
5/0 细节画笔N/AN/A从一家精品艺术商店购买
宽口移液管N/AN/A通过 UT 医疗商店购买
牙科镊子N/AN/A通过 UT 医疗商店购买
温度计（数字式）N/AN/A在 Amazon.ca 上购买
检查碳合气罐（95%O2/5%CO2) N/AN/A通过多伦多西部医院供应商购买
振动切片机LeicaN/A通过多伦多西部医院供应商购买
脑片孵育室（又称脑片保存装置） Scientific Systems Design IncN/A
氯化钠（NaCl）N/AN/A通过 UT 医疗商店购买
碳酸氢钠N/AN/A通过 UT 医疗商店购买
右旋糖N/AN/A通过 UT 医疗商店购买
氯化钾（KCl）N/AN/A通过 UT 医疗商店购买
硫酸镁（MgSO4·H2O）N/AN/A通过 UT 医疗商店购买
一水合磷酸二氢钠（HNaPO4·H2O）N/AN/A通过 UT 医疗商店购买
氯化钙（CaCl2·2H2O）N/AN/A通过 UT 医疗商店购买
蔗糖N/AN/A通过 UT 医疗商店购买

参考文献

  1. Jefferys, J. G. R. Advances in understanding basic mechanisms of epilepsy and seizures. Seizure. 19 (10), 638-646 (2010).
  2. Fujiwara, H., et al. Resection of ictal high-frequency oscillations leads to favorable surgical outcome in pediatric epilepsy. Epilepsia. 53 (9), 1607-1617 (2012).
  3. Chen, H. Y., Albertson, T. E., Olson, K. R. Treatment of drug-induced seizures. British Journal of Clinical Pharmacology. 81 (3), 412-419 (2015).
  4. Kwan, P., Brodie, M. J. Early Identification of Refractory Epilepsy. New England Journal of Medicine. 342 (5), 314-319 (2000).
  5. Giussani, G., et al. A population-based study of active and drug-resistant epilepsies in Northern Italy. Epilepsy & Behavior. 55, 30-37 (2016).
  6. Pellock, J. M. Overview: definitions and classifications of seizure emergencies. Journal of Child Neurology. 22 (5_suppl), 9S-13S (2007).
  7. Löscher, W. Critical review of current animal models of seizures and epilepsy used in the discovery and development of new antiepileptic drugs. Seizure. 20 (5), 359-368 (2011).
  8. Jones, R. S., da Silva, A. B., Whittaker, R. G., Woodhall, G. L., Cunningham, M. O. Human brain slices for epilepsy research: Pitfalls, solutions and future challenges. Journal of Neuroscience Methods. 260, 221-232 (2016).
  9. Castel-Branco, M., Alves, G., Figueiredo, I., Falcão, A., Caramona, M. The maximal electroshock seizure (MES) model in the preclinical assessment of potential new antiepileptic drugs. Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology. 31 (2), 101-106 (2009).
  10. Wendling, F., Bartolomei, F., Modolo, J. Neocortical/Thalamic In Silico Models of Seizures and Epilepsy. Models of Seizures and Epilepsy. Pitkänen, A., Buckmaster, P., Galanopoulou, A. S., Moshé, S. , Academic Press. London, San Diego (CA), Cambridge (MA), Oxford. 233-246 (2017).
  11. Cocchi, L., Gollo, L. L., Zalesky, A., Breakspear, M. Criticality in the brain: A synthesis of neurobiology, models and cognition. Progress in Neurobiology. 158, 132-152 (2017).
  12. Xue, M., Atallah, B. V., Scanziani, M. Equalizing excitation-inhibition ratios across visual cortical neurons. Nature. 511 (7511), 596-600 (2014).
  13. Engel, J. Seizures and epilepsy. , Oxford University Press. Oxford, UK. (2013).
  14. Panuccio, G., Curia, G., Colosimo, A., Cruccu, G., Avoli, M. Epileptiform synchronization in the cingulate cortex. Epilepsia. 50 (3), 521-536 (2009).
  15. Avoli, M., de Curtis, M. GABAergic synchronization in the limbic system and its role in the generation of epileptiform activity. Progress in Neurobiology. 95 (2), 104-132 (2011).
  16. Chang, M., et al. Brief activation of GABAergic interneurons initiates the transition to ictal events through post-inhibitory rebound excitation. Neurobiology of Disease. 109, 102-116 (2018).
  17. Jiruska, P., et al. High-frequency network activity, global increase in neuronal activity, and synchrony expansion precede epileptic seizures in vitro. The Journal of Neuroscience. 30 (16), 5690-5701 (2010).
  18. Jirsa, V. K., Stacey, W. C., Quilichini, P. P., Ivanov, A. I., Bernard, C. On the nature of seizure dynamics. Brain. 137 (Pt 8), 2210-2230 (2014).
  19. Colbert, C. M. Preparation of cortical brain slices for electrophysiological recording. Ion Channels: Methods and Protocols. 337, 117-125 (2006).
  20. Li, H., Prince, D. A. Synaptic activity in chronically injured, epileptogenic sensory-motor neocortex. Journal of Neurophysiology. 88 (1), 2-12 (2002).
  21. Köhling, R., Avoli, M. Methodological approaches to exploring epileptic disorders in the human brain in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 155 (1), 1-19 (2006).
  22. Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging. Journal of Visualized Experiments. (12), e680(2008).
  23. Ritter, L. M., et al. WONOEP appraisal: optogenetic tools to suppress seizures and explore the mechanisms of epileptogenesis. Epilepsia. 55 (11), 1693-1702 (2014).
  24. Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nature Methods. 8 (9), 745-752 (2011).
  25. Arenkiel, B. R., et al. In vivo light-induced activation of neural circuitry in transgenic mice expressing channelrhodopsin-2. Neuron. 54 (2), 205-218 (2007).
  26. Heinemann, U., et al. Brain slices from human resected tissue. Models of Seizures and Epilepsy. Pitkänen, A., Buckmaster, P., Galanopoulou, A. S., Moshé, S. , Academic Press. London, San Diego (CA), Cambridge (MA), Oxford. 285-299 (2017).
  27. Florez, C., et al. In vitro recordings of human neocortical oscillations. Cerebral Cortex. 25 (3), 578-597 (2015).
  28. Lein, P. J., Barnhart, C. D., Pessah, I. N. Acute hippocampal slice preparation and hippocampal slice cultures. Methods in Molecular Biology. , 115-134 (2011).
  29. Haas, H. L., Schaerer, B., Vosmansky, M. A simple perfusion chamber for the study of nervous tissue slices in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 1 (4), 323-325 (1979).
  30. Poulton, T. J., Ellingson, R. J. Seizure associated with induction of anesthesia with isoflurane. Anesthesiology: The Journal of the American Society of Anesthesiologists. 61 (4), 471-476 (1984).
  31. Borris, D. J., Bertram, E. H., Kapur, J. Ketamine controls prolonged status epilepticus. Epilepsy Research. 42 (2-3), 117-122 (2000).
  32. DeFelipe, J., Alonso-Nanclares, L., Arellano, J. I. Microstructure of the neocortex: comparative aspects. Journal of Neurocytology. 31 (3-5), 299-316 (2002).
  33. Velasco, A. L., Wilson, C. L., Babb, T. L., Engel, J. Functional and anatomic correlates of two frequently observed temporal lobe seizure-onset patterns. Neural Plasticity. 7 (1-2), 49-63 (2000).
  34. Vlachos, A., Reddy-Alla, S., Papadopoulos, T., Deller, T., Betz, H. Homeostatic regulation of gephyrin scaffolds and synaptic strength at mature hippocampal GABAergic postsynapses. Cerebral Cortex. 23 (11), 2700-2711 (2012).
  35. Kirmse, K., et al. GABA depolarizes immature neurons and inhibits network activity in the neonatal neocortex in vivo. Nature Communications. 6, 7750(2015).
  36. Stein, V., Hermans-Borgmeyer, I., Jentsch, T. J., Hübner, C. A. Expression of the KCl cotransporter KCC2 parallels neuronal maturation and the emergence of low intracellular chloride. Journal of Comparative Neurology. 468 (1), 57-64 (2004).
  37. Wong, B. Y., Prince, D. A. The lateral spread of ictal discharges in neocortical brain slices. Epilepsy Research. 7 (1), 29-39 (1990).
  38. Trevelyan, A. J., Sussillo, D., Watson, B. O., Yuste, R. Modular propagation of epileptiform activity: evidence for an inhibitory veto in neocortex. Journal of Neuroscience. 26 (48), 12447-12455 (2006).
  39. Brahma, B., Forman, R., Stewart, E., Nicholson, C., Rice, M. Ascorbate inhibits edema in brain slices. Journal of Neurochemistry. 74 (3), 1263-1270 (2000).
  40. MacGregor, D. G., Chesler, M., Rice, M. E. HEPES prevents edema in rat brain slices. Neuroscience Letters. 303 (3), 141-144 (2001).
  41. Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute brain slice methods for adult and aging animals: Application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Patch-clamp Methods and Protocols. Martina, M., Taverna, S. , Humana Press. New York, NY. 221-242 (2014).
  42. Swartzwelder, H. S., Lewis, D., Anderson, W., Wilson, W. Seizure-like events in brain slices: suppression by interictal activity. Brain Research. 410 (2), 362-366 (1987).
  43. Lees, G., Stöhr, T., Errington, A. C. Stereoselective effects of the novel anticonvulsant lacosamide against 4-AP induced epileptiform activity in rat visual cortex in vitro. Neuropharmacology. 50 (1), 98-110 (2006).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

4 AP

相关文章