一种用于测定生物体温度偏好的温度梯度实验方法 果蝇 幼虫

摘要

在此，我们介绍一种用于测定生物体偏好环境温度的实验方案。 果蝇 使用连续温度梯度对幼虫进行处理。

摘要

许多动物，包括果蝇， 黑腹果蝇能够区分细微差异 环境温度，使它们能够寻找偏好的温度环境。为了确定幼虫在特定线性温度范围内的温度偏好，我们开发了一种利用温度梯度的检测方法。为建立单向温度梯度，将两个铝块分别连接至独立的水浴装置，各自控制相应铝块的温度，这两个铝块设定了梯度的低温端和高温端。通过将一块涂有琼脂糖的铝板放置在两个由水浴控温的铝块上，使铝板跨越两者之间的距离，从而形成温度梯度。铝板与水浴铝块接触的两端分别定义为最低和最高温度，两铝块之间的区域则形成线性温度梯度。该梯度检测方法可用于 不同日龄的幼虫均可使用，可用于鉴定表现出表型的突变体，例如影响编码TRP通道和视蛋白基因的突变体，这些基因对于温度分辨至关重要。

引言

趋热性被运动性动物用来选择具有最有利条件的环境^1,2,3如果气候过于炎热或寒冷，这种行为对生存至关重要。此外，许多动物对舒适温度范围内的微小温差十分敏感，并会主动寻找温度适宜的环境。这对于果蝇等变温生物尤为重要，因为它们的体温会与环境温度趋于一致。用于监测幼虫趋温性的实验方法，在鉴定和阐明分子感受器（如果蝇中的某些温度感应蛋白）的功能方面发挥了关键作用。 果蝇 瞬时受体电位（TRP）通道^4,5,6，视紫红质^7,8和离子型受体（IRs）⁹，使这些动物在不同温度范围内具有温度敏感性。

双选择实验为研究幼虫的温度偏好提供了一种方法^6,7该检测需要建立两个不同的温度区，并允许 动物选择一侧而非另一侧。双向选择实验的结果通常较为可靠，尤其是当两个选项之间的温度差异较大时 较大。此外，由于每个实验仅涉及两个组别的统计，数据可用简单的偏好指数表示。双向选择实验操作简便，也适用于遗传筛选。然而，其主要局限在于需要进行大量实验才能确定野生型或突变型动物的偏好温度。

梯度实验可在单次检测中确定生物的偏好温度⁸。此外，与双选实验不同，梯度实验允许评估一组动物在面对连续温度范围时的分布情况。一种梯度实验采用培养皿和单个动物，适用于详细表征个体动物的行为特征¹⁰。然而，由于培养皿为圆形，不同温度区域的面积随距中心距离的增加而逐渐减小。因此，该装置不适合监测动物群体的温度选择行为。

一种适用于评估幼虫群体温度偏好的连续热梯度装置，采用矩形实验区域，本文对此进行了描述。该装置结构简单，易于构建和组装。此外，该热梯度呈线性，且具有灵活性，可用于在10 °C至42 °C的宽温度范围内研究趋热性。该检测方法快速、操作简便，并能产生可重复的数据。除了可报告幼虫偏好的温度外，单次实验即可揭示整个线性温度范围内动物群体的偏好分布。由于具备上述优点，该装置是鉴定趋热性相关基因的理想选择。

方案

1. 梯度实验的设备制备与组装装置

1. 制备用于单向梯度实验的铝制实验板。
   1. 使用带锯和锋利的立式铣床，将每块铝制实验板（图1A）从一整块铝材上切割并打磨而成，尺寸如下：外部尺寸为140 × 100 × 9 mm，内部尺寸为130 × 90 × 8 mm（图1B）。用黑色涂料对每块实验板内表面进行阳极氧化处理，以便更清晰地观察幼虫并防止生锈。
      注：单向梯度用铝制实验板的加工由机加工车间完成。阳极氧化处理由商业供应商完成。
   2. 使用永久性记号笔在每块实验板的上边缘和下边缘标记13个刻度线，每条线间隔10 mm。第一条和最后一条刻度线应距离实验板内边缘5 mm（图1A、B）。
2. 为制备双向梯度用的铝制实验板，使用剪板机将铝板裁剪成以下尺寸：250 × 220 × 2 mm。用黑色涂料对实验板进行阳极氧化处理。
   注：双向梯度用铝制实验板的加工由机加工车间完成。阳极氧化处理由商业供应商完成。
3. 制备铝块。
   注：单向梯度实验需要两个铝块，双向梯度实验需要三个铝块。
   1. 使用带锯从一整块铝材上切割出铝块（图1C），尺寸为50 × 255 × 14 mm（图1C、D）。
   2. 使用立式铣床在铝块内部钻出直径为7 mm的水道，并在一侧的开口端加工螺纹槽（图1D）。用螺栓和螺纹密封带封闭带螺纹的孔，形成U形水道（图1C、D）。
      注：铝制实验块的加工由机加工车间完成。
   3. 在一端使用螺纹和螺纹密封带将连接器固定在铝块中（图1D）。另一端安装多个接头，插入硅胶管（内径1/4"，外径3/8"，壁厚1/16"）。
4. 准备两台制冷/加热循环水浴。
5. 组装用于梯度实验系统的温控铝块。
   1. 对于单向梯度实验，将两个铝块分别连接至两个独立的水浴，使每个铝块的温度由独立的水循环系统控制（图2A）。使用硅胶管（内径1/4"，外径3/8"，壁厚1/16"）将水浴的出口连接至铝块内侧的连接器（图2A），并用管道将铝块外侧的连接器连接至水浴的入口。
   2. 对于双向梯度实验，将三个铝块中的两个置于实验板的左侧和右侧下方，并通过管道连接至同一水浴（图2B）。将第三个铝块连接至第二台水浴，并置于实验板中心下方（图2B）。
      注：仅当幼虫在单向梯度实验中聚集于某一侧边缘区域时，才需要使用该装置和实验方法。若出现此情况，必须评估是否存在边缘效应。为验证这一可能性，应建立一个双向梯度，使幼虫在单向梯度实验中偏好的边缘区域温度（例如18 °C）成为双向梯度实验板中央区域的温度（图3E、F）。

2. 幼虫同步化

1. 为产卵用途饲养果蝇。
   1. 将酵母颗粒与蒸馏水用研杵混合制成酵母糊。充分研磨并搅拌，直至糊状物的稠度类似于 花生酱。避免使用过于干燥的酱料，否则在将果蝇转移至新试管时容易碎裂脱落；也要避免过湿的酱料，以免困住果蝇。
   2. 使用研杵将酵母糊沿标准管内壁加入 果蝇 小瓶，位于食物表面正上方。
   3. 计数12-35只雌性果蝇以及不超过其半数（但不超过10只）的雄性果蝇，置于CO₂麻醉下₂ 将雌性和雄性分别加入每个含有酵母糊的离心管中。
   4. 为了在果蝇取食期间保持培养瓶中酵母糊的湿润，将这些培养瓶与最多20个仅装有蒸馏水的开口培养瓶一同放入可容纳最多100个培养瓶的托盘中。将托盘放入透明塑料袋并密封。
   5. 将托盘置于25 °C培养箱中孵育48 h，以充分滋养雌虫，使其能够产下大量卵。
2. 准备产卵用的小管。
   1. 将培养好的果蝇通过轻敲转移到新的食物小瓶中用于收集卵。不要使用 CO_2, 这可能导致果蝇在接下来的短时间内产卵数量减少。
      注意：标准 果蝇 食物小瓶是 不使用酵母膏进行卵收集。
   2. 让果蝇在25 °C下产卵3小时，以便在相对较窄的时间窗口内收集所有卵。
      注意：这将使幼虫处于相同的发育阶段，实现同步化。
   3. 将装有卵的试管放入含有水试管的托盘中，并扎紧袋口。在25 °C、12小时光照:12小时黑暗的循环条件下培养。
   4. 根据所需幼虫阶段，在产卵后经过特定小时数进行培养（AEL）。
      注意： 表1 是AEL小时数与幼虫阶段之间关系的估算，该关系会因果蝇品系、所用食物和培养温度的不同而有所变化 等等。 AEL 与发育阶段之间的精确关系需由研究人员根据口钩和气门的形态等形态学特征进行验证¹¹.

3. 温度梯度设置

1. 制备单向梯度
   1. 为在实验过程中创建湿润的环境，将连接至两个水浴的两块铝块放置在湿润的纸巾上，两者相距 10 cm（图 2A）。
   2. 在开始实验前约 2 小时开启两个水浴，以确保铝块温度充分平衡。
      注意：建议先进行一次模拟实验，以确定每个水浴所需的温度，从而实现理想的线性温度梯度。一些典型的水浴温度设置组合列于表 2中。但需注意，铝块表面温度会受到环境温度的影响。此外，由于管道中存在冷却效应，管道长度也会影响温度。本实验装置中管道长度为 1.5 m。
   3. 将 100 mL 的 1% 琼脂糖置于 500 mL 圆口广口瓶中，使用高功率微波加热，然后在水平实验台上每块实验平板倾注 25 mL。准备两块实验平板，以便可同时放置于铝块上（图 2A）。
   4. 待琼脂糖凝固后（10–20 分钟），用标准厨房海绵或密胺海绵轻轻擦拭每块琼脂糖表面，使其略显粗糙，以便喷水时在琼脂糖凝胶表面形成一层光滑的薄水膜，而不会形成水滴。
   5. 在实验开始前，将平板完全浸没于盛有蒸馏水的容器中，以防止平板干燥。
2. 制备双向梯度（可选）
   1. 为在实验过程中创建湿润的环境，将三块铝块以 8 cm 间距放置在湿润的纸巾上（图 2B）。
   2. 在开始实验前约 2 小时开启两个水浴，以确保铝块温度充分平衡。
      注意：建议先进行一次模拟实验，以确定双向梯度所需的各水浴温度。一些典型的水浴温度设置组合列于表 3中。但需注意，铝块表面温度会受到环境温度的影响。此外，由于管道中存在冷却效应，管道长度也会影响温度。本实验装置中管道长度为 1.5 m。
   3. 为防止琼脂糖溢出平板，使用标签胶带包裹铝板边缘，形成一个高 10 mm 的围挡（图 2B）。
   4. 将 200 mL 的 1% 琼脂糖置于 500 mL 圆口广口瓶中，使用高功率微波加热，然后在一块实验平板上倾注 120 mL。
   5. 待琼脂糖凝固后（约 30 分钟），用标准厨房海绵或密胺海绵轻轻擦拭每块琼脂糖表面，使其略显粗糙，以便喷水时在琼脂糖凝胶表面形成一层光滑的薄水膜，而不会形成水滴。
   6. 在实验开始前，将实验平板完全浸没于盛有蒸馏水的容器中，以防止其干燥。
3. 设置单向梯度
   1. 在梯度实验装置旁的实验台上准备好试剂和物品（参见材料表）。
   2. 为促进高效的热传导，在铝块与实验平板之间的界面处喷水，以填充任何缝隙。
   3. 佩戴手套将实验平板从盛水容器中取出。若水渗入琼脂糖凝胶与平板之间并导致表面鼓起，应使用 P1000 微量移液器将水吸除。
   4. 将实验平板放置于铝块上，使平板边缘向内 2 cm 处的标记线与铝块边缘完全对齐（图 2A、C）。
   5. 向平板表面喷水（覆盖琼脂糖表面的一层薄水膜即可），以防止琼脂糖凝胶干燥。确保水膜连续且无水滴，因为幼虫可能被困在水滴中。
   6. 用纸板箱覆盖梯度系统，以减少水分蒸发并帮助稳定凝胶表面温度。静置 5–10 分钟，使温度达到平衡。
   7. 在平板上 12 个位置检测表面温度（图 2C）。在每个区域进行两次测量，以判断区域内是否存在温度差异。确保两个测量点的温度均在目标温度的 ± 0.2 °C 范围内。
      注意：区域内的温度差异通常是因为两个测量点到铝块边缘的精确距离不一致所致。调整平板在铝块上的位置，确保平板边缘向内 2 cm 处的标记线与铝块边缘完全对齐。
   8. 若实测温度梯度与目标梯度存在偏差，可升高或降低水浴温度设定值，并在水浴温度稳定后重新检测表面温度。
   9. 在开始实验前，用纸板箱覆盖梯度系统。
4. 设置双向梯度（可选）
   1. 在梯度实验装置旁的实验台上准备好试剂和物品（参见材料表）。
   2. 向三块铝块表面喷水，以填充表面之间的缝隙，促进铝块向实验平板高效传热。
   3. 小心地将实验平板从盛水容器中取出，并放置于铝块上。若水渗入琼脂糖凝胶与平板之间并可能导致表面鼓起，应使用 P1000 微量移液器将水吸除。
   4. 将实验平板放置于铝块上，使平板从任一边缘起第一个和最后一个区域的中线分别与两侧铝块的边缘完全对齐（图 2B、D）。
   5. 向平板表面喷水（覆盖琼脂糖表面的一层薄水膜即可），以防止琼脂糖凝胶干燥。确保水膜连续且无水滴，因为幼虫可能被困在水滴中。
   6. 用纸板箱覆盖梯度系统，以减少水分蒸发并帮助稳定凝胶表面温度。静置 5–10 分钟，使温度达到平衡。
   7. 在 10 个区域的每个区域中线位置检测两个点的表面温度（图 2D）。在每个区域内进行两次测量，以判断区域内是否存在温度差异。确保两个测量点的温度均在目标温度的 ± 0.2 °C 范围内。
      注意：区域内的温度差异通常是因为两个测量点到铝块边缘的精确距离不一致所致。调整平板在铝块上的位置，确保靠近每侧边缘的第一个和最后一个区域的中线与两侧铝块的边缘完全对齐。
   8. 若实测温度梯度与目标梯度存在偏差，可调整水浴温度设定值，并在水浴温度稳定后重新检测表面温度。
   9. 在实验开始前，用纸板箱覆盖铝块。

4. 幼虫收集与清洗

1. 分离干净的幼虫（方案一）
   1. 向一个50 mL离心管中加入约40 mL 18%蔗糖溶液。用刮勺将食物瓶中的全部幼虫刮出，并转移至18%蔗糖溶液中。
   2. 用刮勺轻轻但充分混匀，使幼虫与食物残渣分离。静置30–60秒，待幼虫浮至管子上层。将含有幼虫的上层液体（约10 mL）倾倒入另一个50 mL离心管中，并用新鲜的18%蔗糖溶液补满该管。再次静置30–60秒，使幼虫重新浮至上层。
      注意：较大的食物颗粒有时会随幼虫一同转移，若未清除可能影响幼虫的趋温性。若上层仍残留较大食物颗粒，请重复步骤4.1.1–4.1.2，或使用刮勺手动去除。
   3. 将上层幼虫（约10 mL）转移至另外两个50 mL离心管中，并用蒸馏水补满两管，以降低蔗糖浓度，使幼虫迅速沉入底部。静置30–60秒，待幼虫完全沉底。此步骤及后续操作应尽快完成，以防幼虫溺亡。
   4. 通过轻轻倾斜离心管尽可能倒掉上清液。将各管中的幼虫随剩余液体倾出并合并至同一管中，再用蒸馏水补满该管。
   5. 静置30–60秒，待所有幼虫沉底后，再次通过轻轻倾斜离心管尽可能去除上清液。重复此洗涤步骤2–4次 ，以彻底去除蔗糖和所有可见的食物残渣。
   6. 尽可能倒掉多余水分，通过倾析法将幼虫转移至一个空的35 mm培养皿中。用少量水冲洗离心管内壁，并使用小号毛笔辅助转移残留幼虫。
   7. 使用P1000移液器吸除培养皿中多余的水分，保留约0.5 mL水以防止幼虫脱水。
   8. 盖上培养皿盖以防止幼虫逃逸。将皿盖倒置放置，以减少幼虫从盖与皿之间的缝隙逃出的可能性。让幼虫恢复10–20分钟。
2. 分离干净的幼虫（方案二）
   注意：此替代清洗方法可降低幼虫在洗涤过程中因缺氧而窒息的风险。若采用此方法，请在完成上述步骤4.1.1–4.1.2后，继续执行以下操作。
   1. 将细胞筛网（孔径300 µm，可截留72 h AEL或更老的幼虫）置于一个50 mL离心管上方。
   2. 确认蔗糖溶液表面无成虫尸体或食物残渣后，将含有幼虫的上层液体倒入筛网中，使所有幼虫被截留在筛网上。用蒸馏水充分冲洗幼虫，直至50 mL离心管被水充满。
   3. 取下带有幼虫的筛网，弃去离心管中的废液。将筛网重新置于空的50 mL离心管上方，再次用蒸馏水冲洗幼虫，直至离心管被水充满。
   4. 将筛网倒扣在空的35 mm培养皿上方，从筛网上方喷水，使幼虫被冲入培养皿中。用小号毛笔转移残留的幼虫。
   5. 在进入步骤5之前，请继续执行上述步骤4.1.7。

5. 检测与计算

1. 在将幼虫转移至培养皿前，立即移除纸板箱并检查凝胶表面温度。尽量缩短纸板箱打开的时间，以避免干扰温度平衡。若表面干燥，可喷洒少量水于表面。
2. 对于单向梯度实验，在每块培养皿中心区域附近（6个区域中的第3和第4区之间）放置150 ± 50条幼虫（释放区；图2C）。
   注意：对于双向梯度实验，沿每半边的中间区域放置200–400条幼虫（图2D）。
3. 在每块检测培养皿上放置一个微孔板盖，防止幼虫爬出。用纸板箱覆盖整个装置，以避免光照影响幼虫在琼脂糖凝胶上的选择行为。
   注意：对于双向梯度实验，通常无需加盖微孔板盖，因为培养皿较大，且幼虫的偏好温度位于中间区域，因此极少幼虫会聚集在边缘并有机会爬出。
4. 根据幼虫的年龄（表4），单向梯度实验进行10–30分钟，双向梯度实验进行15–35分钟。
5. 移除纸板箱和微孔板盖。使用数码相机从上方拍摄培养皿照片。每块检测培养皿拍摄两张照片，以便研究人员选择对比度和亮度更佳的一张用于分析。
6. 通过抽吸方式清除检测培养皿上及周围所有幼虫。
7. 用蒸馏水彻底清洗检测培养皿、试管和细胞筛。当日制备的检测培养皿可重复使用，除非琼脂糖表面受损。
8. 计算各区域中幼虫的百分比分布。
   1. 使用任何可对图像添加标记的软件打开检测结果的照片图像。根据培养皿上的刻度标记，每隔2 cm绘制一条垂直线，以标示检测区域。
   2. 统计每个区域内的幼虫数量并记录。不要计入距离任一器壁0.5 cm范围内的幼虫，因为器壁附近凝胶较厚，表面温度在此区域呈非线性分布。
   3. 对于单向梯度实验，按以下公式计算每个区域的百分比分布：
      （某一2 cm区域内的幼虫数）/（6个区域中幼虫总数）× 100。
   4. 对于双向梯度实验，按以下公式计算每个区域的百分比分布：
      （某一2 cm区域内的幼虫数）/（梯度每侧5个区域中幼虫总数）× 100。

结果

为建立18 °C至28 °C的单向温度梯度，我们将两个水浴的温度分别设定为16.8 °C和31 °C。通过测量琼脂糖凝胶表面所有6个区域上下部分、区域间边界线以及凝胶两端极端位置共26个点的温度，获得13个位置的温度值（图2C、2E）。沿梯度方向的温度分布几乎呈线性关系（Y = 0.9672*X + 16.19，R² = 0.9961）（图2E）。

我们检测了对照组（w¹¹¹⁸）幼虫在不同年龄阶段的温度偏好。1^龄（24 ± 1.5 h AEL）、2^龄（48 ± 1.5 h AEL）和早期3^龄幼虫（72 ± 1.5 h）在24 °C区域表现出聚集高峰（

讨论

为确保本实验方案的成功，需采取措施获得足够数量的幼虫以进行实验。这包括将果蝇预先饲养在含有酵母糊的培养管中 2-3 天，以提高产卵量。培养管应放置于装有水瓶的托盘内，并用透明塑料袋密封，以保持食物湿度，促进幼虫有效进食，同时允许其暴露于正常的明暗循环条件下。然而，酵母糊不应过于松软，以免果蝇被困其中。每管所放雌蝇数量取决于基因型。以 w¹¹¹⁸ 为例，通常每管放入约 12 只雌蝇和约 6 只雄蝇，产卵 3 小时即可。通常两个培养管可提供足够的幼虫（100-200 条），用于单向实验的平板测试。如果果蝇品系的产卵量低于野生型，或孵化幼虫比例降低，可增加雌蝇（最多 30-35 只/管）和雄蝇数量。

进行这些实验时，存在多种导致非预期变异的原因。幼虫的发育阶段会影响其温度偏好，因此必须谨慎使用特定发育阶段的幼虫。为此，应在较短的时间窗口内（例如3小时）收集幼虫。由于培养条件（温度、湿度、光暗周期和食物类型）以及某些突变会影响发育速度，因此不应仅依赖产卵后的时间来分析年龄相当的幼虫。同时，还应检查幼虫的形态特征，例如口钩和气门的大小。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<强>梯度实验装置
PolyScience 9106，6升制冷/加热循环浴槽	托马斯科学公司	9106	此型号已停产。更新的替代型号包括：120 V、60 Hz 的 1186R00 和 1197U04，或 240 V、50 Hz 的 1184L08 和 1197U04。
铝测定板（用于单向梯度）			外尺寸：14 x 10.1 x 0.9 cm，内尺寸：12.9 x 8.7 x 0.8 cm，黑色阳极氧化处理。
铝板（用于双向梯度）			25 × 22 × 0.2 厘米，黑色阳极氧化处理。
铝块			外部尺寸：25.5 x 5 x 1.4 cm，内通道参数如图1D所示。
铝块与管路连接件	McMaster-Carr	91355K82
Tygon 卫生级硅胶管	Tygon	57296	1/4" ID x 3/8" OD × 1/16" 壁
<强>名称	<强>公司	<强>货号	<强>评论
<强>检测所需物品与试剂
研钵杵	USA Scientific	17361	适用于1.5 mL微量离心管的研磨棒
温度计	扁虫	51II
热电偶	吸虫	K型
通用型微孔板盖	康宁	6980A77
35 mm 培养皿	康宁	9380D40
双向梯度标记胶带	Fisher Scientific	15-951	Fisherbrand 标签胶带 2 英寸 × 14 码
琼脂糖	Invitrogen	16500500	制备1%溶液
蔗糖	Sigma	S0389-5KG	在开始检测前立即配制18%溶液
画笔	Fisher Scientific	11860
50 mL 离心管	丹维尔	C1062-P
药勺	Fisher Scientific	14-357Q
500 mL 圆口广口瓶	Pyrex	1395-500
细胞滤筛（300 mm 孔径）	PluriSelect	43-50300	幼虫清洗可选用品
纸板箱（小瓶托盘）	Genesee Scientific	FS32-124
<强>名称	<强>公司	<强>货号	<强>评论
<强>果蝇<强> 食物
蒸馏水			22,400 mL
玉米粉，黄色（超细网筛，絮状）20 kg	LabScientific 公司	NC0535320	1,609 g
啤酒酵母 100 磅	MP Biomedicals	ICN90331280	379 g
NutriSoy® 大豆粉（10 千克/单位）	Genesee Scientific	62-115	221 g
果蝇 琼脂，II 型（5 kg）	Genesee Scientific	66-103	190 g
Karo 轻质玉米糖浆	Karo		1,700 mL
对羟基苯甲酸甲酯（溶于 200 proof 乙醇中）	Sigma Aldrich	H5501-5KG	72 g/240 mL
丙酸，特纯，p.a.>99.5%（气相色谱）	Sigma Aldrich	81910-1 L	108 mL
磷酸 ACS试剂， ≥85 wt. % in H2O	Sigma Aldrich	438081-500 mL	8.5 mL