一种用于测定生物体温度偏好的温度梯度实验方法 果蝇 幼虫

摘要

在此，我们介绍一种用于测定生物体偏好环境温度的实验方案。 果蝇 使用连续温度梯度对幼虫进行处理。

摘要

许多动物，包括果蝇， 黑腹果蝇能够区分细微差异 环境温度，使它们能够寻找偏好的温度环境。为了确定幼虫在特定线性温度范围内的温度偏好，我们开发了一种利用温度梯度的检测方法。为建立单向温度梯度，将两个铝块分别连接至独立的水浴装置，各自控制相应铝块的温度，这两个铝块设定了梯度的低温端和高温端。通过将一块涂有琼脂糖的铝板放置在两个由水浴控温的铝块上，使铝板跨越两者之间的距离，从而形成温度梯度。铝板与水浴铝块接触的两端分别定义为最低和最高温度，两铝块之间的区域则形成线性温度梯度。该梯度检测方法可用于 不同日龄的幼虫均可使用，可用于鉴定表现出表型的突变体，例如影响编码TRP通道和视蛋白基因的突变体，这些基因对于温度分辨至关重要。

引言

趋热性被运动性动物用来选择具有最有利条件的环境^1,2,3如果气候过于炎热或寒冷，这种行为对生存至关重要。此外，许多动物对舒适温度范围内的微小温差十分敏感，并会主动寻找温度适宜的环境。这对于果蝇等变温生物尤为重要，因为它们的体温会与环境温度趋于一致。用于监测幼虫趋温性的实验方法，在鉴定和阐明分子感受器（如果蝇中的某些温度感应蛋白）的功能方面发挥了关键作用。 果蝇 瞬时受体电位（TRP）通道^4,5,6，视紫红质^7,8和离子型受体（IRs）⁹，使这些动物在不同温度范围内具有温度敏感性。

双选择实验为研究幼虫的温度偏好提供了一种方法^6,7该检测需要建立两个不同的温度区，并允许 动物选择一侧而非另一侧。双向选择....

方案

1. 梯度实验的设备制备与组装装置

1. 制备用于单向梯度实验的铝制实验板。
   1. 使用带锯和锋利的立式铣床，将每块铝制实验板（图1A）从一整块铝材上切割并打磨而成，尺寸如下：外部尺寸为140 × 100 × 9 mm，内部尺寸为130 × 90 × 8 mm（图1B）。用黑色涂料对每块实验板内表面进行阳极氧化处理，以便更清晰地观察幼虫并防止生锈。
      注：单向梯度用铝制实验板的加工由机加工车间完成。阳极氧化处理由商业供应商完成。
   2. 使用永久性记号笔在每块实验板的上边缘和下边缘标记13个刻度线，每条线间隔10 mm。第一条和最后一条刻度线应距离实验板内边缘5 mm（图1A、B）。
2. 为制备双向梯度用的铝制实验板，使用剪板机将铝板裁剪成以下尺寸：250 × 220 × 2 mm。用黑色涂料对实验板进行阳极氧化处理。
   注：双向梯度用铝制实验板的加工由机加工车间完成。阳极氧化处理由商业供应商完成。
3. 制备铝块。
   注：单向梯度实验需要两个铝块，双向梯度实验需要三个铝块。
   1. 使用带锯从一整块铝材上切割出铝块（图....

结果

为建立18 °C至28 °C的单向温度梯度，我们将两个水浴的温度分别设定为16.8 °C和31 °C。通过测量6个区域上下部分、区域间边界线以及琼脂糖凝胶表面两端共26个位置的温度，获得13个点的温度值（图2C，2E）。沿梯度方向的温度分布接近线性（Y = 0.9672*X + 16.19，R² = 0.9961）（图2E）。

我们测定了对照组（control）的温度偏好w¹¹¹⁸不同日龄的幼虫。1^st （24 ± 1.5 小时 AEL），2^nd （48 ± 1.5 小时 AEL）和早期3^rd 幼虫（72 ± 1.5 h）表现出峰值 24 °C 区

讨论

为确保本实验方案的成功，需采取措施获得足够数量的幼虫以进行实验。这包括将果蝇预先饲养在含有酵母糊的培养管中 2-3 天，以提高产卵量。培养管应放置于装有水瓶的托盘内，并用透明塑料袋密封，以保持食物湿度，促进幼虫有效进食，同时允许其暴露于正常的明暗循环条件下。然而，酵母糊不应过于松软，以免果蝇被困其中。每管所放雌蝇数量取决于基因型。以 w¹¹¹⁸ 为例，通常每管放入约 12 只雌蝇和约 6 只雄蝇，产卵 3 小时即可。通常两个培养管可提供足够的幼虫（100-200 条），用于单向实验的平板测试。如果果蝇品系的产卵量低于野生型，或孵化幼虫比例降低，可增加雌蝇（最多 30-35 只/管）和雄蝇数量。

进行这些实验时，存在多种导致非预期变异的原因。幼虫的发育阶段会影响其温度偏好，因此必须谨慎使用特定发育阶段的幼虫。为此，应在较短的时间窗口内（例如3小时）收集幼虫。由于培养条件（温度、湿度、光暗周期和食物类型）以及某些突变会影响发育速度，因此不应仅依赖产卵后的时间来分析年龄相当的幼虫。同时，还应检查幼虫的形态特征，例如口钩和气门的大小。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
梯度实验装置
PolyScience 9106，制冷/加热 6L 循环浴槽	Thomas Scientific	9106	该型号已停产。更新的替代型号包括：120 V、60 Hz 的 1186R00 和 1197U04，或 240 V、50 Hz 的 1184L08 和 1197U04。
铝制检测板（用于单向梯度）			外尺寸：14 x 10.1 x 0.9 cm，内尺寸：12.9 x 8.7 x 0.8 cm，黑色阳极氧化处理。
铝板（用于双向梯度）			25 x 22 x 0.2 厘米，黑色阳极氧化处理。
铝块			外尺寸：25.5 x 5 x 1.4 cm，内通道参数如图1D所示。
铝块与管路连接器	McMaster-Carr	91355K82
Tygon 卫生级硅胶管	Tygon	57296	1/4" ID x 3/8" OD × 1/16" 壁
名称	公司	目录编号	评论
实验所需物品与试剂
研杵	USA Scientific	17361	1.5 mL 微型离心管研磨棒
温度计	吸虫	51II
热电偶	吸虫	K型
通用微孔板盖	Corning	6980A77
35 mm 培养皿	康宁	9380D40
用于双向梯度的标记胶带	Fisher Scientific	15-951	Fisherbrand 标签胶带 2 英寸 × 14 码
琼脂糖	Invitrogen	16500500	制备1%溶液
蔗糖	Sigma	S0389-5KG	在开始实验前立即配制18%的溶液
画笔	Fisher Scientific	11860
50 mL 离心管	丹维尔	C1062-P
刮勺	Fisher Scientific	14-357Q
500 mL 圆底广口瓶	Pyrex	1395-500
细胞筛（300 mm 孔径）	PluriSelect	43-50300	幼虫清洗可选用品
纸板箱（小瓶托盘）	Genesee Scientific	FS32-124
名称	公司	目录编号	评论
黑腹果蝇 食物
蒸馏水			22,400 mL
玉米粉，黄色（超细网筛，絮状）20 kg	LabScientific 公司	NC0535320	1,609 g
酿酒酵母 100 lbs	MP Biomedicals	ICN90331280	379 g
NutriSoy® 大豆粉（10 千克/单位）	Genesee Scientific	62-115	221 g
黑腹果蝇 琼脂，II 型（5 kg）	Genesee Scientific	66-103	190 g
卡罗轻质玉米糖浆	卡罗		1,700 mL
对羟基苯甲酸甲酯（溶于 200 proof 乙醇）	Sigma Aldrich	H5501-5KG	72 g/240 mL
丙酸 优级纯 p.a.>99.5%（气相色谱）	Sigma Aldrich	81910-1 L	108 mL
磷酸 ACS试剂， ≥85 wt. % in H2O	Sigma Aldrich	438081-500 mL	8.5 mL