有髓轴突上的光谱反射显微镜技术 原位

摘要

本文介绍了一种基于光谱反射测量的无标记纳米级成像技术，用于对固定脑切片中的有髓轴突进行成像的逐步操作方案。

摘要

在哺乳动物神经系统中，髓鞘通过多层螺旋结构包裹轴突纤维，从而提供电绝缘作用。受其高度有序的亚细胞结构启发，我们近期开发出一种名为光谱反射成像（spectral reflectometry, SpeRe）的新型成像技术，该技术能够以前所未有的分辨率对活体有髓轴突进行无标记纳米级成像 原位其基本原理是通过分析多层亚细胞结构的反射光谱来获取纳米结构信息。本文介绍了一种使用配备白光激光器和可调滤光片的商用共聚焦显微系统，对神经组织进行基础SpeRe成像的详细分步操作方案。内容涵盖样品制备、光谱数据采集以及图像处理以获得纳米结构信息的全过程。

引言

在哺乳动物神经系统中，髓鞘通过多层膜性鞘包裹轴突纤维，实现快速神经传导和维持轴突完整性。这种多层结构由交替排列的纳米级薄膜组成，包括质膜（约5 nm）、胞质溶胶（约3 nm）和细胞外间隙（约7 nm）。^1,2光学显微镜，包括近年来的超分辨率显微镜，由于受到光学衍射的限制而分辨率不足，因此不适合用于观察纳米尺度的髓鞘动态变化。^3,4,5尽管电子显微镜能够提供髓鞘纳米结构的精细细节，但由于其样品制备过程涉及化学固定和超薄切片等高度侵入性操作，无法适用于活体生物系统。^6,7直到最近，尚无适用于观测有髓鞘轴突纳米级动态的技术 原位.

Schain 等 先前有报道称，有髓鞘轴突表现出多彩的光反射现象⁸通过对接收反射光的光谱分析，我们设计出一种用于有髓轴突纳米级成像的新成像方法，称为光谱反射成像（SpeRe）。⁹. SpeRe 基于髓鞘多层结....

方案

所有外科手术均经成均馆大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。

1. 样品制备

注意：在接触动物前，所有手术器械均需进行高压灭菌。所有手术操作应在专用于手术的房间内进行。手术室内所有人员必须全程穿戴无菌手术衣和手套。

1. 组织固定
   1. 准备两个10 mL注射器，分别装入磷酸盐缓冲液（PBS）和含4%多聚甲醛（PFA）的PBS溶液。
   2. 通过腹腔注射给予7至12周龄小鼠（C57BL/6J或任何品系，性别不限）氯胺酮与赛拉嗪混合物（1:1，各20 mg/kg）或其他合适的麻醉方案（例如，80 mg/kg氯胺酮与10 mg/kg赛拉嗪的混合物）进行麻醉。
   3. 当小鼠达到外科麻醉深度（通过脚趾夹捏反应判断）后，用剪刀剪开皮肤和肋骨，暴露心脏。
   4. 用小剪刀剪开右心房以排出血液，并通过左心室用针头依次灌注PBS和PFA溶液（灌注速率为4 mL/min，每种溶液灌注体积为10 mL）。
      注意：若操作成功，小鼠身体会变得僵硬。由于该操作为终末性操作，无需使用眼药膏或进行消毒。组织固定步骤可省略，但建议执行此步骤以最大限度减少结构形变，包括机械性组织损伤和缺血性轴突肿胀。有关组织固定的更多细节，请参见Gage G. J. 等的文章

结果

根据实验方案，使用外源性染色法制备固定脑切片，并采用靶向髓鞘的荧光染料（见材料表）。利用商用高光谱共聚焦显微镜结合共聚焦荧光成像对脑切片进行SpeRe成像（图4a）。在SpeRe成像中，入射光强度设定为5 µW/µm²，像素驻留时间约为1 µs。该光照剂量比传统荧光共聚焦显微镜低一个数量级以上¹²。在470–670 nm波长范围内以4 nm间隔进行光谱扫描（共51幅图像）约需17秒。

SpeRe 信号沿有髓轴突的中心分布，这与光学反射的几何特性预期一致。从轴突节段的反射光谱中获得波数周期性，并将其转换为轴突直径图4b，c）。SpeRe 测得的直径与基于荧光的测量结果具有良好的一致性（

讨论

SpeRe 是一种基于光谱干涉测量的新型无标记成像技术，首次实现了对活体有髓轴突的纳米级信息获取。在当前的采集方案中，轴突直径的空间分辨率约为 10 nm。此外，与其它超分辨率显微技术相比，SpeRe 所需的光照剂量低数个数量级，因此完全避免了光毒性和光漂白效应。SpeRe 将为研究有髓轴突的纳米级动态过程提供一条全新的途径。

本方案基于声光调制的光谱扫描和点探测器即，PMT）。该方法在获取全视场光谱图像方面具有优势。然而，由于光谱扫描的限制，其时间分辨率通常较低。 > 15秒，以我们当前的配置。作为替代方案，可整合高速光谱仪，以实现对小视场的实时观测⁹该系统可通过将传统共聚焦系统中的光电倍增管（PMT）更换为光谱仪，并添加白光激光器来简易构建。在采集软件方面，需要将检流计的位置与光谱仪的运行同步。在单点测量情况下，时间分辨率由光谱仪的帧率决定，该帧率可以达到 > 10 kHz，适用于最新的超快光谱技术。这种亚毫秒级的时间分辨率足以观测有髓鞘轴突的大多数生理动态过程。 体内. Spe.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
玻璃切割器	-	-	可在本地便利店或在线商店购买。
指甲油	-	-	可在本地便利店或在线商店购买。
复消色差物镜 40×, NA 1.1	Leica Microsystems	15506357	水浸式
Fluoromyelin Green	Thermo Fisher	F34651	也可使用 Fluoromyelin Red (F34652)。
Leica SP8 TCS 显微镜	Leica Microsystems	SP8	详见引言部分中"显微镜配置"部分。
成像软件	Leica Microsystems	LAS-X	-
Matlab	MathWorks	-	-
反射镜	Thorlabs	PF10-03-P01	镀有保护银层。
磷酸盐缓冲液 (PBS)	Life technologies	14190-136	-
多聚甲醛	Biosolution	BP031a	在 PBS 中配制成 4% v/v
盖玻片	Thermo Fisher	3306	厚度：#1 (0.13 至 0.17 mm)
载玻片	Muto Pure Chemicals	5116-20F	厚度：约 1 mm
瞬间胶	Henkel	Loctite 406	使用分配装置以避免接触皮肤或眼睛。
注射泵	Brainetree Scientific	BS-8000 DUAL	-
振动切片机	Leica Biosystems	VT1200S	-
白光激光器	NKT photonics	EXB-6	EXB-6 已停产，由 EXU-6 取代。