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方法文章

有髓轴突上的光谱反射显微镜技术 原位

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DOI：

10.3791/57965

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2018年7月2日

 , 
1Department of Biomedical Engineering, Sungkyunkwan University, 2Center for Neuroscience Imaging Research, Institute for Basic Science (IBS)

本文内容

摘要

本文介绍了一种基于光谱反射测量的无标记纳米级成像技术，用于对固定脑切片中的有髓轴突进行成像的逐步操作方案。

摘要

在哺乳动物神经系统中，髓鞘通过多层螺旋结构包裹轴突纤维，从而提供电绝缘作用。受其高度有序的亚细胞结构启发，我们近期开发出一种名为光谱反射成像（spectral reflectometry, SpeRe）的新型成像技术，该技术能够以前所未有的分辨率对活体有髓轴突进行无标记纳米级成像 原位其基本原理是通过分析多层亚细胞结构的反射光谱来获取纳米结构信息。本文介绍了一种使用配备白光激光器和可调滤光片的商用共聚焦显微系统，对神经组织进行基础SpeRe成像的详细分步操作方案。内容涵盖样品制备、光谱数据采集以及图像处理以获得纳米结构信息的全过程。

引言

在哺乳动物神经系统中，髓鞘通过多层膜性鞘包裹轴突纤维，实现快速神经传导和维持轴突完整性。这种多层结构由交替排列的纳米级薄膜组成，包括质膜（约5 nm）、胞质溶胶（约3 nm）和细胞外间隙（约7 nm）。1,2光学显微镜，包括近年来的超分辨率显微镜，由于受到光学衍射的限制而分辨率不足，因此不适合用于观察纳米尺度的髓鞘动态变化。3,4,5尽管电子显微镜能够提供髓鞘纳米结构的精细细节，但由于其样品制备过程涉及化学固定和超薄切片等高度侵入性操作，无法适用于活体生物系统。6,7直到最近，尚无适用于观测有髓鞘轴突纳米级动态的技术 原位.

Schain 等 先前有报道称，有髓鞘轴突表现出多彩的光反射现象8通过对接收反射光的光谱分析，我们设计出一种用于有髓轴突纳米级成像的新成像方法，称为光谱反射成像（SpeRe）。9. SpeRe 基于髓鞘多层结构中发生的薄膜干涉现象（图1）。通过对不同轴突进行光学模拟，我们发现反射光谱是波数的周期性函数，其周期性（波传播方程中的相速度符号 \( \tilde{v}_p \)。) 与轴突直径成反比 (d）。这种简单的关系（扩散系数方程（d=0.27/√v_p）；公式，研究分析，静态变量) 可对 SpeRe 数据中的轴突直径进行便捷的量化分析。利用该方法，我们在先前的报告中揭示了轻度创伤性脑损伤下普遍存在的轴突膨大现象。

SpeRe 系统基于共聚焦显微镜，包含一个专用的激光光源和滤光片（图2）。输入光源为白光激光器，可提供从可见光到红外区域的宽带光谱输出。在光谱扫描过程中，系统配备有两个声光器件：一个声光可调滤波器（AOTF），用于从输入的宽带光源中选择特定波长；以及一个声光分光器（AOBS），用于将选定的反射波长引导至探测器。高光谱共聚焦显微镜软件（见材料表）提供可自定义的光谱扫描选项，可依次在不同输入波长下获取反射图像。此外，色差可能严重影响光谱测量结果，因此建议使用复消色差物镜。

需要注意的是，白光激光器产生的光谱输出不均匀，且光学元件也会影响光谱轮廓。因此，为进行后续的定量分析，所获取的光谱需要进行校准。通常使用镀保护银的反射镜作为参考，该反射镜在整个可见光区域具有近乎恒定的反射率（> 97%）。然后将所获取的光谱除以该反射镜的参考光谱。

光谱扫描的光谱步长决定了采集速度，因此需要进行优化。由于较大轴突具有更高的光谱周期，因此需要更精细的光谱采样。例如，直径为 10 µm，作为最大的生理轴突之一，其光谱周期约为 ~8 nm。根据奈奎斯特采样准则，我们采用 4 nm 的光谱采样间隔，以覆盖小鼠神经组织中的所有生理轴突。该方法通常需要数秒以上完成一次完整的光谱扫描，因此不适用于 体内 应用中，生理运动（例如 呼吸和心跳会干扰稳定的光谱采集。我们此前通过改装一台定制的直立显微镜解决了这一问题，该显微镜采用阵列光谱仪，可对每个点采集完整光谱（采集速度 ≈ 30 ms/像素）。

在本报告中，我们描述了一种在固定脑切片上进行 SpeRe 成像的详细方案，该方案可在商用高光谱显微镜上完成（参见材料表）。因此，无需具备光学仪器专业知识的研究人员也可完成该方案。我们还涵盖了 SpeRe 数据采集与分析过程中可能遇到的问题及相应的解决方法。

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方案

所有外科手术均经成均馆大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。

1. 样品制备

注意：在接触动物前，所有手术器械均需进行高压灭菌。所有手术操作应在专用于手术的房间内进行。手术室内所有人员必须全程穿戴无菌手术衣和手套。

  1. 组织固定
    1. 准备两个10 mL注射器，分别装入磷酸盐缓冲液（PBS）和含4%多聚甲醛（PFA）的PBS溶液。
    2. 通过腹腔注射给予7至12周龄小鼠（C57BL/6J或任何品系，性别不限）氯胺酮与赛拉嗪混合物（1:1，各20 mg/kg）或其他合适的麻醉方案（例如，80 mg/kg氯胺酮与10 mg/kg赛拉嗪的混合物）进行麻醉。
    3. 当小鼠达到外科麻醉深度（通过脚趾夹捏反应判断）后，用剪刀剪开皮肤和肋骨，暴露心脏。
    4. 用小剪刀剪开右心房以排出血液，并通过左心室用针头依次灌注PBS和PFA溶液（灌注速率为4 mL/min，每种溶液灌注体积为10 mL）。
      注意：若操作成功，小鼠身体会变得僵硬。由于该操作为终末性操作，无需使用眼药膏或进行消毒。组织固定步骤可省略，但建议执行此步骤以最大限度减少结构形变，包括机械性组织损伤和缺血性轴突肿胀。有关组织固定的更多细节，请参见Gage G. J. 等的文章10。
  2. 脑切片制备
    1. 使用手术剪刀经胸腹腹侧剪断小鼠头部。
    2. 使用合适的小型剪刀去除头皮和骨膜，直至完全暴露颅骨。
    3. 小心用小剪刀击破额骨，并沿矢状缝从枕骨开始剪开颅骨，注意避免损伤脑组织。
    4. 使用精细镊子依次轻柔地移除颅骨和硬脑膜。
    5. 使用软质塑料勺小心取出脑组织，注意避免损伤组织。
    6. 将取出的脑组织在4% PFA溶液中清洗并浸泡30分钟，温度保持在4 °C。
    7. 使用振动切片机将固定后的脑组织切成100 – 150 µm厚的切片。
      注意：有关组织制备的更多细节，请参见Segev 等的文章11。后续操作中，组织切片的厚度应小于间隔片的厚度。
  3. 脑切片的封片
    1. 为每一片组织切片准备1张载玻片和2片方形盖玻片（22 × 22 × 0.17 mm）。
    2. 使用玻璃切割器将其中一片方形盖玻片切成两半（得到两个矩形片）。
    3. 使用瞬间胶将两片半块盖玻片固定在载玻片上。
      注意：两片半盖玻片之间的间隙应略大于组织切片的尺寸。
    4. 使用毛刷或移液器取出脑切片，并将组织平铺于载玻片上的间隔区域之间，注意避免组织折叠。
    5. 在组织表面滴加100 μL PBS。
    6. 将另一片完整的方形盖玻片覆盖在组织上方。此过程中应避免产生气泡。
    7. 使用指甲油（或其它合适的封片剂）密封盖玻片周围，以防止在后续成像过程中PBS蒸发或灰尘污染。
      注意：实验人员可在该步骤暂停操作。

2. 校准

  1. 至少在成像前1小时打开显微镜，以使激光光源达到热稳定状态（参见 材料表）。然后，启动光谱扫描软件（参见 材料表）并点击 获取 位于图形用户界面顶部的按钮图3a).
  2. 打开白光激光器（WLL）和光电倍增管（PMT）的软件快门图3a).
  3. 选择 xyΛ 模式 在下拉列表中 采集模式，然后，激光输入模式会自动从 恒定百分比 到 恒定功率. 取消勾选复选框 自动 SP 运动。然后，将输入激光的光谱窗口设置为470–670 nm，光谱步长设置为4 nm Λ-激发波长扫描 设置 (图3b).
  4. 将PMT的光谱范围设置为450-690，方法是双击光谱范围调节条或拖动其调整滑块图3c).
    注意：该光谱范围应包含输入光源的完整带宽。
  5. 选择一个适合的水浸物镜，最好具有较高的数值孔径（NA） > 0.7），并为 PMT 和激光功率设置任意值以激活 AOBS 配置 和 活体扫描 按钮。通过检查反射来切换光路 AOBS 配置 (图3d).
  6. 安装参考镜（参见 材料表)置于显微镜载物台上，镜面应朝向物镜。若镜片不易放置于显微镜载物台上，可将镜片粘附于平板上（例如 载玻片
  7. 控制显微镜载物台，使焦平面与镜面表面对齐。
  8. 调整PMT增益和激光功率，考虑探测器的动态范围，然后将激光输入模式从 恒定百分比 到 恒定功率.
    注意：通常情况下，570 nm 处使用 500（V）的光电倍增管增益和 0.1% 的相对激光功率。
  9. 以伪彩色模式确认在整个波长范围内无饱和现象。若观察到饱和，应降低激光功率（图3a).
  10. 运行 Lambda 扫描 采集
  11. 从载物台上取下镜片，并在无样品的情况下重复相同的采集过程，以获得暗参考（即，暗场偏移。
  12. 将数据保存在 多层堆叠TIF 格式。

3. SpeRe 图像采集

  1. 将固定好的组织置于显微镜载物台上。通过目镜使用宽场荧光模式，粗略地将组织调整至物镜的焦平面。
  2. 开启Live Scan后，控制显微镜载物台，使焦平面与组织中的目标区域对齐。为避免盖玻片产生的背景噪声，应从玻璃-组织界面起至少选择15 μm深度的目标区域。
  3. 使用与步骤2.1–2.10中所述相同的方法，获取目标区域的光谱图像堆栈。
  4. 以Multistacked TIF格式保存组织数据和暗场偏移数据。
    注意：实验人员可在此阶段暂停操作。

4. 图像处理与分析

  1. 在 ImageJ 中打开参考镜和脑组织的光谱数据（多层堆叠 TIF）。
  2. 为已打开的图像堆栈选择感兴趣区域（ROI）——参考镜选择中心区域，脑组织选择一段轴突纤维。
  3. 在 ImageJ 菜单中执行 图像 → 堆栈 → 绘制 Z 轴轮廓，获取所选 ROI 的原始光谱。
  4. 打开暗偏移数据，分别获取参考镜和脑组织的暗偏移数据。
  5. 在 ImageJ 菜单中执行 图像 → 堆栈 → 绘制 Z 轴轮廓，获取暗偏移的光谱。
  6. 使用 复制和粘贴 功能保存所有获取的光谱。
    注意：对于 SpeRe 成像，建议使用成像视野的中心区域，以尽量减少离轴光学像差。轴突纤维在其长度方向上可能存在结构异质性。因此，建议在较小的轴突片段上选择 ROI，通常 < 5 µm，以尽量减少部分容积伪影。

5. 基线校正与SpeRe信号分析

  1. 从参考镜和脑组织的光谱中减去偏移光谱。
  2. 通过将每个光谱除以其最大强度值来对其进行归一化。
  3. 将轴突的归一化光谱除以参考镜的归一化光谱 ，并从归一化光谱中减去直流偏移量。
  4. 通过将获取的光谱拟合到正弦曲线（参见材料表）来测量波数频率 ，然后取其倒数将获得的波数转换为周期性。
  5. 使用图4c中的方程将波数周期性转换为轴突直径。

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结果

根据实验方案，使用外源性染色法制备固定脑切片，并采用靶向髓鞘的荧光染料（见材料表）。利用商用高光谱共聚焦显微镜结合共聚焦荧光成像对脑切片进行SpeRe成像（图4a）。在SpeRe成像中，入射光强度设定为5 µW/µm2，像素驻留时间约为1 µs。该光照剂量比传统荧光共聚焦显微镜低一个数量级以上12。在470–670 nm波长范围内以4 nm间隔进行光谱扫描（共51幅图像）约需17秒。

SpeRe 信号沿有髓轴突的中心分布，这与光学反射的几何特性预期一致。从轴突节段的反射光谱中获得波数周期性，并将其转换为轴突直径图4b，c）。SpeRe 测得的直径与基于荧光的测量结果具有良好的一致性（

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讨论

SpeRe 是一种基于光谱干涉测量的新型无标记成像技术，首次实现了对活体有髓轴突的纳米级信息获取。在当前的采集方案中，轴突直径的空间分辨率约为 10 nm。此外，与其它超分辨率显微技术相比，SpeRe 所需的光照剂量低数个数量级，因此完全避免了光毒性和光漂白效应。SpeRe 将为研究有髓轴突的纳米级动态过程提供一条全新的途径。

本方案基于声光调制的光谱扫描和点探测器即，PMT）。该方法在获取全视场光谱图像方面具有优势。然而，由于光谱扫描的限制，其时间分辨率通常较低。 > 15秒，以我们当前的配置。作为替代方案，可整合高速光谱仪，以实现对小视场的实时观测9该系统可通过将传统共聚焦系统中的光电倍增管（PMT）更换为光谱仪，并添加白光激光器来简易构建。在采集软件方面，需要将检流计的位置与光谱仪的运行同步。在单点测量情况下，时间分辨率由光谱仪的帧率决定，该帧率可以达到 > 10 kHz，适用于最新的超快光谱技术。这种亚毫秒级的时间分辨率足以观测有髓鞘轴突的大多数生理动态过程。 体内. Spe...

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披露

作者声明存在竞争性财务利益：J. Kwon 和 M. Choi 是本文所述待批专利技术的发明人。

致谢

本工作由基础科学研究所（IBS-R015-D1）和韩国国家研究基金会（NRF）通过教育部长资助的基础科学研究计划（2017R1A6A1A03015642）支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
玻璃切割器--可在本地便利店或在线商店购买。
指甲油--可在本地便利店或在线商店购买。
复消色差物镜 40×, NA 1.1Leica Microsystems15506357水浸式
Fluoromyelin GreenThermo FisherF34651也可使用 Fluoromyelin Red (F34652)。
Leica SP8 TCS 显微镜Leica MicrosystemsSP8详见引言部分中"显微镜配置"部分。
成像软件Leica MicrosystemsLAS-X-
MatlabMathWorks--
反射镜ThorlabsPF10-03-P01镀有保护银层。
磷酸盐缓冲液 (PBS)Life technologies14190-136-
多聚甲醛BiosolutionBP031a在 PBS 中配制成 4% v/v
盖玻片Thermo Fisher3306厚度：#1 (0.13 至 0.17 mm)
载玻片Muto Pure Chemicals5116-20F厚度：约 1 mm
瞬间胶HenkelLoctite 406使用分配装置以避免接触皮肤或眼睛。
注射泵Brainetree ScientificBS-8000 DUAL-
振动切片机Leica BiosystemsVT1200S-
白光激光器NKT photonicsEXB-6EXB-6 已停产，由 EXU-6 取代。

参考文献

  1. Fernandez-Moran, H., Finean, J. B. Electron microscope and low-angle x-ray diffraction studies of the nerve myelin sheath. Journal of Cell Biology. 3, (1957).
  2. Blaurock, A. E. The spaces between membrane bilayers within PNS myelin as characterized by X-ray diffraction. Brain Research. 210, 383-387 (1981).
  3. Shim, S. -H., et al. Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes. Proceedings of the National Academy of Sciences. , 13978-13983 (2012).
  4. Urban, N. T., Willig, K. I., Hell, S. W., Nägerl, U. V. STED nanoscopy of actin dynamics in synapses deep inside living brain slices. Biophysics Journal. 101, 1277-1284 (2011).
  5. Manley, S., et al. High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy. Nature Methods. 5, 155-157 (2008).
  6. Peters, A., Sethares, C. Is there remyelination during aging of the primate central nervous system? Journal of Comparative Neurology. 460, 238-254 (2003).
  7. De Campos Vidal, B., Silveira Mello, M. L., Caseiro-Filho, A. C., Godo, C. Anisotropic properties of the myelin sheath. Acta Histochemica. 66, 32-39 (1980).
  8. Schain, A. J., Hill, R. A., Grutzendler, J. Label-free in vivo imaging of myelinated axons in health and disease with spectral confocal reflectance microscopy. Nature Medicine. 20, 443-449 (2014).
  9. Kwon, J., et al. Label-free nanoscale optical metrology on myelinated axons in vivo. Nature Communication. 8, 1832(2017).
  10. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. JoVE. (65), e3564(2012).
  11. Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices. JoVE. (112), e54024(2016).
  12. Waldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., Van De Linde, S., Sauer, M. Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy. Scientific Reports. 5, 15348(2015).
  13. Chang, J. B., et al. Iterative expansion microscopy. Nature Methods. 14, 593-599 (2017).
  14. Polishchuk, R. S., et al. Correlative light-electron microscopy reveals the tubular-saccular ultrastructure of carriers operating between Golgi apparatus and plasma membrane. Journal of Cell Biology. 148, 45-58 (2000).

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