Qdot 标记蛋白与现场特异修饰的λ DNA 在单分子水平上的相互作用可视化

Summary

在这里, 我们提出了一个协议, 研究 DNA 蛋白相互作用的全内反射荧光显微镜 (TIRFM) 使用一个网站专门修改的λ DNA 基底和量子点标记蛋白。

Abstract

荧光显微镜在解剖单一分子水平复杂生物过程的机制方面做出了巨大贡献。在用于研究 DNA-蛋白质相互作用的单分子检测中, 有两个重要的因素需要考虑: 具有足够长度的 dna 基质, 便于观察和用合适的荧光探针对蛋白质进行标记。48.5 kb 的λ dna 是一个很好的候选 dna 基质。量子点 (Qdots) 作为一类荧光探针, 允许长时间观测 (分钟到数小时) 和高质量的图像采集。本文提出了一种在单分子水平上研究 DNA-蛋白质相互作用的协议, 包括制备一个特异修饰的λ dna, 并用链亲和素包覆 Qdots 标记靶蛋白。为了证明概念, 我们选择了在萌芽的酵母中的兽人 (原产地识别复合体) 作为一种感兴趣的蛋白质, 并可视化其与 TIRFM (自主复制序列) 的相互作用。与其他荧光探针相比, Qdots 在单分子研究中具有明显的优越性, 因为它对漂白具有较高的稳定性, 但应注意到该特性限制了其在定量测定中的应用。

Introduction

蛋白质和 dna 之间的相互作用对许多复杂的生物过程至关重要, 例如 dna 复制、dna 修复和转录。虽然传统的方法已经揭示了这些过程的性质, 但许多关键机制仍然不清楚。最近, 随着快速发展的单一分子技术, 一些机制已经解决了^1,2,3。

单分子荧光显微技术在实时可视化蛋白质-DNA 相互作用中的应用主要取决于荧光检测和荧光探针的发展。对于单个分子研究, 重要的是要用合适的荧光探针来标记感兴趣的蛋白质, 因为荧光检测系统大多是商用的。

荧光蛋白通常用于分子生物学。然而, 低荧光亮度和抗漂白稳定性限制了它在许多单分子检测中的应用。量子点 (Qdots) 是微小的发光纳米粒子⁴。由于其独特的光学特性, Qdots 的亮度为 10-20 倍, 比广泛使用的有机染料⁵倍更稳定。此外, Qdots 有一个大的斯托克斯转移 (励磁和发射峰的位置的区别)⁵。因此, Qdots 可用于长时间观察 (分钟到数小时) 和获取高信噪比的图像, 而不能用于定量测定。

到目前为止, 有两种方法来标记一个目标蛋白与 Qdots 网站-特别是: 标记与 Qdot 共轭的主要或次级抗体^6,7,8;或者直接用 Qdots 标记靶蛋白, 这是基于生物素与链亲和素^{9、10、11、12、13}之间的强相互作用。链亲和素涂层的 Qdots 在商业上是可利用的。在最近的研究中, 比拉和 Avi 标记蛋白在体内¹⁰的联合表达纯化了高效率的芽酵母中特异的生物素化蛋白。通过以下和优化单分子检测^14,15,16,17, 我们观察了 Qdot 标记蛋白和 DNA 在单一分子水平上的相互作用, 使用TIRFM¹⁰。

在这里, 我们选择萌芽的酵母起源识别复合体 (兽人), 它可以专门识别和绑定到自主复制序列 (ARS), 作为我们的蛋白质的兴趣。下面的协议提出了一个逐步的过程, 以可视化的互动 Qdot 标记兽人与 ARS 使用 TIRFM。介绍了该部位的制备, 特别是修饰的 dna 基质、dna biotinylation、盖玻片清洗和功能化、流动细胞组装和单分子成像。

Protocol

1. ARS317 DNA 基质的制备

1. DNA 基质结构与包装
   1. 用Xho酶消化原生λ DNA;利用含有20个 bp 同源序列的XhoI. 酶在 lambda dna 上的 ARS317, 从萌芽酵母的基因组 dna 中放大543的 bp dna 片段。添加 100 Xho我消化了λ dna 和10的 dna 片段到10µL 同源重组反应系统, 并孵化的反应在37摄氏度为30分钟。
   2. 要包装重组λ DNA, 添加25µL 的 lambda 包装提取物进入重组产品, 并孵化反应在30摄氏度90分钟。然后, 添加额外的25µL 的 lambda 包装萃取物到反应管。继续孵化反应在30°c 90 分钟。
   3. 添加500µL 的无菌稀释缓冲液 (10 毫米三盐酸 (pH 8.3), 100 毫米氯化钠, 10 毫米氯化镁₂) 进入反应体系, 并轻轻地将管子翻转几次。加入25µL 氯仿, 轻轻混合, 贮存在4摄氏度。
   4. 添加100µL 的包装噬菌体和100µL 细菌 LE392MP (培养在 0.8-1.0 使用 LB 培养基添加10毫米 MgSO₄) 进入一个新的管。孵育37°c 15 分钟。
   5. 添加200µL 的噬菌体细菌混合物成4毫升 oftop 琼脂 (LB 培养基 + 0.7% 琼脂 + 10 毫米 MgSO₄, 冷却到48°c)。立即将管子翻转几次, 然后倒入预热的 (37 °c) LB 板上。
   6. 用 PCR 和测序法在37摄氏度的一夜内孵化出平板, 并筛选出λ-ARS317 斑块。
2. 从液体裂解物的 DNA 基质纯化^11,18
   1. 选择一个牌匾200µL 的无菌 ddH₂O 与10毫米氯化镁₂和 10 nM CaCl₂。与200µL 细菌 LE392MP (在 LB 培养基中培养过夜) 混合, 并在37摄氏度孵化15分钟。
   2. 将噬菌体细菌混合物加入100毫升的 NZCYM (10 克/升新西兰胺, 5 克/升酵母萃取物, 5 克/升氯化钠, 1 克/升 Casamino 水解液, 2 克/升 MgSO₄· 7H₂O) 培养基和培养 7 h 在37°c。加入250µL 的氯仿, 再摇动10分钟。
   3. 把文化转移到一个200毫升的瓶子里。添加5.8 克氯化钠 (1 米最后浓度), 搅拌溶解的手, 并在冰上孵化30分钟。
   4. 离心机在 1.2万 x g 10 分钟在4°c 去除细胞碎片。将上清液收集到200毫升烧瓶中, 加入 10% PEG₈₀₀₀ (米/V)。搅拌用磁力搅拌装置溶解, 在冰上孵育30分钟或更长时间。
   5. 离心机在 1.2万 x g 10 分钟在4°c 沉淀噬菌体。移除上清。
   6. 并用重悬2毫升的噬菌体稀释缓冲液中沉淀。将其转化为15毫升管, 加入10µL RNase (最终浓度为20µg/毫升) 和40µL DNase (最终浓度为5µg/毫升)。孵育37°c 30 分钟。
   7. 添加2毫升0.3 米三盐酸 (pH 9.0), 100 毫米 EDTA + 1.25% SDS, 15 µL 蛋白酶 K (最终浓度为10µg/毫升)。孵育65°c 10 分钟。
   8. 加入2毫升的预冷醋酸钾 (3 米, pH 4.8), 并在冰上孵化管10分钟。
   9. 离心机在 8000 x g 10 分钟在4°c 去除不溶性的材料。
   10. 将异丙醇的0.7x 体积添加到上清。把管子倒过来翻几次, 室温下孵育2分钟。
   11. 离心机在 8000 x g 10 分钟的 RT, 以沉淀 DNA。移除上清。
   12. 以70% 乙醇为原料, 用 8000 x g 离心法清洗 DNA, 取出上清液。
   13. 洗脱的 dna 使用500µL TE 缓冲器 (10 毫米三盐酸, 1 毫米 EDTA, pH 8.0) 轻轻, 并转移到1.5 毫升管 dna。
   14. 用苯酚提取 DNA 两次: 氯仿离心8000克, 10 分钟。
   15. 沉淀与0.7x 容量异丙醇。将管子轻轻翻转, 然后离心机在 8000 x g 处进行10分钟的混合。
   16. 用70% 乙醇洗一次, 并用重悬200µL。测量 DNA 浓度, 并存储在-20 °c 在12.5 µg 整除数。

2. ARS317 DNA Biotinylation

1. phosphorylate 生物素化寡核苷酸 (5 '-AGGTCGCCGCC-甘醇-生物素-3 ') 补充本机λ DNA 的左端, 添加1µL (100 µM) 的寡核苷酸, 7.5 µL₂O, 1 ddH 10x µL 缓冲, 0.5 连接酶µL。孵育反应在37°c 为3小时。
2. 为 phosphorylate λ-ARS317, 添加12.5 µg 的λ ARS317, 3 µL 10x 连接酶缓冲区, µL T4 1 PNK, ddH₂O 到总容积30µL. 孵育反应在37°c 为 3 h。
3. 用 ARS317 对寡核苷酸进行退火, 添加0.5 µL 磷酸化寡核苷酸, 195 µL ddH₂O, µL 10×ligase 缓冲到磷酸化λ-ARS317 管中。轻轻地把管子倒过来, 然后在65摄氏度处孵化5分钟. 关闭块加热器, 让样品冷却到33摄氏度以下的区块。
4. 结扎寡核苷酸与λ ARS317, 添加1µL T4 DNA 连接酶和0.63 µL 的 ATP (200 毫米)。轻轻地把管子倒过来, 在室温下孵化2小时或4摄氏度。储存在4°c 1 月。
   注意: 为了避免分解 DNA, 所有的混合步骤都应该通过轻轻地把管子倒过来, 而不是用吸管混合。

3. 盖玻片清洁和功能化

1. 盖玻片清洗
   1. 将20盖玻片到4个染色罐 (5 盖玻片/罐), 油脂实验30分钟乙醇, 并冲洗盖玻片与超纯 H₂O 3 次。
   2. 油脂实验30分钟, 1 米氢氧化钾 (KOH), 并冲洗盖玻片与超纯 H₂O 3 倍。重复乙醇和 KOH 超声波一次。
   3. 用丙酮油脂实验30分钟, 然后彻底冲洗₂O (至少3次)。
      注: 丙酮必须彻底清除, 清洗与超纯 H₂O, 因为它可能会导致爆炸时, 有机溶剂 (如丙酮) 混合与食人鱼解决方案错误¹⁴。
   4. 将盖玻片放入食人鱼溶液中 (3:1 混合物 H₂,₄和 30% H₂O₂) 和孵化在95°c 为 1 H。
      注意: 食人鱼溶液具有高度的能量和侵蚀性, 所以小心使用。当准备食人鱼溶液, 添加50毫升的 h₂O₂第一个到500毫升玻璃烧杯, 然后添加150毫升的 h₂, 所以₄慢慢地进入烧杯。
   5. 用超纯 H₂O 5 倍冲洗盖玻片。然后用超纯 h₂o 彻底清洗每个盖玻片, 使用3烧杯填充超纯₂o, 用纸张从盖玻片边缘干燥盖玻片。将盖玻片放入染色罐中, 将盖玻片彻底干燥110摄氏度烤箱30分钟。
      1. 用甲醇冲洗盖玻片, 再将染色罐放入110摄氏度烤箱中, 使盖玻片彻底干燥。
         注: 彻底烘干盖玻片是非常重要的, 因为 APTES 在水¹⁹的存在下会有许多可能的表面结构。
2. 盖玻片功能化
   1. 将70毫升的硅烷溶液 (93% 甲醇, 5% 醋酸和 2% APTES) 加入每个罐子, 拧紧瓶盖, 在室温下一夜之间离开瓶子。
   2. 清洗和干燥的盖玻片, 如步骤3.1.5 所述, 除了干燥盖玻片彻底使用氮气, 而不是把它们放在烤箱。
   3. 将150毫克的 mPEG (甲氧基聚乙二醇) 和6毫克的生物素 PEG (生物素-聚乙二醇) 分解成1毫升的0.1 米新鲜 NaHCO₃ (pH 8.2)。然后离心机在 17, 000 x g 1 分钟, 以消除不溶钉。
      注: 新制作的 NaHCO₃准备就绪;没有必要调整它的 pH 值。
   4. 把硅烷化盖玻片放在盒子里, 把两个小盖玻片放在硅烷化盖玻片两端的顶部。吸管100µL 的 PEG 溶液在硅烷化盖玻片的中心, 并放置另一个硅烷化盖玻片在顶部。
   5. 添加一些超纯 H₂O 在盒子里, 以保持潮湿, 并孵化的盖玻片与 PEG 溶液至少3小时在黑暗中。夜间孵化也能奏效。
   6. 分离盖玻片对, 保持功能面面朝上, 广泛使用超纯 H₂O 冲洗盖玻片, 用氮气干燥。
   7. 使用标记笔标记盖玻片在一个角落的功能性一侧, 保持功能性侧面朝上, 把它们放在盒子里, 把盒子存放在真空干燥中1月。
   8. 要储存盖玻片一段较长的时间, 将一个盖玻片成一个50毫升管钻孔, 在其帽上, 然后把管放入一个塑料袋, 并密封袋使用真空封口机。这样, 盖玻片可以储存在-20 °c 约3月。

4. 流动单元组件

1. 使用冲床在双面胶带 (30 毫米 x 12 毫米) 的中心处切割15毫米 x 2 毫米通道。
2. 将双面胶带的纸侧剥离, 并将其粘贴到两个孔的玻璃滑梯上。按下以除去气泡。根据我们的经验, 通过剥离纸侧比双面胶带的塑料面更容易去除气泡。
3. 使用菱形玻璃抄写器将功能化的盖玻片 (60 毫米 x 24 毫米) 切成四片 (30 毫米 x 12 毫米), 并用氮气去除碎片。记住要保持功能化面朝上。
4. 剥离双面胶带的塑料面, 并将幻灯片粘贴到功能化的盖玻片上。轻轻按压, 去除盖玻片和胶带之间的气泡。彻底去除气泡可以防止流电池在泵浦时泄漏。
5. 将入口和出口油管分别插入小孔和大洞中。用环氧树脂固定油管。
6. 用注射器手动将20µL 的链亲和素 (0.2 毫克/毫升) 泵入流动细胞, 在 RT 中孵育10分钟。然后将¹⁰的缓冲液塞进流动单元以取代链亲和素, 并保持室温。

5. 单分子可视化

1. 利用 532 nm 激光和 640 nm 激光同时激发荧光显微镜试验滑动 #1, 获得红、远红色与 A5 的焦对准。产生分裂光学的双波长图像 (见材料表)。
2. 将流动细胞放在显微镜上, 将其出口油管连接到一个长油管, 连接10毫升弹簧, 安装在自动输液/提款可编程泵上。
   注: 在下面提到的流动单元中, 泵浦缓冲器意味着从流动单元的入口管中提取缓冲液到注射器。
3. 泵阻塞缓冲器在500µL/分钟进入流单元, 以快速去除空气, 并确保流单元中的缓冲区畅通。然后将阻塞缓冲器在200µL/分钟内泵入流动单元, 翻转出口油管, 彻底去除进气管和流动单元中的气泡。
   注: 在使用前至少15分钟, 所有泵入流动单元的缓冲器都应脱气在真空干燥中。
4. 将生物素化 ARS317 DNA 的0.5 µL 添加到阻塞缓冲器的80µL 中, 并将其泵入流单元25µL/分钟2分钟。然后用200µL 的阻塞缓冲器以50µL/分钟的速率冲洗 ARS317 DNA。
5. 以50µL/分钟的速率泵送200µL 的绑定缓冲区¹⁰ , 以删除流单元格中的阻塞缓冲区。
6. 添加0.2 µL 链亲和素涂层 Qdot₇₀₅ (1 µM) 和0.2 µL 的生物素化兽人 (1.2 µM) 成管, 并在室温下孵化5分钟。然后在管子里加入20µL 的结合缓冲器, 放在冰上。兽人-Qdot₇₀₅的最终浓度约为 10 nM。
7. 添加2µL 的兽人-Qdot₇₀₅ (10 nM), 1 µL 的德勤 (100 毫米), 1 µL 的 ATP (200 毫米) 到96µL 的绑定缓冲区。兽人-Qdot₇₀₅的最终浓度是 0.2 nM。
8. 泵20µL 0.2 nM 兽人-Qdot₇₀₅以10µL/分钟的速度进入流动细胞。从过度的兽人-Qdot₇₀₅中冲出, 使用200µL 的绑定缓冲区, 速度为100µL/分钟。然后将30纳米 SYTOX 橙的粘接缓冲器注入到流动细胞中, 以100µL/分钟的速率染色 DNA 基质。
9. 利用 405 nm 激光和 532 nm 激光, 激发兽人-Qdot₇₀₅信号和 SYTOX 橙色染色的 DNA 信号。用四波段带通滤波器 (FF01-446/510/581/703-25) 同时观察100µL/分钟的信号, 用100毫秒的 EM CCD 记录图像。从不同的字段收集20个图像栈。

6. 数据分析

1. 使用斐济软件裁剪图像的新插件, 这是由我们自己修改的图像插件 (OI_cut_RGBmerge) 开发的美国加州大学旧金山分校的实验室。
   1. 将一叠图像 (512 x 512 像素) 裁剪成两叠图像 (256 x 256 像素)。一个是532纳米激光刺激的结果, 另一个是405纳米激光令人兴奋的结果。
2. 使用斐济-图像栈 Z 项目 (平均强度) 处理61序列图像。
3. 测量 dna 的长度 (l_dna) 和距离从兽人-Qdot₇₀₅ (l_兽人) 的网站上绑定 dna 到 dna 的拴端手动。
4. 用 excel 计算 l_兽人/l_DNA的结果, 用 R 法分析数据, 然后创建直方图, 拟合高斯分布。

Results

为了可视化 Qdot 标记兽人与 ARS 之间的相互作用, 我们首先构造了λ-ARS317 DNA 基底。通过同源重组将含有 ARS317 的 dna 片段集成到XhoI. (33.5 kb) 的原生λ dna 中 (图 1A)。重组产物采用提取物包装, 在 LB 板上培养包装的噬菌体颗粒 (图 1B)。用 PCR 法筛选阳性噬菌体斑块, 并经测序证实 (图 1C)。ARS317 DNA 从液体裂解物中纯化 (图 1D)。

对目标型 TIRFM 进行了单分子成像检测 (图 2)。通过标记的生物素化兽人与近1:1 摩尔比链亲和素涂层 Qdot...

Discussion

在这里, 我们提出了一个协议, 以观察 Qdot 标记蛋白和现场特异修饰的λ DNA 的相互作用, 使用 TIRFM 在一个流动细胞。必要的步骤包括对 dna 基质进行特定地点的修饰、dna biotinylation、盖玻片清洁和功能化、流动细胞制备和单分子成像。有两个要点值得注意。首先, 所有与λ DNA 有关的步骤都应该轻轻地操纵, 以减少任何可能的伤害,例如避免反复吹打的混合。第二, 确保盖玻片的清洁程度, 以尽量减少其背景噪音是非常重要的。在盖玻片清洗和功能化过程中, 水应达到超纯水平, 空气应无粉尘。最好在干净的长凳上进行盖玻片功能化和流动细胞组装。

在用于研究蛋白质-DNA 相互作用的单分子实验中, λ dna 是一个适当的基质, 有几个优点²⁰。λ DNA 是足够长, 可以很容易地观察和允许记录蛋白质运动, 在一个单一的分子实验。此外, ssDNA 悬垂允许许多设计的盖玻片的λ DNA 的玻璃。在本研究中, 我们提出一种在λ dna 的特定部位插入外源 dna 片段的方法。因此, 各种用户可定义的 d...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lambda DNA	New England Biolabs	N3011	Store 25 μL 等分试样在 -20 ºC。
XhoI 酶	Thermo Fisher Scientific	FD0694
快速融合克隆试剂盒	Biotool	B22611
MaxPlax Lambda 包装提取物	Epicentre	MP5110	细菌菌株 LE392MP 包含在此包装中。
MgSO4	国药化学试剂有限公司	10013092	任何品牌都可以接受。
Tris	Amresco	0497-5KG
氯化钠	北京化工厂	N/A	任何品牌都可以接受。
MgCl2	国药化学试剂有限公司	10012818
氯仿	北京化工	N/A	任何品牌均可接受。
NZ-胺	Amresco	J853-250G
酪蛋白氨基酸	Sigma-Aldrich	22090-500G
PEG8000	Beyotime	ST483
力搅拌仪	IKA	KMO2 碱性
15 mL Eppendorf 管	Eppendorf	30122151	15 mL，无菌，散装，500 个
Rnase	SIGMA	R4875-100MG
Dnase	SIGMA	D5319-500UG
蛋白酶 K	Amresco	0706-100MG
生物素化引物	Thermo Fisher Scientific	N/A
T4 DNA 连接酶、T4 DNA 连接酶、反应缓冲液 （10x）	New England Biolabs	M0202
盖玻片	Thermo Fisher Scientific	22266882
国	试剂有限公司	10009259
氢氧化钾（KOH）	Sigma-Aldrich	306568-100G
丙酮	Thermo Fisher Scientific	A949-4
H2SO><4	国药集团化学试剂有限公司	80120891	硫酸
H2O2	国药集团化学试剂有限公司	10011218	30%过氧化氢
甲醇	Sigma-Aldrich	322415-2L
乙酸	Sigma-Aldrich	V900798
APTES	Sigma-Aldrich	A3648
mPEG< / > （甲氧基-聚乙二醇）	Lysan	mPEG-SVA-5000
生物素-PEG （生物素-聚乙二醇）	Lysan	生物素-PEG-SVA-5000
NaHCO3	Sigma-Aldrich	31437-500G
真空干燥器	天津科亿隆实验设备有限公司	IPC250-1
真空封口机	MAGIC SEAL	WP300
金刚石尖头玻璃划线	ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES	70036
载玻片	Sail 品牌	7101
入口管	SCI （Scientific Commodties INC.）	BB31695-PE/2	内径 0.38 mm;外径 1.09 mm。
出口管	SCI （Scientific Commodties INC.）	BB31695-PE/4	内径 0.76 mm;外径 1.22 mm。
双面胶带	Sigma-Aldrich	GBL620001-1EA
环氧树脂	LEAFTOP	9005	5 分钟环氧树脂
链霉亲和素	Sigma-Aldrich	S4762
荧光显微镜	奥林巴斯	IX71
输液/抽出 可编程泵	佛仪器	70-4504
532 nm 激光	相干	公司 Sapphire-532-50
640 nm 激光器	相干公司	OBIS-640-100
EMCCD 相机	Andor	DU-897E-CS0-BV
W-View Gemini Imaging 分光光学器件	滨松光子学公司 K.K.	A12801-01
TIRF 照明系统	Olympus	IX2-RFAEVA2
60×TIRF 物镜	奥林巴斯	APON60XOTIRF
四边激光二向色性 分光镜	Semrock	Di01-R405/488/ 532/635-25x36
四频带通滤光片	Semrock	FF01-446/510/ 581/703-25
二向色分光镜	Semrock	FF649-Di01-25x36
发射滤光片	Chroma 技术Corp	ET585/65m
发射滤光片	Chroma Technology Corp	ET665lp
FocalCheck 荧光，显微镜测试载玻片 #1	Thermo Fisher Scientific	F36909
SYTOX Orange	Thermo Fisher Scientific	S11368
Qdot705 链霉亲和素偶联物	Thermo Fisher Scientific	Q10163MP	Store在 4 ºC、不要冻结。
ATP	Amresco	0220-25G	制备 200 mM ATP 溶液，使用 ddH2O，将 pH 调节至 7.0，并储存 10 μ;L 等分试样在 -20 ºC。
DTT	Amresco	M109-5G	使用 ddH2O 制备 1 M 溶液，并存储 10 μ;l 等分试样为 -20 ºC。