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方法文章

在单分子水平上观察量子点标记蛋白与位点特异性修饰的λ DNA之间的相互作用

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DOI：

10.3791/57967

⸱

2018年7月17日

 ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Microbial Resources, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, 2Savaid Medical School, University of Chinese Academy of Sciences

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一种利用全内反射荧光显微镜（TIRFM），结合位点特异性修饰的λ DNA底物和量子点标记的蛋白质，研究DNA-蛋白质相互作用的实验方案。

摘要

荧光显微镜 在解析复杂生物过程的单分子机制方面做出了巨大贡献。在研究DNA-蛋白质相互作用的单分子实验中，有两个关键因素需要考虑：一是具有足够长度以便于观察和标记的DNA底物，二是使用合适的荧光探针对蛋白质进行标记。48.5 kb的λ DNA是理想的DNA底物候选。量子点（Qdots）作为一类荧光探针，可实现长时间观测（数分钟至数小时）并获得高质量的图像。本文介绍了一种在单分子水平上研究DNA-蛋白质相互作用的实验方案，包括制备位点特异性修饰的λ DNA以及利用链霉亲和素包被的量子点对目标蛋白质进行标记。为验证该方法的可行性，我们选择出芽酵母中的ORC（复制起点识别复合物）作为目标蛋白，并利用全内反射荧光显微镜（TIRFM）可视化其与ARS（自主复制序列）的相互作用。与其他荧光探针相比，量子点由于具有极高的抗光漂白稳定性，在单分子研究中具有明显优势，但需注意的是，这一特性限制了其在定量分析中的应用。

引言

蛋白质与DNA之间的相互作用对于许多复杂的生物过程至关重要，例如DNA复制、DNA修复和转录。尽管传统方法已揭示了这些过程的一些特性，但许多关键机制仍不清楚。近年来，随着单分子技术的快速发展，部分机制已得到阐明1,2,3。

单分子荧光显微技术在实时观测蛋白质-DNA相互作用方面的应用，主要依赖于荧光检测技术和荧光探针的发展。对于单分子研究而言，使用合适的荧光探针对目标蛋白进行标记至关重要，因为目前荧光检测系统大多可从商业途径获得。

荧光蛋白在分子生物学中被广泛使用。然而，其荧光亮度较低以及对光漂白的稳定性较差，限制了其在许多单分子检测中的应用。量子点（Qdots）是一类微小的发光纳米颗粒4。由于具有独特的光学特性，量子点的亮度比常用的有机染料高10至20倍，稳定性更是高出数千倍5。此外，量子点具有较大的斯托克斯位移（即激发峰与发射峰位置之间的差异）5。因此，量子点可用于长时间观察（数分钟至数小时）并获得高信噪比的图像，但其无法用于定量检测。

迄今为止，已有两种方法可实现目标蛋白与量子点（Qdots）的位点特异性标记：利用量子点偶联物辅助标记 一抗或二抗6,7,8；或直接使用量子点（Qdots）标记目标蛋白，该方法基于生物素与链霉亲和素之间的强相互作用9,10,11,12,13链霉亲和素包被的量子点可从商业途径获得。在我们最近的研究中，通过共表达BirA和Avi标签蛋白，实现了酿酒酵母中位点特异性生物素化蛋白的高效纯化 体内10通过遵循并优化单分子检测方法14,15,16,17我们利用全内反射荧光显微镜在单分子水平上观察了量子点标记的蛋白质与DNA之间的相互作用10.

本文中，我们选择芽殖酵母的起始识别复合物（ORC）作为目标蛋白，该复合物能够特异性识别并结合自主复制序列（ARS）。以下方案详细介绍了利用全内反射荧光显微镜（TIRFM）观察量子点标记的ORC与ARS相互作用的逐步操作流程，内容包括位点特异性修饰的DNA底物的制备、DNA生物素化、盖玻片的清洗与功能化、流动池的组装以及单分子成像。

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方案

1. λ-ARS317 DNA 底物的制备

  1. DNA底物的构建与包装
    1. 消化天然λ DNA XhoI型酶；利用含有上游和下游20 bp同源序列的引物，从芽殖酵母基因组DNA中扩增带有ARS317的543 bp DNA片段 XhoI 酶切位点于 lambda DNA 上。加入 100 ng 的 Xho将λ DNA和10 ng DNA片段加入10 µL同源重组反应体系中，37 °C孵育30分钟。
    2. 将25 µL λ包装提取物加入重组产物中，30 °C孵育反应90分钟。然后向反应管中再加入25 µL λ包装提取物，继续在30 °C孵育反应90分钟。
    3. 加入500 µL无菌稀释缓冲液（10 mM Tris-HCl (pH 8.3)，100 mM NaCl，10 mM MgCl₂）2将反应体系倒置数次以轻轻混匀，加入25 µL氯仿，轻轻混匀后于4 °C保存。
    4. 加入100 µL包装好的噬菌体和100 µL LE392MP细菌（在LB培养基中加入10 mM MgSO₄培养至OD值为0.8 - 1.0）4) 转移至新离心管中，37 °C 孵育 15 分钟。
    5. 将200 µL噬菌体-细菌混合液加入4 mL顶层琼脂（LB培养基 + 0.7%琼脂 + 10 mM MgSO₄）中4，冷却至 48 °C）。立即通过将离心管上下颠倒数次进行混匀，并倾注于预热（37 °C）的 LB 平板上。
    6. 37 °C 下过夜培养平板，并使用 PCR 和测序方法筛选 λ-ARS317 噬菌斑。
  2. 从液体裂解物中纯化DNA底物11,18
    1. 挑取一个噬菌斑至200 µL无菌ddH₂O中2O，含10 mM MgCl2 和 10 nM CaCl2用200 µL过夜培养于LB培养基中的大肠杆菌LE392MP混合，37 °C孵育15分钟。
    2. 将噬菌体-细菌混合物加入100 mL NZCYM培养基（10 g/L NZ-amine，5 g/L 酵母提取物，5 g/L NaCl，1 g/L 酪蛋白氨基酸水解物，2 g/L MgSO₄）中4·7H2O）培养基中于 37 °C 培养 7 小时。向培养物中加入 250 µL 氯仿，再振荡 10 分钟。
    3. 将培养物转移至一个200 mL的锥形瓶中。加入5.8 g NaCl（终浓度为1 M），手动搅拌至溶解，然后在冰上孵育30分钟。
    4. 在 4 °C 条件下以 12,000 × g 离心 10 分钟，以去除细胞碎片。将上清液收集至 200 mL 锥形瓶中，并加入 10% PEG8000 (m/V)。使用磁力搅拌器搅拌至溶解，并在冰上孵育30分钟或更长时间。
    5. 在 4 °C 条件下以 12,000 × g 离心 10 分钟，使噬菌体沉淀。弃去上清液。
    6. 将沉淀重悬于2 mL噬菌体稀释缓冲液中，转移至15 mL离心管，加入10 µL RNase（终浓度为20 µg/mL）和40 µL DNase（终浓度为5 µg/mL），37 °C孵育30分钟。
    7. 加入2 mL 0.3 M Tris-HCl（pH 9.0）、100 mM EDTA + 1.25% SDS，15 µL 蛋白酶K（终浓度为10 µg/mL）。65 °C孵育10分钟。
    8. 加入2 mL预冷的乙酸钾溶液（3 M，pH 4.8），将离心管置于冰上孵育10分钟。
    9. 在 4 °C 条件下以 8,000 x g 离心 10 分钟，以去除不溶性物质。
    10. 加入0.7倍体积 将异丙醇加入上清液中。通过反复倒置离心管数次进行混匀，并在室温（RT）下孵育2分钟。
    11. 在室温下以 8,000 x g 离心 10 分钟，使 DNA 沉淀。移除上清液。
    12. 用70%乙醇以8,000 × g离心10分钟洗涤DNA一次，弃去上清液。
    13. 使用500 µL TE缓冲液（10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA，pH 8.0）轻柔洗脱DNA，并将DNA转移至1.5 mL离心管中。
    14. 使用苯酚:氯仿抽提DNA两次，8,000 g离心10分钟。
    15. 用0.7倍体积沉淀 加入异丙醇。轻轻倒置离心管混匀，于8,000 × g离心10分钟。
    16. 用70%乙醇洗涤一次，重悬于200 µL TE缓冲液中。测定DNA浓度，并分装为12.5 µg等份，于-20 °C保存。

2. λ-ARS317 DNA 生物素标记

  1. 为了磷酸化与天然λ DNA左端互补的生物素标记寡核苷酸（5'-AGGTCGCCGCC-TEG-生物素-3'），在反应体系中加入1 µL（100 µM）寡核苷酸、7.5 µL ddH2O、1 µL 10× 连接酶缓冲液和0.5 µL T4多核苷酸激酶（T4 PNK）。37 °C孵育反应体系3小时。
  2. 为了磷酸化λ-ARS317，向反应体系中加入12.5 µg λ-ARS317、3 µL 10× 连接酶缓冲液、1 µL T4 PNK，并用ddH2O补足至总体积30 µL。37 °C孵育反应体系3小时。
  3. 为了将寡核苷酸与λ-ARS317退火，取0.5 µL磷酸化后的寡核苷酸、195 µL ddH2O和25 µL 10×连接酶缓冲液，加入已磷酸化的λ-ARS317管中。通过轻轻翻转离心管混匀，65 °C孵育5分钟。关闭金属浴，让样品在金属浴中自然冷却至33 °C以下。
  4. 为了将寡核苷酸与λ-ARS317连接，加入1 µL T4 DNA连接酶和0.63 µL ATP（200 mM）。通过轻轻翻转离心管混匀，室温孵育2小时或4 °C过夜。4 °C保存可稳定存放1个月。
    注意：为避免DNA断裂，所有混匀步骤均应通过轻轻翻转离心管完成，切勿使用移液器吹打混匀。

3. 盖玻片的清洗与功能化

  1. 盖玻片清洗
    1. 将20个盖玻片放入4个染色缸中（每缸5个），在乙醇中超声处理30分钟，并用超纯水冲洗盖玻片2O 3 次。
    2. 用1 M氢氧化钾（KOH）超声处理30分钟，然后用超纯水冲洗盖玻片2O 3 次。重复乙醇和KOH超声处理一次。
    3. 用丙酮超声处理30分钟，然后用超纯水冲洗2O 彻底清洗（至少 3 次）。
      注意：必须用超纯水充分冲洗以彻底去除丙酮。2O，因为有机溶剂（如丙酮）若误与piranha溶液混合，可能引起爆炸14.
    4. 将盖玻片放入 piranha 溶液（H₂SO₄:H₂O₂ = 3:1）中2SO4 和 30% H2O2）并在95 °C下孵育1小时。
      注意：Piranha溶液具有强氧化性和腐蚀性，使用时需格外小心。配制Piranha溶液时，应将50 mL H₂SO₄缓慢加入到适当容器中，随后在充分搅拌和冷却条件下，缓慢加入10 mL H₂O₂。2O2 首先倒入一个500 mL玻璃烧杯中，然后加入150 mL H2SO4 缓慢倒入烧杯中。
    5. 用超纯水冲洗盖玻片2O 5次。然后用超纯水洗涤每张盖玻片2用三个盛有超纯水的烧杯彻底清洗2O，并从盖玻片边缘用纸巾吸干。将盖玻片放入染色缸中，并在110 °C烘箱内彻底干燥30分钟。
      1. 用甲醇冲洗盖玻片，并将染色缸再次放入110 °C烘箱中，以彻底干燥盖玻片。
        注意：彻底干燥盖玻片非常重要，因为一旦存在水，APTES 会形成大量可能的表面结构19.
  2. 盖玻片功能化
    1. 向每个罐中加入70 mL硅烷溶液（93%甲醇、5%乙酸和2% APTES），拧紧盖子，于室温下静置过夜。
    2. 按照步骤3.1.5所述清洗盖玻片，但干燥时使用氮气彻底吹干，而不是将盖玻片放入烘箱中。
    3. 将150 mg mPEG（甲氧基-聚乙二醇）和6 mg 生物素-PEG（生物素-聚乙二醇）溶解于1 mL 新配制的0.1 M NaHCO₃溶液中3 （pH 8.2）中充分混匀，然后在17,000 × g离心1分钟，以去除不溶性聚乙二醇（PEG）。
      注意：新配制的 NaHCO₃ 溶液必须在配制后 1 小时内使用。3 已准备就绪，无需调节其pH值。
    4. 将硅烷化盖玻片放入盒中，并在硅烷化盖玻片两端的顶部各放置一片小盖玻片。用移液器吸取 100 µL PEG 溶液滴加在硅烷化盖玻片中央，再将另一片硅烷化盖玻片盖在上面。
    5. 加入一些超纯H2在盒子中加入 O 以保持湿度，并在避光条件下用 PEG 溶液孵育盖玻片至少 3 小时。过夜孵育亦可。
    6. 分离盖玻片对，保持功能化表面朝上，用超纯水冲洗盖玻片2用氮气广泛吹干。
    7. 用记号笔在盖玻片的功能化面的一个角落做标记，保持功能化面朝上，将盖玻片放入盒中，并将盒子置于真空干燥器中保存1个月。
    8. 若需长期保存盖玻片 时间，将一张盖玻片放入其管盖上钻有一个孔的50 mL离心管中，然后将该离心管放入塑料袋，使用真空封口机密封塑料袋。通过此方法，盖玻片可在-20 °C保存约3个月。

4. 流通池组装

  1. 使用打孔器在双面胶带（30 mm × 12 mm）中央切割出一条 15 mm × 2 mm 的通道。
  2. 撕去双面胶带的纸面，将其粘贴在带有两个孔的载玻片上，并压紧以去除气泡。根据我们的经验，相比撕去塑料面，撕去纸面更容易去除气泡。
  3. 使用金刚石尖玻璃刻刀将一块功能化盖玻片（60 mm × 24 mm）切割成四块（每块 30 mm × 12 mm），并用氮气吹去碎屑。注意始终保持功能化面朝上。
  4. 撕去双面胶带的塑料面，将载玻片贴合到功能化盖玻片上，轻轻按压以去除盖玻片与胶带之间的气泡。彻底去除气泡可防止缓冲液注入时流动池发生泄漏。
  5. 将进样管和出样管分别插入小孔和大孔中，并使用环氧树脂固定管路。
  6. 手动使用注射器将 20 µL 链霉亲和素（0.2 mg/mL）泵入流动池，室温孵育 10 分钟。随后泵入封闭缓冲液10以替换链霉亲和素，并在室温下保持。

5. 单分子可视化

  1. 使用532 nm激光和640 nm激光同时激发，在荧光显微镜测试载玻片#1上获得红色和远红光的焦点对齐。利用分光光学元件生成双波长图像（见材料表）。
  2. 将流动池放置在显微镜上，并将其出口管路连接至更长的管路，该管路与安装在自动推注/抽吸程序泵上的10 mL注射器相连。
    注：下文提到的将缓冲液泵入流动池，是指从流动池的进样管路将缓冲液抽吸至注射器中。
  3. 以500 µL/min的速度将封闭缓冲液泵入流动池，以快速去除空气，并确保流动池内的缓冲液无堵塞。然后以200 µL/min的速度继续泵入封闭缓冲液，并翻转出口管路，彻底清除进样管路和流动池中的气泡。
    注：所有泵入流动池的缓冲液在使用前均应在真空干燥器中脱气至少15分钟。
  4. 将0.5 µL生物素标记的λ-ARS317 DNA加入80 µL封闭缓冲液中，以25 µL/min的速度泵入流动池，持续2分钟。随后以50 µL/min的速度用200 µL封闭缓冲液冲洗λ-ARS317 DNA。
  5. 以50 µL/min的速度泵入200 µL结合缓冲液10，以去除流动池中的封闭缓冲液。
  6. 将0.2 µL链霉亲和素包被的Qdot705（1 µM）和0.2 µL生物素标记的ORC（1.2 µM）加入同一管中，在室温下孵育5分钟。然后向管中加入20 µL结合缓冲液，并将管置于冰上。ORC-Qdot705的终浓度约为10 nM。
  7. 将2 µL ORC-Qdot705（10 nM）、1 µL DTT（100 mM）和1 µL ATP（200 mM）加入96 µL结合缓冲液中。ORC-Qdot705的终浓度为0.2 nM。
  8. 以10 µL/min的速度将20 µL 0.2 nM ORC-Qdot705泵入流动池。随后以100 µL/min的速度用200 µL结合缓冲液冲洗过量的ORC-Qdot705。然后以100 µL/min的速度将含30 nM SYTOX Orange的结合缓冲液泵入流动池，对DNA底物进行染色。
  9. 分别使用405 nm激光和532 nm激光激发ORC-Qdot705信号和SYTOX Orange染色的DNA信号。在100 µL/min流速下，使用四通道带通滤光片（FF01-446/510/581/703-25）同时观察信号，并通过EM-CCD以每帧100 ms的速度采集图像。从不同视野采集20组图像堆栈。

6. 数据分析

  1. 使用 Fiji 软件及我们基于加州大学旧金山分校 Ron Vale 博士实验室开发的 Image 插件（OI_cut_RGBmerge）自行修改的新插件对图像进行裁剪。
    1. 将一组图像序列（512 × 512 像素）裁剪为两组图像序列（256 × 256 像素），其中一组为 532 nm 激光激发结果，另一组为 405 nm 激光激发结果。
  2. 使用 Fiji-Image-Stacks-Z 投影（平均强度）处理 61 张连续图像。
  3. 手动测量 DNA 长度（LDNA）以及 ORC-Qdot705 结合位点至 DNA 固定端的距离（LORC）。
  4. 使用 Excel 计算 LORC/LDNA 的比值，利用 R 语言通过自助法（bootstrap method）分析数据，随后绘制直方图并拟合高斯分布。

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结果

为了可视化Qdot标记的ORC与ARS之间的相互作用，我们首先构建了λ-ARS317 DNA底物。通过同源重组，将包含ARS317的DNA片段插入到天然λ DNA的XhoI位点（33.5 kb）（图1A）。利用提取物对重组产物进行包装，并将包装后的噬菌体颗粒培养在LB平板上（图1B）。通过PCR筛选阳性噬菌斑，并通过测序确认（图1C）。从液体裂解液中纯化获得λ-ARS317 DNA（图1D）。

单分子成像实验在物镜型全内反射荧光显微镜（TIRFM）系统上进行（图2）。通过快速以接近1:1的摩尔比将生物素化的ORC与链霉亲和素包被的量子点（Q...

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讨论

本文介绍了一种利用流动池中的全内反射荧光显微镜（TIRFM）观察量子点标记蛋白与位点特异性修饰的λ DNA之间相互作用的实验方案。必要步骤包括DNA底物的位点特异性修饰、DNA生物素标记、盖玻片的清洗与功能化、流动池的制备以及单分子成像。需注意两个关键点：第一，所有涉及λ DNA的操作均应轻柔进行，以减少可能的损伤，例如，避免反复上下吹打混合。第二，必须确保盖玻片足够洁净，以最大限度降低背景噪声。在盖玻片清洗与功能化过程中，所用水应达到超纯级别，环境空气应无尘。建议在超净工作台中进行盖玻片功能化及流动池组装。

在研究蛋白质-DNA相互作用的单分子实验中，λ DNA是一种具有多种优势的合适底物20。λ DNA足够长，便于观察，并可在单分子实验中记录蛋白质在其上的运动。此外，其单链DNA突出端为将λ DNA锚定在玻璃盖玻片上提供了多种设计可能。本研究中，我们介绍了一种将外源DNA片段插入λ DNA特定位点的方法。因此，各种可自定义的DNA片段均可被整合到λ DNA中。修饰后的λ DNA可从液体裂解物中大量纯化，便于开展单...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢弗朗西斯·克里克研究所的Hasan Yardimci博士和Sevim Yardimci博士在单分子实验中提供的帮助，感谢哥伦比亚大学Eric C. Greene实验室的Daniel Duzdevich博士、北京大学的孙育杰博士以及清华大学的陈春来博士在讨论中提供的有益建议。本研究得到了国家自然科学基金（31371264、31401059）、中国科学院交叉创新团队项目以及英国皇家学会牛顿高级学者基金（NA140085）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
λDNANew England BiolabsN3011将 25 μL 分装液于 -20 ºC 保存。
XhoI 酶Thermo Fisher ScientificFD0694
Quick-fusion 克隆试剂盒BiotoolB22611
MaxPlax Lambda
包装提取物		EpicentreMP5110本包装包含细菌菌株 LE392MP
。
MgSO4国药集团化学试剂有限公司10013092任何品牌均可接受。
TrisAmresco0497-5KG
NaCl北京化学试剂厂N/A任何品牌均可接受。
MgCl2国药集团化学试剂有限公司10012818
氯仿北京化学试剂厂N/A任何品牌均可接受。
NZ-amineAmrescoJ853-250G
酪蛋白氨基酸Sigma-Aldrich22090-500G
PEG8000BeyotimeST483
磁力搅拌装置IKAKMO2 basic
15 mL Eppendorf 管Eppendorf3012215115 mL，无菌，散装，500 个
RnaseSIGMAR4875-100MG
DnaseSIGMAD5319-500UG
蛋白酶 KAmresco0706-100MG
生物素标记引物Thermo Fisher ScientificN/A
T4 DNA 连接酶，T4 DNA 连接酶反应缓冲液（10×）New England BiolabsM0202
盖玻片Thermo Fisher Scientific22266882
乙醇国药集团化学试剂有限公司10009259
氢氧化钾（KOH）Sigma-Aldrich306568-100G
丙酮Thermo Fisher ScientificA949-4
H2SO4国药集团化学试剂有限公司80120891硫酸
H2O2国药集团化学试剂有限公司1001121830% 过氧化氢
甲醇Sigma-Aldrich322415-2L
乙酸Sigma-AldrichV900798
APTESSigma-AldrichA3648
mPEG
（甲氧基-聚乙二醇）		LysanmPEG-SVA-5000
生物素-PEG
（生物素-聚乙二醇）		LysanBiotin-PEG-SVA-5000
NaHCO3Sigma-Aldrich31437-500G
真空干燥器天津市亿隆实验设备分公司IPC250-1
真空封口机MAGIC SEALWP300
金刚石尖玻璃刻线笔ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES70036
载玻片Sail Brand7101
进样管SCI（Scientific Commodities INC.）BB31695-PE/2内径 0.38 mm；外径 1.09 mm。
出样管SCI（Scientific Commodities INC.）BB31695-PE/4内径 0.76 mm；外径 1.22 mm。
双面胶带Sigma-AldrichGBL620001-1EA
环氧树脂LEAFTOP9005五分钟固化环氧树脂
链霉亲和素Sigma-AldrichS4762
荧光显微镜OlympusIX71
输注/抽取
可编程泵		Harvard apparatus70-4504
532 nm 激光器CoherentSapphire-532-50
640 nm 激光器CoherentOBIS-640-100
EMCCD 相机AndorDU-897E-CS0-BV
W-View Gemini 成像
分光光学元件		滨松光子学株式会社A12801-01
TIRF 照明系统OlympusIX2-RFAEVA2
60×TIRF 物镜OlympusAPON60XOTIRF
四通道激光二向色
分束器		SemrockDi01-R405/488/
532/635-25x36
四通道带通滤光片SemrockFF01-446/510/
581/703-25
二向色分束器SemrockFF649-Di01-25x36
发射滤光片Chroma Technology CorpET585/65m
发射滤光片Chroma Technology CorpET665lp
FocalCheck 荧光显微镜测试载玻片 #1Thermo Fisher ScientificF36909
SYTOX OrangeThermo Fisher ScientificS11368
Qdot705 链霉亲和素偶联物Thermo Fisher ScientificQ10163MP4 ºC 保存，切勿冷冻。
ATPAmresco0220-25G用 ddH2O 配制 200 mM ATP 溶液，调节 pH 至 7.0，分装 10 μL 于 -20 ºC 保存。
DTTAmrescoM109-5G用 ddH2O 配制 1 M 溶液，分装 10 μL 于 -20 ºC 保存。

参考文献

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单分子成像DNA-蛋白质相互作用量子点标记λ DNA底物位点特异性修饰全内反射荧光显微镜流动池组装链霉亲和素包被的量子点ORC Qdot705标记SYTOX Orange染色
在单分子水平上观察量子点标记蛋白与位点特异性修饰的λ DNA之间的相互作用
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