方法文章

在单分子水平上观察量子点标记蛋白与位点特异性修饰的λ DNA之间的相互作用

DOI：

10.3791/57967

⸱

2018年7月17日

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1State Key Laboratory of Microbial Resources, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, 2Savaid Medical School, University of Chinese Academy of Sciences

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

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本文介绍了一种利用全内反射荧光显微镜（TIRFM），结合位点特异性修饰的λ DNA底物和量子点标记的蛋白质，研究DNA-蛋白质相互作用的实验方案。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

荧光显微镜 在解析复杂生物过程的单分子机制方面做出了巨大贡献。在研究DNA-蛋白质相互作用的单分子实验中，有两个关键因素需要考虑：一是具有足够长度以便于观察和标记的DNA底物，二是使用合适的荧光探针对蛋白质进行标记。48.5 kb的λ DNA是理想的DNA底物候选。量子点（Qdots）作为一类荧光探针，可实现长时间观测（数分钟至数小时）并获得高质量的图像。本文介绍了一种在单分子水平上研究DNA-蛋白质相互作用的实验方案，包括制备位点特异性修饰的λ DNA以及利用链霉亲和素包被的量子点对目标蛋白质进行标记。为验证该方法的可行性，我们选择出芽酵母中的ORC（复制起点识别复合物）作为目标蛋白，并利用全内反射荧光显微镜（TIRFM）可视化其与ARS（自主复制序列）的相互作用。与其他荧光探针相比，量子点由于具有极高的抗光漂白稳定性，在单分子研究中具有明显优势，但需注意的是，这一特性限制了其在定量分析中的应用。

引言

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蛋白质与DNA之间的相互作用对于许多复杂的生物过程至关重要，例如DNA复制、DNA修复和转录。尽管传统方法已揭示了这些过程的一些特性，但许多关键机制仍不清楚。近年来，随着单分子技术的快速发展，部分机制已得到阐明1,2,3。

单分子荧光显微技术在实时观测蛋白质-DNA相互作用方面的应用，主要依赖于荧光检测技术和荧光探针的发展。对于单分子研究而言，使用合适的荧光探针对目标蛋白进行标记至关重要，因为目前荧光检测系统大多可从商业途径获得。

荧光蛋白在分子生物学中被广泛使用。然而，其荧光亮度较低以及对光漂白的稳定性较差，限制了其在许多单分子检测中的应用。量子点（Qdots）是一类微小的发光纳米颗粒4。由于具有独特的光学特性，量子点的亮度比常用的有机染料高10至20倍，稳定性更是高出数千倍5。此外，量子点具有较大的斯托克斯位移（即激发峰与发射峰位置之间的差异）5。因此，量子点可用于长时间观察（数分钟至数小时）并获得高信噪比的图像，但其无法用于定量检测。

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方案

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1. λ-ARS317 DNA 底物的制备

  1. DNA底物的构建与包装
    1. 消化天然λ DNA XhoI型酶；利用含有上游和下游20 bp同源序列的引物，从芽殖酵母基因组DNA中扩增带有ARS317的543 bp DNA片段 XhoI 酶切位点于 lambda DNA 上。加入 100 ng 的 Xho将λ DNA和10 ng DNA片段加入10 µL同源重组反应体系中，37 °C孵育30分钟。
    2. 将25 µL λ包装提取物加入重组产物中，30 °C孵育反应90分钟。然后向反应管中再加入25 µL λ包装提取物，继续在30 °C孵育反应90分钟。
    3. 加入500 µL无菌稀释缓冲液（10 mM Tris-HCl (pH 8.3)，100 mM NaCl，10 mM MgCl₂）2将反应体系倒置数次以轻轻混匀，加入25 µL氯仿，轻轻混匀后于4 °C保存。
    4. 加入100 µL包装好的噬菌体和100 µL LE392MP细菌（在LB培养基中加入10 mM MgSO₄培养至OD值为0.8 - 1.0）4) 转移至新离心管中，37 °C 孵育 15 分钟。
    5. 将200 µL噬菌体-细菌混合液加入4 mL顶层琼脂（LB培养基 + 0.7%琼脂 + 10 mM MgSO₄）中4，冷却至 48 °C）。立即通过....

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结果

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为了可视化Qdot标记的ORC与ARS之间的相互作用，我们首先构建了λ-ARS317 DNA底物。通过同源重组，将包含ARS317的DNA片段插入到天然λ DNA的XhoI位点（33.5 kb）（图1A）。利用提取物对重组产物进行包装，并将包装后的噬菌体颗粒培养在LB平板上（图1B）。通过PCR筛选阳性噬菌斑，并通过测序确认（图1C）。从液体裂解液中纯化获得λ-ARS317 DNA（图1D）。

单分子成像实验在物镜型全内反射荧光显微镜（TIRFM）系统上进行（图2）。通过快速以接近1:1的摩尔比将生物素化的ORC与链霉亲和素包被的量子点（Q.......

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讨论

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本文介绍了一种利用流动池中的全内反射荧光显微镜（TIRFM）观察量子点标记蛋白与位点特异性修饰的λ DNA之间相互作用的实验方案。必要步骤包括DNA底物的位点特异性修饰、DNA生物素标记、盖玻片的清洗与功能化、流动池的制备以及单分子成像。需注意两个关键点：第一，所有涉及λ DNA的操作均应轻柔进行，以减少可能的损伤，例如，避免反复上下吹打混合。第二，必须确保盖玻片足够洁净，以最大限度降低背景噪声。在盖玻片清洗与功能化过程中，所用水应达到超纯级别，环境空气应无尘。建议在超净工作台中进行盖玻片功能化及流动池组装。

在研究蛋白质-DNA相互作用的单分子实验中，λ DNA是一种具有多种优势的合适底物20。λ DNA足够长，便于观察，并可在单分子实验中记录蛋白质在其上的运动。此外，其单链DNA突出端为将λ DNA锚定在玻璃盖玻片上提供了多种设计可能。本研究中，我们介绍了一种将外源DNA片段插入λ DNA特定位点的方法。因此，各种可自定义的DNA片段均可被整合到λ DNA中。修饰后的λ DNA可从液体裂解物中大量纯化，便于开展单.......

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披露

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作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

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感谢弗朗西斯·克里克研究所的Hasan Yardimci博士和Sevim Yardimci博士在单分子实验中提供的帮助，感谢哥伦比亚大学Eric C. Greene实验室的Daniel Duzdevich博士、北京大学的孙育杰博士以及清华大学的陈春来博士在讨论中提供的有益建议。本研究得到了国家自然科学基金（31371264、31401059）、中国科学院交叉创新团队项目以及英国皇家学会牛顿高级学者基金（NA140085）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
λDNANew England BiolabsN3011将 25 μL 分装液于 -20 ºC 保存。
XhoI 酶Thermo Fisher ScientificFD0694
Quick-fusion 克隆试剂盒BiotoolB22611
MaxPlax Lambda
包装提取物		EpicentreMP5110本包装包含细菌菌株 LE392MP
。
MgSO4国药集团化学试剂有限公司10013092任何品牌均可接受。
TrisAmresco0497-5KG
NaCl北京化学试剂厂N/A任何品牌均可接受。
MgCl2国药集团化学试剂有限公司10012818
氯仿北京化学试剂厂N/A任何品牌均可接受。
NZ-amineAmrescoJ853-250G
酪蛋白氨基酸Sigma-Aldrich22090-500G
PEG8000BeyotimeST483
磁力搅拌装置IKAKMO2 basic
15 mL Eppendorf 管Eppendorf3012215115 mL，无菌，散装，500 个
RnaseSIGMAR4875-100MG
DnaseSIGMAD5319-500UG
蛋白酶 KAmresco0706-100MG
生物素标记引物Thermo Fisher ScientificN/A
T4 DNA 连接酶，T4 DNA 连接酶反应缓冲液（10×）New England BiolabsM0202
盖玻片Thermo Fisher Scientific22266882
乙醇国药集团化学试剂有限公司10009259
氢氧化钾（KOH）Sigma-Aldrich306568-100G
丙酮Thermo Fisher ScientificA949-4
H2SO4国药集团化学试剂有限公司80120891硫酸
H2O2国药集团化学试剂有限公司1001121830% 过氧化氢
甲醇Sigma-Aldrich322415-2L
乙酸Sigma-AldrichV900798
APTESSigma-AldrichA3648
mPEG
（甲氧基-聚乙二醇）		LysanmPEG-SVA-5000
生物素-PEG
（生物素-聚乙二醇）		LysanBiotin-PEG-SVA-5000
NaHCO3Sigma-Aldrich31437-500G
真空干燥器天津市亿隆实验设备分公司IPC250-1
真空封口机MAGIC SEALWP300
金刚石尖玻璃刻线笔ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES70036
载玻片Sail Brand7101
进样管SCI（Scientific Commodities INC.）BB31695-PE/2内径 0.38 mm；外径 1.09 mm。
出样管SCI（Scientific Commodities INC.）BB31695-PE/4内径 0.76 mm；外径 1.22 mm。
双面胶带Sigma-AldrichGBL620001-1EA
环氧树脂LEAFTOP9005五分钟固化环氧树脂
链霉亲和素Sigma-AldrichS4762
荧光显微镜OlympusIX71
输注/抽取
可编程泵		Harvard apparatus70-4504
532 nm 激光器CoherentSapphire-532-50
640 nm 激光器CoherentOBIS-640-100
EMCCD 相机AndorDU-897E-CS0-BV
W-View Gemini 成像
分光光学元件		滨松光子学株式会社A12801-01
TIRF 照明系统OlympusIX2-RFAEVA2
60×TIRF 物镜OlympusAPON60XOTIRF
四通道激光二向色
分束器		SemrockDi01-R405/488/
532/635-25x36
四通道带通滤光片SemrockFF01-446/510/
581/703-25
二向色分束器SemrockFF649-Di01-25x36
发射滤光片Chroma Technology CorpET585/65m
发射滤光片Chroma Technology CorpET665lp
FocalCheck 荧光显微镜测试载玻片 #1Thermo Fisher ScientificF36909
SYTOX OrangeThermo Fisher ScientificS11368
Qdot705 链霉亲和素偶联物Thermo Fisher ScientificQ10163MP4 ºC 保存，切勿冷冻。
ATPAmresco0220-25G用 ddH2O 配制 200 mM ATP 溶液，调节 pH 至 7.0，分装 10 μL 于 -20 ºC 保存。
DTTAmrescoM109-5G用 ddH2O 配制 1 M 溶液，分装 10 μL 于 -20 ºC 保存。

参考文献

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  1. Fu, Y. V., et al. Selective Bypass of a Lagging Strand Roadblock by the Eukaryotic Replicative DNA Helicase. Cell. 146 (6), 930-940 (2011).
  2. Qi, Z., et al. DNA sequence alignment by microhomology sampling during homologous recombination. C....

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重印与许可

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DNA DNA ORC Qdot705 SYTOX Orange

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