方法文章

基于交配的酵母超表达文库筛选

DOI：

10.3791/57978

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2018年7月6日

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1Department of Biological Sciences, Wright State University

本文内容

摘要

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本文提出了一种基于交配的方法, 利用阵列质粒库, 促进萌芽酵母的超表达筛查。

摘要

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发芽酵母作为研究与人类疾病相关的蛋白质的模型被广泛应用。全基因组基因筛选是酵母研究中常用的有力工具。一些神经退行性疾病相关蛋白在酵母中的表达导致细胞毒性和聚集形成, 综述发现这些疾病的患者。在这里, 我们描述了一种筛选肌萎缩侧索硬化相关蛋白 FUS 酵母模型的方法, 以修饰其毒性。这个新的筛选平台不是使用转换, 而是依赖于酵母的交配来引入酵母模型中的粒度排列库。这种交配方法有两个明显的优点: 一是高效;二是将质粒预转换阵列库长期保存为甘油库存, 并可快速应用于其它筛网, 而不需要将劳动密集型的步骤转化为酵母模型。我们展示了这个方法如何能够成功地用于筛选基因, 改变 FUS 的毒性。

引言

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酵母酵母菌在 1基础科学研究中得到广泛应用, 以了解与人类疾病直接相关的细胞过程。此外, 它被用作研究人类疾病相关蛋白的模型有机体, 例如与最常见的神经退行性疾病相关的蛋白质, 包括阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿氏病和肌萎缩症。侧索硬化症 (ALS)2。酵母模型的优点是可以轻松地使用一个基因组范围的屏幕来识别与疾病相关蛋白的毒性相关的细胞通路, 从而对其毒性机制进行深入的研究。一个这样的屏幕被称为一个过度表达的图书馆屏幕, 其中5500酵母基因的排列库被转化为酵母模型, 以确定哪些基因可以修改毒性时抗原。这种筛选方法已成功地应用于多种神经退行性疾病相关蛋白的酵母模型中, 包括亨廷顿氏病的杭丁顿蛋白3、4、5 的α synuclein., Aβ阿尔茨海默氏病6, FUS 和 TDP-43 为 ALS7,8,9。虽然它通常是在高通量的方式10, 最劳动密集型的步骤的屏幕是单独转换5....

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方案

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注: 此处描述的协议用于筛选十96井板中包含的库质粒, 但可以相应地放大或缩小。需要重复该协议以完成整个图书馆的筛选。通常情况下, 每次对10块的图书馆基因进行筛查, 可以得到1人的舒适处理。

1. 96 井酵母转化剂的制备

注意: 此步骤按照前面描述的7、10进行。

  1. 整除5µL (约 50–100) 从阵列质粒库中的质粒 DNA 到圆底96井板的每一井。
    注: 这样一个图书馆的例子是酵母基因过度表达图书馆10。
  2. 接种150毫升的酵母蛋白胨葡萄糖 (YPD) 培养基, 在500毫升的烧瓶中有一个菌落 (2–3毫米直径) 的单倍体酵母菌株 W303α。一夜之间孵化他们在30°c 与震动 (200 转每分钟)。
  3. 第二天早晨, 测量隔夜文化的 od600并且稀释酵母文化到 OD600 = 0.1 在 (至多) 2 L YPD。孵化它在30°c 与震动 (200 转每分钟) 为 ~ 5 h 直到文化到达 OD600 = 0.4–0.6。

2. 酵母转化

  1. 通过填充8无菌250毫升离心机瓶和离心....

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结果

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ALS 相关蛋白 FUS, RNA/DNA 结合蛋白, 以前研究的单倍体酵母7,8。遗传筛选采用基于转化的方法发现了几种抑制 FUS 毒性的酵母基因。其中一个酵母基因的人同源, 后来被证明是有效的抑制毒性的主要神经元细胞和大鼠模型的 ALS13。在这里, 我们使用相同的酵母模型表明, 过度表达的图书馆筛选可以通过交配有效地进行转换。

FUS 对单倍体和双酵母细胞都有毒性
在单倍体细胞的背景下, 对 FUS 的前酵母模型和随后的过度表达文库进行了筛选。以交配为基础的方法工作, FUS 毒性需要证明在双酵母。为此, 我们交配的 FUS 酵母模型在 w303a (交配型 a) 与 w303α转化为空向量 (交配型α)。如

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讨论

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在这里, 我们描述了一个在酵母中执行质粒过度表达筛的协议, 将质粒库引入到酵母模型中。利用这种方法, 可以用同质粒库转化的同一株酵母, 筛选出多种神经退行性疾病蛋白毒性酵母模型。转化过程只需要进行一次, 然后用高效的酵母交配将质粒库引入到查询菌株中。该协议确实依赖于使用机器人设备来分配媒体和斑点酵母培养到琼脂板块。虽然可以在不使用机器人设备的情况下执行该协议, 但这将会耗费更多的时间。该方法成功地用于筛选能改变 FUS 毒性的基因。

我们观察到, FUS 在双倍酵母的背景下毒性较小。这很可能是由于基因复制数量和不同的增长速度的双倍酵母。除非正在研究的表型为交配型或倍性依赖性, 否则毒性的生长表型在单倍体和双酵母中是一致的。因此, 基于交配的方法有望在多种生长表型的酵母模型中得到广泛的应用。然而, 应该验证酵母模型的表型, 以确保在进行这种筛选方法之前, 它仍然存在于双倍的背景中。该方法可用于酵母中多种不同表型的研究, 不限于神经退行性蛋白毒性的研究。此外, 任何含有酵母表达载体的质粒库都可以使用。

在执行屏幕后, 有许多验证化.......

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披露

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作者没有什么可透露的。

致谢

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我们感谢与 Ju 实验室和中实验室的成员进行了深思熟虑的讨论, 以及莱特州立大学的财政支持。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
鲑鱼精子 DNA （SS-DNA）Sigma-Aldrich D1626
YPD 肉汤研究产品国际 （RPI）Y20090
颗粒状琼脂Fisher SciBP97445
D-（+）-葡萄糖研究产品国际 （RPI）G32040
D-（+）-半乳糖研究产品国际 （RPI）G33000
D-（+）-棉子糖五水合物研究产品国际 （RPI）R20500
硫酸铵Fisher SciA702-500
合成尿酸 - 辍学培养基Clontech630416
酵母氨基酸辍学补充剂 - 组氨酸/-尿嘧啶Clontech630422
不含氨基酸和硫酸铵的酵母氮碱研究产品 国际 （RPI）Y20060
二甲基亚砜 （DMSO）Fisher SciS67496
无水醋酸锂Fisher SciAC268640010
聚乙二醇 3350 （PEG-3350）Spectrum Chemical PO125-12KG
96 针复制器 ScinomixSCI-5010-OS
Nunc OmniTrayThermo Sci140156
Corning Costar 96 孔检测板，圆底带盖Fisher Sci07-200-760未处理，无菌
Eppendorf Research plus 多通道移液器EppendorfTI1369005230-300 μl 容量
Fisherbrand Isotemp 数字干浴/块加热器Fisher Sci88-860-023
Eppendorf MixMateEppendorf21-379-00
Eppendorf 5810R 离心机Fisher Sci05-413-112
Avanti J-26 XPI 离心机Beckman393127
MultiFlo FX 多功能分液器BioTek
转子 HDA  歌手乐器

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dujon, B. A., Louis, E. J. Genome diversity and evolution in the budding yeasts (Saccharomycotina). Genetics. 206 (2), 717-750 (2017).
  2. Khurana, V., Lindquist, S. Modelling neurodegeneration in Saccharomyces cerevisiae: why cook with baker's ye....

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重印与许可

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FUS

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