我们介绍一种简单快速的方法，用于制备和分析不同品种萝卜（Raphanus sativus）的N-糖链。
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本文内容
摘要
摘要
近年来，植物中的碳水化合物部分受到广泛关注，因其可能引发交叉反应性、致敏性的免疫应答。此外，碳水化合物结构在植物代谢中也发挥着关键作用。本文介绍一种简便快速的制备与分析方法 N-不同品种萝卜中的糖类Raphanus sativus) 使用一个 N-一种特异性释放植物来源碳水化合物结构的糖苷酶。为实现此目的，将萝卜匀浆的粗三氯乙酸沉淀物用PNGase H处理+，并使用2-氨基苯甲酰胺作为荧光标记物进行标记。标记后的 N-glycan 样品随后通过超高效液相色谱（UPLC）分离和基质辅助激光解吸电离-飞行时间（MALDI-TOF）质谱法进行分析，以实现详细的结构评估，并定量分析萝卜来源的-glycan 相对丰度 N-糖链结构。本方案也可用于分析 N-来自其他多种植物物种的聚糖，可能有助于进一步研究其功能与效应 N-糖链对人类健康的影响。
引言
N植物中的-glycans近年来受到越来越多关注，因为先前的研究已强调 N-glycans 作为可能引发过敏反应的免疫交叉反应潜在来源1,2此前已证明 N植物糖蛋白上的聚糖可能影响其催化活性3,4，热稳定性与折叠5,6 亚细胞定位与分泌7为了将聚糖结构与其相应功能相关联， N-聚糖必须首先通过化学或酶法从糖蛋白中释放。用于释放两者的经典化学方法 N- 和 O-glycans 的方法是β-消除法，该方法通过在碱性条件下处理样品并用硼氢化物还原，生成醛糖醇8然而，该方法无法进行荧光标记，并会导致聚糖结构还原端的单糖单元发生显著降解。基于氢氧化铵/碳酸铵处理的化学去糖基化也是一种常用的替代方法。9这两种化学释放方法均不会降解完整蛋白质，从而可在质谱分析中避免同一质荷比范围内的肽段碎片干扰，实现对未标记糖链混合物的分析。然而，这些方法的一个缺点....
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方案
1. 样品采集
- 购买不同品种的新鲜萝卜（Raphanus sativus L.）。
2. 萝卜中蛋白质的提取
- 取约100 g新鲜萝卜，使用厨房搅拌机匀浆10分钟。
- 将匀浆液转移至50 mL离心管中，在4 °C条件下以14,000 × g离心20分钟，去除不溶性物质。
- 小心将上清液转移至新的50 mL离心管中，并加入等体积的2 M三氯乙酸（TCA）溶液。
注意：加入TCA会使可溶性（糖基化）蛋白质沉淀。 - 在4 °C条件下以14,000 × g离心30分钟，弃去上清液，保留沉淀的（糖基化）蛋白质。
- 用20 mL去离子水洗涤沉淀，在4 °C条件下以14,000 × g离心5分钟，以去除可溶性低聚糖和多糖。
- 重复步骤2.5四次。
- 将沉淀重悬于1 mL去离子水中，转移至新的1.5 mL离心管中。
3. N-糖链的制备
- 将步骤 2.7 中的 50 µL 蛋白质溶液（相当于 5 g 新鲜萝卜）与 0.2 mU 重组 PNGase H+ 在 10 mM 乙酸中混合。
- 将反应混合....
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结果
图1展示了所述实验方案的示意图，包括从萝卜中分离（糖基化）蛋白质、制备N-聚糖、UPLC分析以及对这些组分进行MALDI-TOF-MS分析。图2展示了所分析萝卜品种衍生化N-聚糖的代表性UPLC色谱图。图3展示了利用MALDI-TOF质谱法获得的2AB衍生化N-聚糖结构结果。图4展示了各萝卜品种N-聚糖的定量组成。
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讨论
本文所介绍的方案可用于比较不同品种萝卜的 N-聚糖谱型。与现有方案相比，该方法的一个显著优势在于，N-聚糖的酶解释放与使用 2-AB 进行衍生化反应之间无需更换缓冲液。该操作中最关键的步骤是使用固相萃取（SPE）柱对 N-聚糖进行纯化，因为若未能去除反应混合物中的盐类或其他杂质，可能会对荧光衍生化效率产生不利影响。本文所述方法仅可用于评估不同 N-聚糖的相对丰度；若需进行绝对定量，则需在步骤 2.1 中加入内标物（如麦芽五糖）。
此外，此处使用的衍生化试剂（2-AB）也可替换为2-氨基吡啶（2-AP）或其他衍生化试剂。步骤5.3中获得的N-聚糖衍生物还可通过尺寸排阻色谱法（SEC）、强或弱阴离子交换色谱法（SAX或WAX）或反相高效液相色谱法（HPLC）进行分离（尽管分辨率可能较低）。为进一步验证N-聚糖的结构，可在步骤5.3之后采用逐级外切糖苷酶处理，以更详细地表征N-聚糖的结构。最后，步骤6.8的样品可进一步采用基于MALDI-TOF-MSn<.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作部分得到了中国国家自然科学基金（资助号 31471703、A0201300537 和 31671854，授予 J.V. 和 L.L.；资助号 31470435，授予 G.Y.）以及外国人才千人计划（资助号 JSB2014012，授予 J.V.）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 化学品： | |||
| 三氯乙酸 | SCR，上海 | 80132618 | |
| 冰乙酸 | 华大，广州 | 64-19-7 | |
| 乙腈 | 通用试剂 | G80988C | |
| 三氟乙酸 | 能量化学 | W810031 | |
| 2-氨基苯甲酰胺 | 和翁，天津 | A41900 | |
| 氰基硼氢化钠 | J&K Scientific Ltd | 314162 | |
| 二甲基亚砜 | 华大，广州 | 67-68-5 | |
| 2AB标记的葡聚糖标准品，200 pmol | 安捷伦科技 | AT-5190-6998 | |
| 6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶 | Sigma | 275514 | |
| 仪器/材料： | |||
| 厨房搅拌机 | 小熊，广州 | LLJ-A10T1 | |
| 离心机 | 天美 | CT15RT | |
| 离心浓缩仪 | 华立达，太仓 | LNG-T120 | |
| SPE小柱 | Supelco | Supelclean ENVI Carb SPE小柱 | |
| MALDI-TOF质谱仪 | Bruker | Autoflex | |
| HPLC分析： | |||
| 高回收率HPLC小瓶 | 安捷伦科技 | # 5188-2788 | |
| HPLC系统 | 岛津 | Nexera | |
| HPLC荧光检测器 | 岛津 | RF-20Axs | |
| 柱温箱 | 恒信 | CO-2000 | |
| HPLC色谱柱 | 沃特世 | Acquity UPLC BEH糖分析色谱柱 | 2.1 × 150 mm，1.7 μm粒径 |
| LCMS级水 | 默克密理博 | #WX00011 | |
| LCMS级乙腈 | 默克密理博 | # 100029 | |
| 甲酸 | 阿拉丁 | F112034 | |
| 氨水 | 阿拉丁 | A112080 |
参考文献
- Altmann, F. The Role of Protein Glycosylation in Allergy. International Archives of Allergy and Immunology. 142 (2), 99-115 (2007).
- Van Ree, R., et al. β (1, 2)-xylose and α (1, 3)-fucose residues have a strong contribution in IgE binding to plant glycoallergens. Journal of Biological Chemistry<....
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重印与许可
