通过耳镜观察和行为性拍击惊跳反应验证的大鼠传导性听力损失简易手术诱导方法

摘要

本文介绍了一种通过手术穿刺鼓膜诱导可重复的传导性听力损失的方案，并通过耳镜观察和拍击惊跳行为评估进行验证。

摘要

传导性听力损失（CHL）是人类中常见的一种听力障碍。本实验方案旨在介绍一种在啮齿类动物中诱导传导性听力损失的简单外科手术方法。该方案通过鼓膜穿刺来实现传导性听力损失。手术效果的验证采用耳镜检查和拍手惊跳反应的行为学评估，这两种方法均可重复且可靠，是证明听力损失发生的简便手段。该传导性听力损失造模方法的优势在于其可重复性强，并可根据不同听力损失研究需求灵活调整。通过外科手术诱导传导性听力损失的局限性主要在于操作者需要一定的学习曲线来掌握手术技术，以及对听力学检查的信心。通过传导性听力损失诱导听力障碍，可方便地研究听力损失所引起的神经表现及行为学结果。

引言

儿童和成人听力损失的患病率分别约为19.5%¹和15.2%²。然而，据美国疾病控制与预防中心报告，约有39.3%通过听力筛查发现异常的新生儿未能接受补救性治疗³。听力损失是一种被广泛研究的疾病，而啮齿类动物是研究正常听力及听力相关疾病的一个可靠模型^{4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15}。传导性听力损失（CHL）等听力障碍会导致听觉皮层短期突触抑制增强⁴，从而引起与频率调制检测阈值相关的心理测量斜率变浅⁵。通过手术切除或移位锤骨、鼓膜（TM）穿刺或使用耳塞等方式建立的传导性听力损失模型操作简便，可快速诱导出听力损失模型^{5,14,15,16,17,18}。本实验方案的目标是展示一种在啮齿类动物中简单且可重复的传导性听力损失模型。

本方案成本低廉（≈300 美元即可完成全部工具配置），且可轻松适用于不同的研究目的。大鼠的中耳解剖结构已有详尽评估^{19,20,21,22,23}，手术方法²⁴中耳炎模型^25,26,27 和鼓膜穿孔再生^{16,17,18,28,29,30}，使其成为研究听力损失的理想模型。本文描述了一种简单的小鼠传导性听力损失（CHL）诱导方法，并通过耳镜检查及拍击惊跳反应进行行为学评估以验证CHL的建立，该模型可用于进一步探索听力损失的其他继发性影响。 听力损失。通过手术穿刺鼓膜（TM）来诱导传导性听力损失（CHL）。CHL手术的验证通过耳镜观察鼓膜缺失情况进行判断。行为学评估采用高强度分贝（dB）声压级（SPL）的手掌拍击测试。该方法此前已在多种啮齿类动物中应用。 易于复制，可产生显著的心理测量学差异及神经生理反应的变化^4,5,16,17,18.

方案

本研究及相关操作已获得香港城市大学、香港大学以及香港特别行政区卫生署动物研究伦理委员会的批准。

1. 动物

1. 使用两个月大的 Sprague-Dawley（SD）大鼠（N = 90，200–250 g）。
   注：实验所用啮齿类动物由香港大学认证的实验动物中心提供。
2. 将大鼠饲养在恒定的25 °实验室动物研究单元的温度为 C，相对湿度为60-70%。
3. 将实验大鼠饲养于12小时光照/12小时黑暗循环环境中，自由获取食物和饮用水， 随意.
4. 在进行传导性听力损失（CHL）手术前，至少将啮齿类动物在饲养环境中适应一天。
5. 用镊子夹住啮齿类动物的颈背部皮肤以固定，通过腹腔注射给予氯胺酮和赛拉嗪混合物（剂量分别为80–100 mg/kg和5–10 mg/kg）进行麻醉（以1.0 mL氯胺酮与0.5 mL赛拉嗪混合，作为终浓度）。
   注意：使用1 mL注射器配23-25G针头。按每100 g大鼠体重注射约0.2 mL的剂量，可维持30分钟的麻醉效果。
6. 通过脚趾夹捏测试以确认痛觉反应并验证麻醉效果。若深部脚趾夹捏引起后肢回缩反应，则表明麻醉不充分。

2. 手术准备

1. 手术开始前，将所有器械在高压灭菌器或高温玻璃珠灭菌器中灭菌，并用70%乙醇清洁手术区域。
2. 操作前佩戴乳胶手套并穿上实验服。
3. 在洁净工作台面上铺置无菌手术单（图1A）。
4. 手术前对显微剪刀和耳镜进行灭菌，以最大限度减少耳部感染风险（图1B）。
5. 将显微剪刀和耳镜放置于无菌区域内。
6. 将啮齿类动物置于手术区域，并与术者保持对齐。
7. 进行传导性听力损失（CHL）的手术诱导。

3. 传导性听力损失的手术诱导

1. 将啮齿类动物的尾部和头部摆成俯卧位，头部靠近手术者。
2. 使用耳镜观察啮齿类动物左右耳，确认鼓膜健康（图2a）。在诱导传导性听力损失（CHL）前，需评估每只动物的左右耳，以确认其鼓膜处于健康状态。
3. 抓住耳廓并牵拉外耳道（即耳道、外耳道，以下简称耳道），使其内部因深度增加而变得模糊且呈黑色。此时，耳道应与鼓膜（TM）表面垂直。
   注意：确保耳道现在与鼓膜穿刺路径完全平行，且鼓膜与显微剪刀插入轴线成直角。此时耳道应呈现为无光的黑色管状结构。有时需要将耳道相对于颅骨平面倾斜约15°，以确保手术者的手部操作方向与鼓膜表面垂直。
4. 将显微剪刀从耳道中央缓慢插入，注意避免刮擦或损伤耳道组织，向前推进约≈5 mm，从暗区中心轻柔地穿过鼓膜中央。
   注意：当显微剪刀尖端刺穿鼓膜时，可听到“啪”的一声，由此可确认鼓膜穿孔。该“啪”声在视频中约≈2分52秒处可听见。此声音并非剪刀本身发出，而是鼓膜穿孔的声音。经事后分析测量，该“啪”声比背景声音高出约≈20 dB SPL，由高频麦克风记录所得。实际操作中无需如此精确验证“啪”声，通过耳镜观察即可充分确认。研究者可能需要练习，以确保每次CHL手术过程中均能听到“啪”声。
5. 穿刺鼓膜后立即打开弹簧式显微剪刀，并旋转三圈，以确保锤骨头部从鼓膜处移位（仅在需要锤骨移位时进行此步骤）。
6. 取出显微剪刀，将啮齿类动物置于耳镜下进行观察。
   注意：手术后不应出现明显出血。若发生出血，应实施安乐死，不得继续进行行为学评估。
7. 按上述步骤对另一侧耳进行操作，以诱导双侧CHL。

4. 耳镜观察

1. 使用小直径耳镜通过耳镜检查确认传导性听力损失（CHL）手术是否成功，以观察啮齿类动物的中耳。
2. 在CHL手术前后，均需在耳镜下对每只啮齿类动物进行评估。确保确认鼓膜（TM）术前正常（图2a），术后鼓膜受损（图2b）。
3. 啮齿类动物的术后护理
   1. 将啮齿类动物置于带有保温灯的饲养笼中。
   2. 在诱导CHL后观察啮齿类动物，直至其自行恢复正常体位。
   3. 注射葡萄糖（右旋糖酐/生理盐水）血清以帮助恢复意识，并将动物放回饲养笼中进行恢复。
      注：CHL手术后，使用23G针头和10 mL注射器注射5 mL生理盐水。
   4. 在术后24小时恢复期内，通过肌肉注射给予抗菌药物恩诺沙星（Enrofloxacin）0.05 mg/kg，每日两次。
   5. 术后定期观察啮齿类动物是否有疼痛行为或相关症状。

5. 行为学评估（传导性听力损失诱导的验证）——惊跳反应测试

1. 术后24小时，在耳镜确认后，通过击掌惊跳试验进行行为学评估，以证实传导性听力损失。
2. 将诱导了传导性耳聋的大鼠与正常大鼠分别置于两个相邻的独立笼子中。
3. 将啮齿类动物置于安静的房间内。
4. 站在距离啮齿类动物约0.5米处，以相等的时间间隔进行多次拍手（选择5次拍手，间隔1秒）。
   注意：通过手拍产生的拍手惊吓反应进行测量 ≈ 比背景声音高40 dB SPL，由高频麦克风记录。

结果

对90只大鼠实施了简单的传导性听力损失（CHL）手术，其中2只出现明显出血，2只在术后第二天经行为学惊跳反应测试未表现出听力损失。这4只大鼠被剔除。应根据讨论中所述原因，因出现并发症而将大鼠剔除。通过诱导鼓膜穿孔和/或锤骨移位/切除（图2B）可建立CHL模型，导致行为学表现异常（即CHL大鼠对高强度dB SPL惊跳声无反应）。术前应使用耳镜检查大鼠，确认鼓膜正常；术后也应检查，以确认鼓膜已成功穿孔（图2；补充图1）。注意，不应出现出血或明显炎症（补充图2）。CHL模型大鼠对高强度dB SPL拍手声无反应，而听力正常的对照笼伴则会因响亮拍手声出现跳跃反应。CHL大鼠并非完全听不见声音，而是存在传导性听力损失，因此仅表现出细微的行为变化⁵。听力正常的对照啮齿动物在受到高强度dB SPL...

讨论

我们描述了一种通过耳镜观察和行为性拍击惊跳反应来验证大鼠传导性耳聋（CHL）的简单手术诱导方法。本文以大鼠为例演示该方法，此前该方法已应用于沙鼠和小鼠。该方法可轻松推广至其他啮齿类动物。诱导CHL可用于研究一种较轻微的听力损失形式，其表现为听觉皮层的改变以及心理物理学行为学发现^4,5,16,17,18。

未能成功诱导传导性听力损失（CHL）可能由以下所列多种原因导致。在每种情况下，我们建议弃用该大鼠。若大鼠一侧耳朵出血，则应实施安乐死。出血表明剪刀接触到了耳道，说明手术操作不够精准。此外，这也可能意味着穿孔深度超过预期，造成内部损伤，甚至可能伤及脑部。内部损伤可能是由于器械插入过深或划伤耳道所致。本手术为微创性鼓膜和/或锤骨切除/移位操作，因此不应出现明显出血...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
乳胶、聚氯乙烯或丁腈手套	AMMEX		使用无粉、8密耳厚度的手套
微型弹簧剪刀（见图1b）	RWD Life Science	S11035-08	总长度8.0 cm，切割刃3.5 mm，或类似的微型镊子。带弹簧装置的标准镊子亦可满足要求
Otoscope mini 3000	HEINE	D-008.70.120M	标准LED耳镜即可满足要求
大鼠或小鼠	JAX labs		任何小型啮齿类动物
小型啮齿类动物笼具	Tecniplast	1284L	需要两个笼子，用于将听力受损的啮齿类动物与听力正常的个体分隔。若动物直接相互接触，会彼此惊扰。笼具尺寸：365 × 207 × 140 mm，底面积：530 cm² / 82.15 in²