我们描述了一种从胚胎期、新生期及出生后胰腺中分离内分泌细胞并进行单细胞RNA测序的方法。该方法可用于分析胰腺内分泌细胞谱系发育、细胞异质性及转录组动态变化。
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本文内容
摘要
摘要
胰腺内分泌细胞聚集于胰岛中，调控血糖稳定性和能量代谢。胰岛中包含多种不同的细胞类型，例如分泌胰岛素的β细胞，这些细胞在胚胎发育阶段由共同的内分泌前体细胞分化而来。未成熟的内分泌细胞通过细胞增殖进行扩增，并在出生后较长的发育时期内逐渐成熟。然而，这些过程背后的分子机制尚不明确。单细胞RNA测序是一种有前景的技术，可用于鉴定不同的细胞群体并追踪细胞谱系的分化路径。本文中，我们描述了一种针对胚胎期、新生期及出生后胰腺中分离得到的胰腺β细胞进行单细胞RNA测序的方法。
引言
胰腺是哺乳动物体内一个重要的代谢器官。胰腺由内分泌和外分泌两部分组成。胰腺内分泌细胞包括产生胰岛素的β细胞和产生胰高血糖素的α细胞，这些细胞聚集在朗格汉斯岛（胰岛）中，共同调节全身的葡萄糖稳态。内分泌细胞功能障碍会导致糖尿病 mellitus，该疾病已成为全球主要的公共卫生问题。
胰腺内分泌细胞在胚胎发育过程中起源于Ngn3+前体细胞1。随后，在围产期，这些内分泌细胞增殖形成未成熟的胰岛。这些未成熟细胞持续发育并逐渐成熟为胰岛，在成体中形成丰富的血管化结构，以调节血糖稳态2。
尽管已鉴定出一组调控β细胞分化的转录因子，但β细胞的精确成熟途径仍不明确。此外，β细胞的成熟过程还涉及细胞数量扩增3,4以及细胞异质性的产生5,6。然而，这些过程的调控机制尚未得到充分研究。
单细胞RNA测序是一种强大的方法，能够对细胞亚群进行分析并追踪细胞谱系的发育路径7。利用该技术，可在单细胞水....
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方案
本文所述所有方法均已获得北京大学实验动物福利与使用委员会（IACUC）的批准。
1. 胰腺分离
- 对于E17.5（胚胎第17.5天）胚胎：
- 根据阴道栓出现的时间点确定胚胎发育第0.5天。
- 通过 CO 处死怀孕小鼠2 给药。用70%酒精喷洒腹部毛发。
- 从生殖区域向肋骨处用剪刀做一个V形切口。此操作将完全打开腹腔。
- 从腹腔中取出子宫，置于含有冷PBS的10 cm培养皿中。
- 在体视显微镜下，使用尖头镊子从子宫中分离胚胎，并去除胎盘和脐带等其他组织。将所有胚胎置于含有冷PBS的10 cm培养皿中。
- 撕开胚胎的腹腔，用弯头镊子取出内脏组织。将内脏组织转移至含有冷PBS的6 cm黑色底培养皿中。
- 胰腺位于腹腔左上方，与胃、脾脏和十二指肠相连（图中黄色虚线所示） 图2A)12用镊子将胰腺从内脏组织上分离，并将胰腺组织收集至一个含有5 mL 0.5 mg/mL冷胶原酶溶液（0.5 mg/mL Collagenase P 溶于分离缓冲液中，分离缓冲液为含10 mM HEPES、1 mM MgCl₂的HBSS）的20 mL样品瓶中。2，5....
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结果
从胚胎期、新生期和出生后小鼠中分离胰腺（图2A 和 2B）。对于出生后18天以上的小鼠，消化效果取决于灌注程度；因此，注射是胰岛分离过程中最关键的步骤（图2C-2E 和 Table 6）。在此步骤中应尽可能注入足量的胶原酶以充分填充胰腺。完全膨胀的胰腺如 图2D 所示。如果灌注不成功（图2E），但样本珍贵，可将胰腺撕成小块，以便后续充分消化。
灌流后，将胰腺组织消化成小块以释放胰岛（图2F）。为了缩短FACS分选时间，我们通.......
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讨论
在本实验方案中，我们展示了一种有效且易于使用的胰岛β细胞单细胞表达谱研究方法。该方法可用于从胚胎期、新生期及出生后胰腺中分离内分泌细胞，并进行单细胞转录组分析。
最关键的步骤是获得状态良好的单个β细胞。充分灌注的胰腺对后续消化的反应更佳。灌注不足（通常发生在胰腺背侧）会导致胰岛得率降低。灌注完成后，需特别注意消化时间和振荡强度。过度消化（由过长的孵育时间和剧烈振荡引起）会使胰岛破碎成小块；而消化不足则无法将胰岛与周围组织完全分离。胰腺消化后，胰岛通过手工挑选进行纯化，而非采用密度梯度离心法。尽管密度梯度离心可富集胰岛，但许多较小的胰岛或与腺泡组织相连的胰岛常被误弃。应尽量避免挑取腺泡组织，因其可能导致胰蛋白酶消化效率降低，从而影响β细胞的纯度。
独立的生物学重复对于区分生物学变异性和批次效应是必要的。如果两个生物学重复在主成分分析（PCA）中具有相似的模式，并且在聚类结果中包含相似的亚群，则这些样本可能反映了可靠的生物学变异性。否则，需要增加更多的生物学重复以确认结果。对于胰腺等代谢器官，与昼夜节律钟相关的细胞状态
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢北京蛋白质科学国家中心（北京大学）和北大-清华生命科学计算平台。本工作得到中国科学技术部（2015CB942800）、国家自然科学基金委员会（31521004、31471358 和 31522036）以及北大-清华生命科学联合中心对 C.-R.X. 的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 胶原酶P | 罗氏 | 11213873001 | |
| 胰蛋白酶-EDTA（0.25 %），酚红 | 赛默飞世尔科技 | 25200114 | |
| 胎牛血清（FBS） | Hyclone | SH30071.03 | |
| Dumont #4 镊子 | Roboz | RS-4904 | |
| Dumont #5 镊子 | 罗博兹 | RS-5058 | |
| 30 G BD 针头 1/2" 长度 | BD | 305106 | |
| 体视显微镜 | 蔡司 | Stemi DV4 | |
| 立体荧光显微镜 | 蔡司 | Stereo Lumar V12 | |
| 离心 | Eppendorf | 5810R | |
| 离心 | Eppendorf | 5424R | |
| 带细胞筛帽的聚苯乙烯圆底管 | BD-Falcon | 352235 | |
| 96孔PCR微孔板 | Axygen | PCR-96-C | |
| 硅胶密封垫 | Axygen | AM-96-PCR-RD | |
| 薄壁PCR管 | Extragene | P-02X8-CF | |
| 细胞分选仪 | BD 生物科学 | BD FACSAria | |
| 毛细移液管 | Sutter | B100-58-10 | |
| RNaseZap | Ambion | AM9780 | |
| ERCC RNA 加标混合物 | Life Technologies | 4456740 | |
| 蒸馏水 | Gibco | 10977 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| dNTP 混合物 | New England Biolabs | N0447 | |
| 重组RNase抑制剂 | Takara | 2313 | |
| Superscript II 逆转录酶 | Invitrogen | 18064-014 | |
| 第一链缓冲液（5x） | Invitrogen | 18064-014 | |
| DTT | Invitrogen | 18064-014 | |
| 甜菜碱 | Sigma-Aldrich | 107-43-7 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | |
| 无核酸酶水 | Invitrogen | AM9932 | |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2x) | KAPA Biosystems | KK2601 | |
| VAHTS DNA Clean Beads XP 磁珠 | Vazyme | N411-03 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32854 | |
| AceQ qPCR SYBR Green Master Mix | Vazyme | Q121-02 | |
| TruePrep DNA文库构建试剂盒V2（适用于Illumina） | Vazyme | TD502 | 包含 5x TTBL、5x TTE、5x TS、5x TAB、TAE |
| TruePrep Index Kit V3 for Illumina | Vazyme | TD203 | 包含16个N6XX和24个N8XX |
| 高灵敏度 NGS 片段分析试剂盒 | 先进分析技术 | DNF-474 | |
| 1x HBSS（不含 Ca）2+ 和 Mg2+ | 138 mM NaCl；5.34 mM KCl 4.17 mM NaHCO₃3；0.34 mM Na2HPO4 0.44 mM KH2PO4 | ||
| 分离缓冲液 | 1 × 含 10 mM HEPES、1 mM MgCl 的 HBSS25 mM葡萄糖，pH 7.4 | ||
| FACS 缓冲液 | 1 × 含15 mM HEPES、5.6 mM葡萄糖、1% FBS、pH 7.4的HBSS | ||
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| NaHCO₃3 | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| D-(+)-葡萄糖 | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| 寡核苷酸-dT30VN引物 | 5'-AAGCAGTGGTATCAA<胰腺内分泌细胞聚集于胰岛中，调控血糖稳定性和能量代谢。在胚胎发育阶段，包括分泌胰岛素的β细胞在内的不同胰岛细胞类型由共同的内分泌前体细胞分化而来。未成熟的内分泌细胞通过细胞增殖在出生后较长的发育阶段中扩增并逐渐成熟。然而，这些过程的潜在机制尚不明确。单细胞RNA测序是一种有前景的技术，可用于鉴定不同的细胞群体并追踪细胞谱系分化路径。本文介绍了一种针对胚胎期、新生期及出生后胰腺中分离的β细胞进行单细胞RNA测序的方法。>CGCAGAGTACT30VN-3' | ||
| TSO | 5'-AAGCAGTGGTATCAAC GCAGAGTACATrGrG+G-3' | ||
| ISPCR 引物 | 5'-AAGCAGTGGTAT<胰腺内分泌细胞聚集于胰岛中，调控血糖稳定性和能量代谢。在胚胎发育阶段，包括分泌胰岛素的β细胞在内的不同胰岛细胞类型由共同的内分泌前体细胞分化而来。未成熟的内分泌细胞通过细胞增殖扩增，并在较长的出生后发育阶段中逐渐成熟。然而，这些过程的潜在机制尚不明确。单细胞RNA测序是一种有前景的技术，可用于表征不同的细胞群体并追踪细胞谱系分化路径。本文介绍了一种针对胚胎期、新生期及出生后胰腺中分离的胰腺β细胞进行单细胞RNA测序的方法。>CAACGCAGAGT-3' | ||
| Gapdh 上游引物 | 5'-ATGGTGAAGGTC GGTGTGAAC-3' | ||
| Gapdh 逆转录引物 | 5'-GCCTTGACT GTGCCGTTGAAT-3' | ||
| Ins2 上游引物 | 5'-TGGCTTCTTC TACACACCCA-3' | ||
| Ins2 逆转录引物 | 5'-TCTAGTTGCA GTAGTTCTCCA-3' |
参考文献
- Gu, G., Dubauskaite, J., Melton, D. A. Direct evidence for the pancreatic lineage: NGN3+ cells are islet progenitors and are distinct from duct progenitors. Development. 129 (10), 2447-2457 (2002).
- Oliver-Krasinski, J. M., Stoffers, D. A. On the origin of the....
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