快速、安全、简便的手动床旁全血样本病毒核酸提取方法

摘要

本文介绍一种从病毒灭活的全血中快速提取病毒核酸的方案。该提取过程直接在采血管中进行，无需任何设备或电力。该方法不依赖实验室设施，可在任何场所使用（例如，野外医院）。

摘要

快速诊断感染对于疫情管理、风险控制和患者护理至关重要。我们此前已报道过一种在采血过程中快速在床旁灭活埃博拉病毒的方法，即在真空采血管中直接加入商用裂解/结合缓冲液，以确保核酸（NA）检测的安全性。基于这种床旁灭活方法，我们开发了一种安全、快速且简化的床旁核酸提取方法，用于后续检测经裂解/结合缓冲液灭活的全血中的病毒。该核酸提取过程直接在采血管内进行，无需任何设备或电力。

血液采集至裂解/结合缓冲液后，通过手动翻转离心管混匀内容物，并于室温孵育20分钟。向管中加入磁性玻璃颗粒（MGPs），再次通过手动翻转采集管混匀。随后使用磁力架或磁铁配合橡皮筋将MGPs吸附至采血管一侧。MGPs依次洗涤三次，加入洗脱缓冲液后直接用于核酸（NA）检测，如定量PCR（qPCR）或等温环介导扩增（LAMP），无需将MGPs从反应体系中移除。该核酸提取方法不依赖任何实验室设备，可于任何场所便捷使用。例如在野战医院和医院隔离病房等环境中）。当该核酸提取方法与LAMP技术及便携式仪器结合使用时，可在采血后40分钟内获得诊断结果。

引言

在病毒暴发情况下，当患者被限制在医院隔离病房或需要快速诊断时，安全、简便且准确的即时分子诊断对于患者护理和风险控制至关重要。最近两次病毒暴发——2013年西非的埃博拉病毒（EBOV）疫情和2015年南美洲的寨卡病毒疫情——推动了对改进型即时分子诊断技术的研究兴趣，例如逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）^1，2 和重组酶聚合酶扩增（RPA）^3，4。RT-LAMP 和 RPA 均为快速、灵敏且特异的分子检测方法，可在简化的样本前处理基础上进行。对于寨卡病毒，RT-LAMP 已与侧向流动检测（LFA）结合使用，可在30分钟内检测未经纯化的全血样本中的寨卡病毒¹；然而，对于被归类为第四类病原体且具有高度传染性的埃博拉病毒（EBOV），样本必须在生物安全四级（BSL-4）条件下操作，并在进行任何安全诊断程序前完成灭活处理。

埃博拉病毒（EBOV）的简化灭活方法，例如向样本中添加裂解缓冲液^2,3,4,5在疫情暴发期间使用了这些方法；然而，这些方法需要 在BSL-4条件下操作时，至少需要使用实验室设备，如BSL-3级生物安全柜、离心机、加热块和移液器。这些设备通常不存在于隔离病房或野外医院中。为应对这一挑战，已有尝试将诊断工作在便携箱中进行。³，并且已开发出多种便携式设备和仪器[例如一种用于核酸（NA）提取的便携式设备⁶然而，EBOV阳性样本在使用这些设备前仍需进行灭活处理。

我们此前已报道了一种快速的床旁病毒灭活方法，通过将商用裂解/结合缓冲液加入普通真空采血管中，可实现埃博拉病毒（EBOV）⁷、痘苗病毒和牛痘病毒⁸的灭活，从而允许将患者血液直接转移至灭活缓冲液中⁷。这种在封闭系统内的直接且即时的灭活方式，消除了在严格 containment 条件（如 BSL-4 级别）下处理样本的必要性⁷，样本可在常规 BSL-2 条件下操作。该灭活方法可与多种核酸（NA）提取系统兼容，例如自动化机器人或手工纯化试剂盒⁷；然而，这些方法需要实验室设备，如自动化机器人、离心机和电力供应，而这些设备在野外现场或医院隔离病房内并不总是具备。

在本报告中，我们描述了一种安全、快速且简化的手工核酸提取方法，用于后续对经裂解/结合缓冲液灭活的全血样本中的病毒进行分子检测。该核酸提取方法仅需使用磁铁或磁力架，无需任何其他设备。核酸提取过程无需离心机、加热块或电源。因此，该方法不依赖实验室设施，可方便地在任何场所使用。例如在野战医院、医院隔离病房或资源有限的环境中均可应用。该核酸提取方法快速简便，可直接用于任何下游核酸检测，如qPCR、RT-qPCR、LAMP或RT-LAMP。当该核酸提取方法与LAMP技术及便携式电池驱动的等温扩增仪器结合使用时，可在采血后40分钟内获得床旁诊断结果。

方案

根据丹麦关于检测方法开发项目的法律规定，首都大区生物医学研究伦理委员会已给予知情同意，且此处所述的所有方法均已免于伦理委员会系统的审查。

1. 病毒灭活与快速核酸提取用采血管的制备

警告：本实验方案所用缓冲液含有硫氰酸胍（GITC）和非离子型表面活性剂，具有刺激性。操作时应采取适当的实验室安全措施，在通风橱中进行，并佩戴手套。避免与皮肤和眼睛接触。若缓冲液洒出，切勿直接使用氯胺或次氯酸钠（即"漂白剂"中的有效成分）对污染表面进行消毒，因为该混合物可能导致有毒氰化物的生成。首先，用吸水纸巾擦去洒出的缓冲液；随后，用70%乙醇清洁表面，再用水擦拭，最后方可使用氯胺或次氯酸钠进行消毒。

1. 准备采血管时，使用25 G × 1针头和3 mL注射器穿刺4 mL EDTA真空采血管的管盖，向管内注入1.6 mL特定的商用裂解缓冲液。
   注意：切勿取下真空采血管的管盖，必须保持管内真空状态。
2. 将含有缓冲液的真空采血管于室温下保存，直至使用。
   注意：此类采血管在制备后至少1年内保持稳定。

2. 核酸提取用缓冲液的制备

1. 为准备核酸提取所需的缓冲液，将两个 1.8 mL、两个 4.5 mL 和一个 3.6 mL 离心管放入试管架中。
2. 用移液器向一个洁净的 1.8 mL 管中加入 960 µL 磁性玻璃颗粒（MGPs），并标记为 MGPs。移液前需充分重悬 MGP 悬液。
   注意：MGP 易迅速沉降至管底。
3. 用移液器向一个洁净的 4.5 mL 管中加入 4 mL 洗涤缓冲液 I，并标记为 WB-1。
   警告：洗涤缓冲液 I 含有氯化胍，具有刺激性。操作时应采取适当的实验室安全措施，在通风橱中操作并佩戴手套，避免与皮肤和眼睛接触。
4. 用移液器向一个洁净的 3.6 mL 管中加入 1.5 mL 洗涤缓冲液 II，并标记为 WB-2。
5. 用移液器向一个洁净的 4.5 mL 管中加入 3 mL 洗涤缓冲液 III，并标记为 WB-3。
6. 用移液器向一个洁净的 1.8 mL 管中加入 100 µL 洗脱缓冲液，并标记为 EB。
7. 将分装好的缓冲液于室温保存，直至使用。
   注意：缓冲液在配制后至少 1 个月内保持稳定。

3. 病毒感染体征和症状患者的血液采集

警告：采集患者全血时应采取适当的实验室安全措施。佩戴手套和护目镜。如果患者处于隔离状态，请遵循生物安全等级4的程序。

1. 采集患者静脉全血时，使用带有细径延长管的蝶形针，并连接含有裂解/结合缓冲液的真空采血管。将患者手臂置于向下位置，并使采血管位于蝶形针下方。将蝶形针插入患者静脉后，将真空采血管连接至细径延长管。
   注意：此操作可防止反流。
2. 采血完成后，通过翻转采血管5–10次以混匀管内内容物。
   注意：由于含有1.6 mL裂解/结合缓冲液的采血管内仍保持真空状态，所采集的样本体积将自动精确为1.6 mL。
3. 使用70%乙醇对采血管外表面进行消毒。
4. 将采血管在室温下孵育20分钟。
   注意：本步骤可作为暂停点，全血采血管可在-20 °C、5 °C、25 °C或37 °C下保存至少1个月⁷。
5. 随后直接进入简化的核酸提取步骤。

4. 全血核酸提取的简化方法

1. 为从裂解/结合缓冲液灭活的采集血液中纯化核酸（NA），用手翻转真空管5至10次，混匀管内内容物。
2. 小心取下管盖，并弃去管盖。
3. 将预先准备好的MGPs分装液（1 mL）直接倒入采血管中。
4. 从一支未使用的采血管上取下新管盖，盖在含有样本的管子上。
5. 用手指按住管盖以确保管子紧密封闭，用手翻转采血管5至10次，混匀管内内容物。
6. 将管子放入磁力架中，并用手指按住管盖以确保管子紧密封闭。
7. 用手翻转带有管子的磁力架数次，确保所有MGPs均被吸附至磁铁一侧的管壁上。
   注意：可用一根细长磁铁和橡皮筋替代磁力架。
8. 打开管盖，使用一次性移液器或直接倾倒的方式将管内液体转移至50 mL收集管中并弃去。
   注意：通过盖上管盖避免50 mL收集管产生气溶胶。
9. 将预先准备好的WB-1分装液（4 mL）直接倒入采血管中。
10. 盖上管盖，并用手指按住管盖以确保管子紧密封闭。
11. 从磁力架上取下管子，同时用手指确保管盖牢固旋紧。
    注意：若使用磁铁和橡皮筋，只需将橡皮筋和磁铁从管子上取下即可。
12. 用手翻转采血管5至10次，重悬MGPs。
13. 重复步骤4.6 – 4.8。
14. 将预先准备好的WB-2分装液（1.5 mL）直接倒入采血管中。
15. 盖上管盖，并将管子从磁力架上取下。
    注意：若使用磁铁和橡皮筋，只需将橡皮筋和磁铁从管子上取下即可。
16. 用手指按住管盖以确保管子紧密封闭。
17. 用手轻轻翻转采血管数秒，重悬MGPs。
18. 重复步骤4.6 – 4.8。
19. 将预先准备好的WB-3分装液（3 mL）直接倒入采血管中。
20. 盖上管盖，并将管子从磁力架上取下。
    注意：若使用磁铁和橡皮筋，只需将橡皮筋和磁铁从管子上取下即可。
21. 用手指按住管盖以确保管子紧密封闭。
22. 用手翻转采血管5至10次，重悬MGPs。
23. 重复步骤4.6 – 4.8。
24. 将预先准备好的EB洗脱缓冲液（100 µL）直接倒入采血管中。
25. 盖上管盖，并将管子从磁力架上取下。
    注意：若使用磁铁和橡皮筋，只需将橡皮筋和磁铁从管子上取下即可。
26. 用手指轻弹采血管5至10次，使MGPs在EB中充分重悬。
    注意：本步骤可暂停，管子可于-20 °C保存。
27. 使用1.5 mL一次性移液器，取一滴重悬后的MGPs（5–8 µL），转移至下游核酸扩增反应体系中（可使用任何下游核酸扩增检测方法，如LAMP/RT-LAMP或qPCR/RT-qPCR）。
    注意：核酸会结合在MGPs上，因此务必在下游核酸扩增反应中使用MGPs。使用前需混匀MGPs悬液；混匀后，MGPs将沉降至管底。

结果

本文介绍的方案简单高效，可广泛应用于在用裂解/结合缓冲液灭活的传染性全血样本上进行的任何分子检测。血液灭活和核酸提取的工作流程如图1所示，包括采血管的制备⁷（图1A）、血液采集⁷（图1B）、核酸提取（图1C–1H）以及后续的核酸分析（图1I）。

由于简化了核酸提取流程，磁性玻璃粉（MGPs）在洗脱步骤中未被去除，因此核酸 tends to stick to the MGPs。任何下游分子分析（如qPCR或LAMP分析）都必须直接在MGPs上进行（

讨论

本报告介绍了一种安全、快速且简便的手动床旁核酸提取方法，用于对经裂解/结合缓冲液灭活的全血样本进行下游病毒分子检测。所述核酸提取方法可直接用于采集于含有裂解/结合缓冲液的真空采血管中的全血样本（材料表）⁷。该特定缓冲液可灭活埃博拉病毒（EBOV）⁷，是本方法的关键组分。采血后，建议将采血管在室温下孵育至少20分钟⁷，以确保样本完全灭活。床旁对EBOV的灭活处理消除了在严格密闭条件下（如生物安全四级，BSL-4）操作任何EBOV阳性样本的必要性，使样本可在常规生物安全二级（BSL-2）条件下进行处理。其他生物安全四级病原体，如拉沙病毒、马尔堡病毒和克里米亚-刚果出血热病毒，也可能被该缓冲液灭活，但尚需进一步验证。

所描述的核酸提取方法旨在医院隔离病房或野战医院等患者床旁进行，因此无需使用离心机、加热块或电力等实验室设备。该核酸提取方法仅需装有固定体积磁性玻璃粉（MGPs）或洗涤缓冲液的离心管、磁力架和一次性移...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
真空采血管 K2 EDTA 管（4 mL）	Becton Dickinson	368861
Plus 血液采集管	Becton Dickinson	362725
23G × 1 针头	Becton Dickinson	300800
鲁尔锁注射器（3 mL）	Becton Dickinson	309658
带细径延长管的蝶形针头	Jørgen Kruuse A/S	121714
1% Virkon 消毒剂	Nomeco A/S	849265
MagNA Pure LC DNA 分离试剂盒 I - 裂解/结合缓冲液 - 补充装	Roche Diagnostics A/S	03246752001
MagNA Pure LC 总核酸分离试剂盒	Roche Diagnostics A/S	3038505001
Nunc™ 生物样本库和细胞培养冻存管（1.8 mL）	Thermo Fisher Scientific	375418
Nunc™ 生物样本库和细胞培养冻存管（3.6 mL）	Thermo Fisher Scientific	379189
Nunc™ 生物样本库和细胞培养冻存管（4.5 mL）	Thermo Fisher Scientific	379146
DynaMag™-5 磁力架	Thermo Fisher Scientific	12303D
移液吸头（3.5 mL）	Sarstedt	86.1171.010
Thermo Scientific™ Samco™ 细尖移液吸头（1.5 mL）	Thermo Fisher Scientific	231
Thermo Scientific™ Nunc™ 50 mL 圆锥形无菌聚丙烯离心管	Thermo Fisher Scientific	339652