快速、安全、简便的手动床旁全血样本病毒核酸提取方法

摘要

本文介绍一种从病毒灭活的全血中快速提取病毒核酸的方案。该提取过程直接在采血管中进行，无需任何设备或电力。该方法不依赖实验室设施，可在任何场所使用（例如，野外医院）。

摘要

快速诊断感染对于疫情管理、风险控制和患者护理至关重要。我们此前已报道过一种在采血过程中快速在床旁灭活埃博拉病毒的方法，即在真空采血管中直接加入商用裂解/结合缓冲液，以确保核酸（NA）检测的安全性。基于这种床旁灭活方法，我们开发了一种安全、快速且简化的床旁核酸提取方法，用于后续检测经裂解/结合缓冲液灭活的全血中的病毒。该核酸提取过程直接在采血管内进行，无需任何设备或电力。

血液采集至裂解/结合缓冲液后，通过手动翻转离心管混匀内容物，并于室温孵育20分钟。向管中加入磁性玻璃颗粒（MGPs），再次通过手动翻转采集管混匀。随后使用磁力架或磁铁配合橡皮筋将MGPs吸附至采血管一侧。MGPs依次洗涤三次，加入洗脱缓冲液后直接用于核酸（NA）检测，如定量PCR（qPCR）或等温环介导扩增（LAMP），无需将MGPs从反应体系中移除。该核酸提取方法不依赖任何实验室设备，可于任何场所便捷使用。例如在野战医院和医院隔离病房等环境中）。当该核酸提取方法与LAMP技术及便携式仪器结合使用时，可在采血后40分钟内获得诊断结果。

引言

在病毒暴发情况下，当患者被限制在医院隔离病房或需要快速诊断时，安全、简便且准确的即时分子诊断对于患者护理和风险控制至关重要。最近两次病毒暴发——2013年西非的埃博拉病毒（EBOV）疫情和2015年南美洲的寨卡病毒疫情——推动了对改进型即时分子诊断技术的研究兴趣，例如逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）^1，2 和重组酶聚合酶扩增（RPA）^3，4。RT-LAMP 和 RPA 均为快速、灵敏且特异的分子检测方法，可在简化的样本前处理基础上进行。对于寨卡病毒，RT-LAMP 已与侧向流动检测（LFA）结合使用，可在30分钟内检测未经纯化的全血样本中的寨卡病毒¹；然而，对于被归类为第四类病原体且具有高度传染性的埃博拉病毒（EBOV），样本必须在生物安全四级（BSL-4）条件下操作，并在进行任何安全诊断程序前完成灭活处理。

埃博拉病毒（EBOV）的简化灭活方法，例如向样本中添加裂解缓冲液^2,3,4,....

方案

根据丹麦关于检测方法开发项目的法律规定，首都大区生物医学研究伦理委员会已给予知情同意，且此处所述的所有方法均已免于伦理委员会系统的审查。

1. 病毒灭活与快速核酸提取用采血管的制备

警告：本实验方案所用缓冲液含有硫氰酸胍（GITC）和非离子型表面活性剂，具有刺激性。操作时应采取适当的实验室安全措施，在通风橱中进行，并佩戴手套。避免与皮肤和眼睛接触。若缓冲液洒出，切勿直接使用氯胺或次氯酸钠（即"漂白剂"中的有效成分）对污染表面进行消毒，因为该混合物可能导致有毒氰化物的生成。首先，用吸水纸巾擦去洒出的缓冲液；随后，用70%乙醇清洁表面，再用水擦拭，最后方可使用氯胺或次氯酸钠进行消毒。

1. 准备采血管时，使用25 G × 1针头和3 mL注射器穿刺4 mL EDTA真空采血管的管盖，向管内注入1.6 mL特定的商用裂解缓冲液。
   注意：切勿取下真空采血管的管盖，必须保持管内真空状态。
2. 将含有缓冲液的真空采血管于室温下保存，直至使用。
   注意：此类采血管在制备后至少1年内保持稳定。

2. 核酸提取用缓冲液的制备

1. 为准备核酸提取所需的缓冲液，将两个 1.8 mL、两个 4.5 mL 和一个 3.6 mL 离心管放入试管架中。
2. 用移液器向一个....

结果

本文介绍的方案简单高效，可广泛应用于在用裂解/结合缓冲液灭活的传染性全血样本上进行的任何分子检测。血液灭活和核酸提取的工作流程如图1所示，包括采血管的制备⁷（图1A）、血液采集⁷（图1B）、核酸提取（图1C–1H）以及后续的核酸分析（图1I）。

由于简化了核酸提取流程，磁性玻璃粉（MGPs）在洗脱步骤中未被去除，因此核酸 tends to stick to the MGPs。任何下游分子分析（如qPCR或LAMP分析）都必须直接在MGPs上进行（

讨论

本报告介绍了一种安全、快速且简便的手动床旁核酸提取方法，用于对经裂解/结合缓冲液灭活的全血样本进行下游病毒分子检测。所述核酸提取方法可直接用于采集于含有裂解/结合缓冲液的真空采血管中的全血样本（材料表）⁷。该特定缓冲液可灭活埃博拉病毒（EBOV）⁷，是本方法的关键组分。采血后，建议将采血管在室温下孵育至少20分钟⁷，以确保样本完全灭活。床旁对EBOV的灭活处理消除了在严格密闭条件下（如生物安全四级，BSL-4）操作任何EBOV阳性样本的必要性，使样本可在常规生物安全二级（BSL-2）条件下进行处理。其他生物安全四级病原体，如拉沙病毒、马尔堡病毒和克里米亚-刚果出血热病毒，也可能被该缓冲液灭活，但尚需进一步验证。

所描述的核酸提取方法旨在医院隔离病房或野战医院等患者床旁进行，因此无需使用离心机、加热块或电力等实验室设备。该核酸提取方法仅需装有固定体积磁性玻璃粉（MGPs）或洗涤缓冲液的离心管、磁力架和一次性移.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
真空采血管 K2 EDTA 管（4 mL）	Becton Dickinson	368861
Plus 血液采集管	Becton Dickinson	362725
23G × 1 针头	Becton Dickinson	300800
鲁尔锁注射器（3 mL）	Becton Dickinson	309658
带细径延长管的蝶形针头	Jørgen Kruuse A/S	121714
1% Virkon 消毒剂	Nomeco A/S	849265
MagNA Pure LC DNA 分离试剂盒 I - 裂解/结合缓冲液 - 补充装	Roche Diagnostics A/S	03246752001
MagNA Pure LC 总核酸分离试剂盒	Roche Diagnostics A/S	3038505001
Nunc™ 生物样本库和细胞培养冻存管（1.8 mL）	Thermo Fisher Scientific	375418
Nunc™ 生物样本库和细胞培养冻存管（3.6 mL）	Thermo Fisher Scientific	379189
Nunc™ 生物样本库和细胞培养冻存管（4.5 mL）	Thermo Fisher Scientific	379146
DynaMag™-5 磁力架	Thermo Fisher Scientific	12303D
移液吸头（3.5 mL）	Sarstedt	86.1171.010
Thermo Scientific™ Samco™ 细尖移液吸头（1.5 mL）	Thermo Fisher Scientific	231
Thermo Scientific™ Nunc™ 50 mL 圆锥形无菌聚丙烯离心管	Thermo Fisher Scientific	339652