人类和动物牙釉质碳酸盐的稳定碳、氧同位素分析已被用作个体饮食和环境重建的代用指标。本文提供了对考古学和古生物学样本进行牙釉质整体及逐层取样以及前处理的详细描述和可视化记录。
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摘要
摘要
人类和动物牙釉质碳酸盐的稳定碳、氧同位素分析已广泛应用于从近代历史时期至一千多万年前的古食性、古生态及古环境研究。整体取样法可提供釉质矿化期间的代表性样本，而牙齿内连续取样的方法则能追踪该时期内的饮食与环境变化。尽管这些方法已在考古学、生态学和古生物学领域得到广泛应用并被广泛描述，但目前尚无明确指南以帮助研究人员选择必要的实验设备，或全面详述实验室取样及具体操作流程。本文通过文字与图示，完整记录了从取样、前处理到成岩作用筛查的全部过程，旨在使该方法能更广泛地应用于不同类型的实验室环境中。
引言
牙釉质碳酸盐的稳定碳、氧同位素分析已被用于研究古人类的膳食摄入、断奶过程及迁徙行为，同时也用于研究动物对植被的依赖性、动物的移动模式以及家畜的饲料来源。这些应用已在多种环境条件下得到系统性讨论与综述，表明了当地干旱程度、温度、水源和植被组成的影响1,2,3,4,5,6。由于其在考古学和古生物学领域具有广泛的应用潜力，且牙釉质碳酸盐保存状况良好，因此成为稳定同位素研究中备受青睐的材料3。取样、前处理及成岩作用筛查的方法在先前多项出版物中已有简要描述1,7。然而，详尽的文字说明与可视化演示仍普遍缺乏，尤其对于考古科学实验室以外的研究者，以及资金有限但对该技术应用兴趣日益增加的实验团队而言尤为如此5。
牙釉质主要由羟基磷灰石（生物磷灰石）微晶构成8，其晶体尺寸大于骨骼中的微晶，因而对死后成岩过程中发生的离子置换和污染具有更强的抗性3。近期研究表明，动物牙釉质中稳定的碳同位素（δ13C）测定值能够可靠地反映动物的食性与行为特征9,10。牙釉质中稳定氧同位素（δ18O）值取决于摄入水的氧同位素组成，摄入水包括植物和动物食物中的水分、饮用水以及通过呼吸进入体内的水，同时还受多种环境因素对水体影响所致的进一步同位素分馏作用的影响（例如，干旱程度、温度、海拔、降水量、距大陆内部的距离等）11。因此，该方法已成为考古学、古生态学和古生物学研究中进行食性与环境重建的常用手段。
牙釉质的形成周期相对较短（以年计），且因所采样的牙齿类型而异。对于人类而言，第一磨牙的牙釉质在出生至3岁之间矿化，前磨牙在1.5至7岁之间矿化，第二磨牙在2.5至8岁之间矿化，而第三磨牙则在青春期期间，即7至16岁之间矿化12。由于牙釉质在其形成过程中是逐步沉积的，因此可沿整个生长轴整体取样，或进行连续分段取样，以研究形成期间饮食与环境的变化情况13。在特定牙齿中按时间顺序记录的饮食变化在人类及其他动物中均可观察到1,14，从而提供有关年度间季节性及饮食变化的信息。
尽管牙釉质通常对成岩作用具有较强的抗性，但埋藏环境仍可能导致其同位素组成发生变化，此类现象已有报道15,16，因此进行实验验证和选择适当的前处理方法十分必要。傅里叶变换红外光谱法（FTIR），特别是衰减全反射模式（ATR）下的应用，虽非唯一可用的方法，但已成为评估牙齿釉质埋藏学变化的一种快速、经济且相对易得的技术，尤其适用于古生物学研究背景17,18,19,20。然而，详细的实验操作流程和记录标准对于地球化学或材料科学领域之外的许多研究者而言，仍然较难获取。
在文献中，研究人员对牙釉质进行预处理时所采用的反应时间及化学试剂存在显著差异，且通常较少考虑这种变异性可能对样品的稳定碳、氧同位素值造成的影响21,22。本文报道了一种使用稀释乙酸（0.1 M）对釉质粉末样品进行预处理的方法。然而，由于预处理所引起的牙釉质同位素测量差异相对较小，研究人员最好遵循拟用于数据比对的已有数据集所采用的实验流程11。此外，在获取微小的连续样品时，特别是针对全新世样品，可在进行初步成岩性测试后选择不进行预处理，以避免样品浪费。
尽管我们在此报道的方法本身并非全新，但据我们所知，这是首次向广泛的学术受众全面提供关于牙釉质大样本及连续采样、预处理方案选择以及成岩作用检验方法（以傅里叶变换红外光谱FTIR形式呈现）的详尽文字与可视化记录。尽管我们希望这些努力能使更多个人和实验室更便捷地采用该方法，但研究人员若希望应用并发表此技术，必须了解其他文献中概述的最低报告标准、成岩作用相关考量因素及展示要求20，同时还需意识到其研究区域、所分析的分类单元（taxa）及时间 period 所特有的潜在解释复杂性5。
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方案
以下方案遵循马克斯·普朗克人类历史科学研究所轻同位素质谱实验室的指导原则。对于涉及濒危现代或历史动物标本的分析，以及涉及当代利益相关方关注的考古和动物材料的使用，应获得国家和国际伦理委员会的适当许可。本文所用样品为考古和化石标本。本研究未使用任何活体人类，所有破坏性分析均已获得完整的伦理、机构和政府许可。
1. 大量取样
注意：对于人类和动物，大量牙釉质取样的基本方法是将钻头应用于牙齿的颊侧边缘。
- 使用铝砂喷砂仪或钻具装置通过轻柔研磨清洁牙齿外表面（约0.1 mm）。采用手持式钻机，通过卡盘将一支洁净、形状均匀的金刚石钻头（见下文）连接至钻具装置。确保沿牙齿整个生长轴方向平行进行轻柔且均匀的研磨，形成凹槽图1 和 图2).
- 尽可能对每位人类或动物样本的同一牙齿部位应用该方法。
注意：在人类古食谱研究中，通常选用第三臼齿作为青少年晚期/成年期饮食的代表，而避免使用第一臼齿，因其受断奶效应影响较大23每个分类单元所选用的牙齿类型及其代表的生命时期将根据可用样本和研究问题的不同而有所变化。 - 在通风良好的房间内操作，并佩戴口罩，以避免吸入牙釉质粉末。佩戴护目镜以保护眼睛。注意钻取的样品粉末量会因分析设备、预处理方案及牙齿大小而异。应以低速钻取，防止样品受热。
注意：使用在线气体制备与引入系统进行同位素比值质谱分析和成岩作用测试时，通常以获得 4–8 mg 样品粉末为宜。需注意，钻取速度的选择取决于样品的脆弱程度，需通过一定次数的尝试与调整来确定。一般情况下，使用手持式钻机时，五档强度中选择二档即可。钻取牙样粉末时，应在洁净的铝箔或称量纸上进行。 - 收集所得的釉质粉末，并转移至已预先在精度合适的天平上称重归零的1.5 mL微量离心管中。用样本编号标记每根离心管（图3）在实验记录本和电子数据库中记录样本编号和牙釉质重量。
- 每次钻取新牙齿前，先用0.5 M盐酸在耐磨组织上清洁已使用的钻头，然后用有机溶剂（如丙酮、甲醇或乙醇）在耐磨组织上清洗钻头。
- 钻孔操作结束后，使用专用真空吸尘器或簸箕和刷子彻底清洁工作区域。用甲醇擦拭采样区域。使用压缩空气对钻头进行抽吸或轻微喷吹，以清除样品间残留的粉尘和样品粉末。
2. 连续采样
注意：序列取样可以采用多种形式，具体取决于所取样的分类群、牙齿的大小以及所需的时序分辨率。
- 通过去除牙齿外层极薄（约0.1 mm）的牙釉质，清洁待取样牙齿的表面。
- 沿牙齿颊面垂直于牙齿生长轴的方向进行钻取，从釉牙骨质界（ERJ）至牙冠顶部。沿垂直于生长轴的方向钻取水平条带，使每个样品在釉质层上形成一条宽1–2 mm的沟槽（图1 和 图4）。注意避免钻穿釉质进入牙本质，以免污染样品并影响后续测定结果。
注意：取样数量取决于所需分辨率，但对于家牛大小的高冠齿，约10个样品足以用于研究δ13C 和 δ18O 值的季节性变化。 - 根据每个样品选择合适的钻头，因为取样线的宽度由钻头直径决定。
- 对于需要获取更多增量样品的细小牙齿（图2）（例如人类牙齿）以及需要更稳定钻孔操作的情况，应使用固定装置进行钻取。设置钻机支架，牢固固定钻头，并使钻头朝下。
注意：虽然通过手持方式可轻松从成人恒磨牙中获取四个样品24，但更精细的取样需采用固定装置或CO2激光剥蚀法，后者不在本文讨论范围内14。另一种常见方法是使用半自动微量取样技术25。 - 手持牙齿或将牙齿固定于夹具中。将牙釉质压向钻头并施加压力。沿颊面从牙尖（咬合面）至釉牙骨质界（ERJ）处的牙冠基部进行逐级钻取。重复相同的钻样策略，使每条新的钻线与前一条平行。对于羊磨牙等细小牙齿，应使用直径为1 mm的小型圆柱形金刚石钻头（图1C）。
- 使用游标卡尺测量每条取样线与釉牙骨质界（ERJ）之间的距离，并记录该距离以供比较。
- 重复执行上述步骤1.3–1.6。
注意：若分析对象为小型细小牙齿，且未进行预处理及成岩作用检验，则在用于碳酸盐分析的在线气体制备与导入系统中，仅需1–4 mg的样品即可获得可靠结果。经改进的自动化外围系统可进一步降低所需样品量，但其最终受限于所研究釉质中碳酸盐的含量比例（4–5 wt%）26,27。研究人员应咨询样品检测实验室，以确定所需的具体样品量。
3. 傅里叶变换红外光谱/衰减全反射法
- 对于衰减全反射法，在真空或正常大气条件下建立样品室背景。
- 使用刮勺将约1 mg牙釉质置于样品室的金刚石晶体上。降下并固定样品杆，确保样品杆、样品与金刚石板之间形成稳固接触。关闭样品室，可根据设备配置或条件决定是否建立真空。
- 对样品在400至4,000 cm⁻¹波数范围内进行64次FTIR光谱测量-1所需的重复次数取决于研究的具体目标，但通常建议进行三次重复分析，理想情况下应取不同的等分试样进行检测，然后再将其放回装有样品的微量离心管中，以确保结果的可靠性。
- 每次分装及每个样品之间，用甲醇清洁刮刀。
- 使用可用软件进行基线校正。该软件会自动从所得的傅里叶变换红外光谱（FTIR）图谱中扣除样品室背景。为确保更好的可重复性，仅选用磷酸盐峰最高吸收值不低于0.06的牙釉质光谱 ~1035 cm-1 应予以考虑。
- 通过检测 711 cm⁻¹ 处是否存在峰，监测所有样品中常见次生污染物碳酸钙石的出现-1.
- 分析完成后，使用刮勺或吸液装置小心地将样品转移回其对应的微量离心管中，并进入下一阶段的预处理或分析。
- 将原始波长和强度数据导出为 .csv 文件（或类似格式），并用于计算感兴趣的指数（常用指数包括 A 位磷酸盐指数、B 位磷酸盐指数、磷酸盐结晶度指数、磷酸盐上的水-酰胺指数以及 CO3/PO4 索引17,18,19) (表1).
- 将化石或考古样本的傅里叶变换红外光谱（FTIR）结果与文献中现已可获取的现代动物牙釉质的不断增长的数据集进行比较19,20 以确定所采牙釉质成岩作用改造的性质与程度。
4. 简单的乙酸（0.1 M）预处理
- 使用适当的天平在微量离心管中称取每个样品的牙釉质粉末，并相应标记试管。牙釉质粉末必须研磨至相同程度，颗粒大小应相近。
注意：许多研究人员使用氧化剂（如稀释的次氯酸钠（NaClO）或30%过氧化氢（H2O2））去除样品中的有机物，此步骤通常在此时添加。然而，这些试剂不仅可能改变样品中稳定碳和氧同位素的值，而且在线气体制备与引入系统中骨胶原样品的光谱显示，碳酸盐测定中使用的100%磷酸不与有机样品发生反应（图5），表明该步骤可能是不必要的。 - 使用移液器向每个样品中加入0.1 mL的0.1 M乙酸（每1 mg牙釉质）。避免移液器接触样品。如果样品与移液器发生接触，请在处理下一个样品时更换新的移液器，以避免交叉污染。
- 通过振荡或电子振荡器（图3）进行震荡，然后让样品静置10分钟。牙釉质粉末不应长时间留在乙酸中（>4小时）。
- 将样品置于微量离心机中，在13,700 × g条件下离心2分钟。
注意：一种低成本的替代方法是使用小型离心机，在3,500 × g条件下离心4分钟，虽然容纳样品较少，但在处理大量样品时更节省时间。 - 当微量离心程序结束后，使用洁净的移液器将乙酸替换为2 mL超纯水，然后在13,700 × g条件下再次离心2分钟。
- 如前所述，再更换超纯水两次，并检测是否达到中性。使用移液器移除残留液体（不要扰动上清液）。
注意：总共三次超纯水洗涤是达到中性的标准操作流程。应持续洗涤样品直至达到中性。 - 裁剪Parafilm膜片（1 cm × 1 cm），覆盖在每个微量离心管上。用尖锐物体在中心处刺一个小孔，以便样品适当干燥。
- 将试管放入冷冻干燥机中以去除任何残留液体。
注意：若无冷冻干燥机，也可采用温和的烘箱干燥（40 °C），此方法不会对稳定碳和氧同位素数据产生不利影响。 - 干燥后，取下Parafilm膜，盖紧微量离心管盖子。确保试管标记正确，必要时重新书写。
注意：此步骤是储存前称重的最后阶段；在资金有限的实验室中，这也可能是将样品分发至其他机构进行分析前的最终步骤。
5. 样品与标准品的称量与测量
- 使用刮刀在精度为 0.001 mg 的天平上，称取约 2 mg 的牙釉质粉末置于锡盘中（图6）。然后小心地将样品转移至耐磷酸的硼硅酸盐玻璃小瓶中。由于牙釉质中碳酸根的比例相对较小，因此需要该量的样品以获得可靠的结果。
- 在样品之间使用甲醇清洁刮刀，并为每个样品使用新的、洁净的称量盘或称量容器。
- 称取 0.2 mg 的国际标准物质，例如 IAEA NBS18、IAEA 603、IAEA CO8 或 Merck CaCO3。也可使用来自一颗大牙齿均质化牙釉质的实验室内部标准物质20。对于一次完整的 76 个样品和标准物质的运行，应使用 61 个样品和 15 个标准物质，并在整个运行过程中均匀分布。已有若干研究报道了考古研究中标准物质的适当数量及相关细节20,28。
注意：在多次考古样品运行中，对实验室内部牙釉质标准物质进行重复前处理和分析，也有望为所研究样品提供适当的准确度评估20。 - 拧紧特制瓶盖，使隔垫刚好紧固但不被吸入瓶内。切勿过度拧紧瓶盖，否则隔垫所受压力过大，可能导致分析过程中针头断裂。将小瓶按预定顺序放入 70 °C 的加热块中。样品的顺序和重量必须可靠记录，以便输入计算机软件。
- 按照以下三个步骤测量样品：1）用高纯氦气冲洗并填充样品，2）加入磷酸，3）测量样品。
- 使用纯氦气（5.0 级）以 100 mL/min 的流速冲洗样品 5 分钟，以排出环境空气。
- 向含碳酸盐的样品中加入 4–5 滴磷酸（99%，密度 1.85 g/mL）。样品与 H3PO4 的反应随即开始。反应过程中释放出 CO2，其携带了样品中碳酸根离子 CO32- 的同位素信息。
- 每个样品等待 1 小时，直至 CO2 达到平衡。1 小时后应立即测量样品以获得可靠结果。在采集过程中，样品气体与氦气的混合物进入仪器。干燥步骤将水分从样品气体混合物中去除。
- 开始测量时，先采集三次已知同位素组成的 CO2 参比气体峰。峰强度应为 4000 mV，以匹配样品峰的强度（介于 4000 至 8000 mV 之间）。三次参比气体峰应持续 20 秒，间隔 30 秒。随后设定样品的测量区间，对样品连续测量 10 次，每次 5 秒，间隔 55 秒。确保峰高随时间逐渐降低，表明样品/氦气混合物的传输正常（图5）。
注意：测量过程中，软件通过比较参比气体的已知同位素值、峰高和峰面积与样品峰的峰高和峰面积，计算样品的同位素组成。由此得出样品原始的 13C/12C 和 18O/16O 比值。
- 测量后对样品进行归一化处理。
注意：此步骤至关重要，因为参比气体进入质谱仪时所经历的化学和物理路径与样品气体不同。因此，必须将样品进一步校准至国际标准（步骤 5.3），这些标准在同一次运行中经历了与样品相同的物理和化学处理过程20。这些国际碳酸盐标准物质可用于两点校准，将样品数据转换至国际 delta 测量标度，并评估整个运行过程中的精密度和重复性。
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结果
采用上述取样方法，制备了牙釉质生物磷灰石的连续增量样品。对釉质中生物磷灰石的分析结果取决于取样的准确性，无论是整体取样还是连续增量取样。本研究中，我们展示了来自不同气候区的考古样本（两只绵羊）的分析结果。对绵羊第二臼齿的连续增量样品进行了分析，并从釉质-牙骨质交界处（ERJ）开始标记（图4）。每个增量取样位置均进行编号，并以距ERJ的距离（mm）作为测量值（图7）。
两只绵羊的碳和氧稳定同位素结果差异显著，证实它们生活在不同的环境中，分别为热带草原（A）和温带干旱草原（B）。绵羊A的逐层δ18O值变化范围较窄，介于3.3‰至5.1‰之间，表明其摄取的水源同位素值相近，且降水无明显季节性变化（图8）。相比之下，绵羊B的δ18O值变化幅...
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讨论
成功采集牙齿样本（整体和增量采样）的挑战主要在于是否能够获得有关钻孔技术和样本制备的知识，以及是否投入了相对 inexpensive 的设备。当有关 取样和预处理方法的清晰指导可用时，这些挑战很容易克服。本文旨在以清晰、简洁的方式向初次接触这些方法的研究人员传播相关知识。首次应用这些方法的学者应在分析和采集珍贵的考古学与古生物学样本之前，先在易获取的现代动物群样本上进行练习。
对人类和动物牙釉质碳酸盐进行稳定同位素分析的取样是一种简单的操作，已在多个实验室中开展。然而，牙齿钻取相关的技术和方法往往因实验室而异，并倾向于成为一种未被公开共享的内部技术知识。逐层取样具有显著优势，能够识别个体内部饮食摄入和饮水情况的详细变化。不同地区个体之间的差异充分说明了这一点，因为饮食和环境信息会保存在牙釉质的生物磷灰石中。在我们的代表性数据中，来自热带草原的绵羊与来自温带干旱草原的绵羊之间表现出显著的同位素差异（图8）。
实验方案中的关键步骤涉及钻孔的精确性、牙釉质的保存以...
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
我们感谢马克斯·普朗克学会对本研究的资助，以及近期在马克斯·普朗克人类历史科学研究所考古学系建立稳定同位素实验室的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Dremel 微型研磨机 | Dremel | https://www.dremel.com/en_US/products/-/show-product/tools/8050-micro | |
| 金刚石钻头 | Dremel | https://www.dremel.com/en_US/products/-/show-product/accessories/7122-diamond-wheel-point | |
| 1.5 mL 微量离心管 | Sigma Aldrich | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t2422?lang=de®ion=DE&gclid=EAIaIQ obChMI7pHRpauW2QIV77ftCh1p1 wjhEAAYASAAEgKzkvD_BwE | |
| 甲醇 | 线性分子式： CH3OH | ||
| 乙酸 | 线性分子式： CH3CO2H | ||
| Dremel 钻机装置（工作台） | Dremel | https://www.dremel.com/en_US/products/-/show-product/tools/220-01-workstation | |
| 微量离心机 | Thermo Scientific | http://www.thermofisher.com/order/catalog/product/75002401 | |
| 迷你离心机 | Sprout | http://www.heathrowscientific.com/sprout-mini-centrifuge-4 | |
| 冷冻干燥机 | Zirbus Technology | http://www.zirbus.com |
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