网格电子探针可无缝整合并实现大脑内稳定、长期的单神经元水平记录。本方案采用网格电子技术用于 体内 实验，包括网状电子器件的制备、装载至注射针头、立体定位注射、输入/输出接口连接、记录实验以及含有网状探针的组织病理学分析。
本文内容
摘要
摘要
可植入式脑电生理探针因其能够以高时空分辨率记录浅层和深层脑区的神经活动，成为神经科学中的重要工具。然而，由于探针与脑组织之间存在力学和结构上的不匹配，常导致微动和胶质增生，进而在长期记录实验中引起信号不稳定，限制了其应用。相比之下，通过注射器注射超柔性网状电子器件后，该网状探针可与周围脑组织形成无缝且无胶质增生的界面，实现对单个神经元至少一年时间尺度上的稳定追踪。本实验方案详细描述了使用注射式网状电子器件进行典型小鼠神经记录实验的关键步骤，包括在多数高校均可实现的标准光刻工艺中制备网状电子器件、将网状电子器件装载至标准毛细玻璃针头，以及立体定位注射 体内，将网状电子器件的输入/输出端连接至标准仪器接口，进行固定或自由活动状态下的记录，以及对包含网状电子器件的脑组织进行组织学切片。文中展示了典型的神经记录与组织学数据。熟悉本方案的研究人员将具备将网状电子器件整合至自身实验所需的知识，从而利用长期稳定的神经接口所带来的独特机遇，开展关于衰老过程、脑发育及脑疾病发病机制的研究。
引言
开发能够以单神经元分辨率绘制大脑图谱的工具，对神经科学和神经病学具有核心重要性。用于神经研究的非侵入性技术，如脑电图（EEG）、脑磁图（MEG）和功能性磁共振成像（fMRI），已被证明在关联人类大脑活动与行为方面具有重要价值1,2，但它们在空间和时间分辨率上尚不足以在微米级和毫秒级的基本尺度上研究神经网络的结构与动态3,4。某些皮层脑电图（ECoG）探针以及使用电压敏感性染料的光学成像方法已成功实现了在体单细胞放电活动的记录in vivo5,6，但通常仅在脑表面附近有效，限制了 其在浅层脑区研究中的 应用。相比之下，可植入式电极探针能够在自由活动的动物中从几乎任何脑区记录单个神经元的电生理信号，且无需荧光标记，这使其成为系统神经科学不可或缺的工具，尤其随着半导体工业的微加工技术将通道数提升至数百乃至数千3,7,8,9。凭借这些能力，可植入式电极探针已在神经科学与神经病学领域作出诸多重要贡献，包括视觉系统中信息处理的基础研究10、帕金森病等神经系统疾病的治疗11，以及用于先进假肢的脑机接口（BMIs）的实现12,13。
然而，长期不稳定性表现为数周至数月时间尺度上的峰电位幅度下降和信号不稳定14,15，这限制了可植入探针在相对较短时间现象研究中的应用，导致诸如大脑衰老与发育等问题在很大程度上仍未得到解答。这种长期不稳定性源于传统探针与脑组织在尺寸、力学性能和拓扑结构上的不匹配14,15,16,17,18。在尺寸方面，神经元突触和胞体的直径分别约为几十纳米至几十微米19，而传统探针通常显著更大，例如硅基微电极阵列的尺寸通常超过单个神经元胞体的>4倍7,8。探针相对较大的尺寸可能破坏致密神经组织的天然结构与连接性，从而引发慢性免疫反应，并干扰所研究的神经环路。在力学性能方面，传统探针的刚度远高于其植入的极为柔软的神经组织；即便是由10–20 µm厚聚酰亚胺薄膜制成的"柔性"探针，其刚度也至少比脑组织高100,000倍20,21。这种弯曲刚度的不匹配会导致探针与脑组织之间产生相对剪切运动，从而在长时间记录中造成单个神经元信号追踪不可靠，并在植入部位诱发慢性胶质增生。最后，传统脑探针的拓扑结构必然排除了一定体积的组织。这种拓扑结构的不匹配会破坏神经环路的连接性，阻碍神经元、胶质细胞和血管在脑组织中自然的三维（3D）互穿分布22，并妨碍信号分子的三维扩散23。综上所述，传统探针的这些缺陷使其难以满足临床应用以及单神经元水平长期神经科学研究所需的长期生物相容性。
为了克服这些不足，我们致力于通过开发一种新范式，模糊神经系统与电子系统之间的界限 "类组织的" 称为网状电子神经探针16,21,24网格电子器件通过以下方式解决了上述在尺寸、力学性能和拓扑结构方面的匹配问题：（1）具有与神经组织相同纳米至微米尺度的结构特征，（2）力学性能与脑组织相似，（3）具备三维大孔拓扑结构 >90% 的开放空间，从而允许神经元的侵入以及分子在细胞外环境中的扩散。通过注射器和针头，网状电子探针可被精确递送至特定脑区，在植入过程中即使针对深部脑区也能造成最小的急性损伤。21,25神经元胞体和轴突在注射后数周内已显示出可相互渗透进入开放的三维网状电子探针结构，从而在记录电子器件与周围脑组织之间形成无缝且无胶质增生的界面21,26,27这些独特特性使得网格电子探针能够在至少一年的时间尺度上稳定地追踪同一单个神经元的放电活动27此外，基于光刻技术（PL）的网状电子器件制备方法可实现所集成电极数量的高度可扩展性，采用简单的接触式掩模光刻技术即可实现每探针多达128个电极的通道数28 即插即用的输入/输出（I/O）设计，可实现与外设电子设备的快速电气连接，且无需使用专用设备29.
多种研究均可从将网状电子器件整合到测量方案中获益。大多数皮层内记录实验均可受益于网状电子器件通过注射器注射实现的微创植入过程、植入后显著降低的免疫反应，以及在后续组织学和免疫染色过程中可将网状电子器件保留在组织内的能力，从而对每个记录位点周围的生物微环境进行精确分析。尤其是长期记录实验，将得益于网状电子器件能够连续数月乃至数年追踪大量单个神经元的独特能力。这一能力为以往难以实现的单神经元分辨率研究创造了条件，例如神经回路的纵向衰老研究、发育中大脑的研究，以及脑病发病机制的探究16。
在本方案中，我们描述了使用可注射式网状电子器件进行典型小鼠神经记录实验的全部关键步骤（见图1）。所描述的步骤包括在许多大学均可实现的标准PL基工艺中制备网状电子器件、将网状电子器件装载至标准毛细玻璃针头、立体定位法将网状电子器件进行体内注射、将网状电子器件的输入/输出端连接至标准仪器接口、在固定状态或自由活动状态下进行神经信号记录，以及对包含网状电子器件的脑组织进行组织学切片。部分仅将网状电子器件用于组织学研究的研究人员可能无需进行电学连接与记录，此类情况下可跳过相关步骤。研究人员在熟悉本方案后，将具备在其自身实验中应用网状电子器件所需的全部知识。
方案
所有对脊椎动物实验对象进行的操作均经哈佛大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。
1. 网状电子器件的制备
注意：本节所述操作流程适用于标准大学洁净室设施内部使用，例如哈佛大学的纳米系统中心（Center for Nanoscale Systems, CNS）。此类设施向美国各地的外部用户开放，例如可通过美国国家科学基金会（NSF）支持的国家纳米技术基础设施网络（National Nanotechnology Infrastructure Network, NNIN）申请使用。在这些设施中，本节所述的许多工具、设备和材料均随洁净室使用权限一并提供，无需单独购买。
警告：在制造网状电子器件的过程中使用的多种化学试剂具有危险性，包括光刻胶、CD-26、PG剥离剂、SU-8显影液以及镍蚀刻液。使用这些化学试剂前，请查阅其材料安全数据表（MSDS），并始终采取和遵守适当的安全防护措施。
- 在洁净的硅片上热蒸发沉积100 nm的镍。
注意：典型的沉积参数为本底压力 5 x 10-7 T 速率为 1–2 Å/s。镍的薄层作为牺牲层，后续将被溶解，以从晶圆上释放出网格电子器件。 - 使用第一个光刻掩模（PL掩模-1）通过SU-8负性光刻胶定义网格电子器件的底部钝化层图2A).
注意：光刻（PL）是一种标准的微加工技术，其中紫外光（UV）照射到覆盖在光敏基底上的掩模上。光照区域在基底上会变为不溶性（负性光刻胶）或可溶性（正性光刻胶）。掩模图案通过计算机辅助设计（CAD）软件绘制，随后通常向供应商订购。使用掩模对准仪将掩模与基底上已有的图案对准，并进行紫外光曝光。网状电子器件的制备需要四种不同的掩模（PL掩模-1至PL掩模-4）。我们的掩模设计可通过申请或访问资源网站meshelectronics.org获取。- 以4,000 rpm的转速在晶圆上旋涂SU-8 2000.5负性光刻胶，获得约400–500 nm厚度的SU-8薄膜。
- 在热板上将晶圆于65 °C下软烘1分钟，随后于95 °C下烘1分钟。
- 将晶圆装入掩模对准器，使用对应于底部网格SU-8层的PL掩模1对SU-8进行曝光。在i线（365 nm波长）条件下，以100 mJ/cm²的剂量进行曝光。2.
- 在热板上对晶圆进行后烘烤，65 °C 下 1 分钟，随后 95 °C 下 1 分钟。
- 将晶圆浸入SU-8显影液托盘中，轻轻搅动溶液2分钟，直至SU-8中的网格图案完全显影。随后在异丙醇托盘中冲洗1分钟，并用气流吹干。
- 在热板上于 180 °C 对晶圆进行坚膜烘烤 1 小时。
注意：SU-8 通常在显影后于 150 °C 至 250 °C 进行硬烘焙。硬烘焙可退火在显影过程中可能形成的任何表面裂纹 固化并进一步交联SU-8，以确保机械稳定性。底部SU-8层在180 °C、顶部SU-8层在190 °C下进行硬烘烤，可获得适用于网格电子器件的良好效果。
- 使用PL掩模-2定义金属互连和I/O焊盘（图2B).
- 以 4000 rpm 的转速在晶圆上旋涂 LOR3A，获得约 300 nm 的厚度。
注意：LOR3A 是一种基于聚二甲基戊二酰亚胺的光刻胶，可在后续金属化过程中加速形成底切结构。 - 在热板上于 180 °C 烘烤晶圆 5 分钟。
- 以4000 rpm的转速旋涂S1805正性光刻胶，获得约500 nm的厚度。
- 将晶圆在115 °C的热板上烘烤1分钟。
- 将晶圆装入掩模对准器中，使用对应金属互连和I/O焊盘的PL掩模-2对S1805进行曝光。在h线（405 nm波长）条件下，以40 mJ/cm²的剂量进行曝光。2.
- 将晶圆浸入CD-26光刻胶显影液托盘中，轻轻搅动溶液1分钟，直至金属互连图案完全显影。随后在去离子水（DI）托盘中冲洗1分钟，并用气流吹干。
- 热蒸镀3 nm的Cr，随后蒸镀80 nm的Au。
注意：基底压力最多为 5 x 10-7 T 和 1 Å/s 的沉积速率通常可获得最佳薄膜质量。 - 将晶圆浸入盛有PG剥离剂的平底烧杯中，约3小时，直至金属层完全被 undercut，仅在网状电子器件所需的互连和I/O焊盘区域保留金属。用异丙醇冲洗并吹干。
- 以 4000 rpm 的转速在晶圆上旋涂 LOR3A，获得约 300 nm 的厚度。
- 使用 PL 掩模-3 定义 Pt 电极（图2C).
- 重复步骤 1.3.1 至 1.3.4。
- 将晶圆装入掩模对准器中，使用对应于铂电极的PL-3掩模对S1805进行曝光。在h线波长下以40 mJ/cm的剂量进行曝光。2.
- 将晶圆浸入盛有CD-26光刻胶显影液的托盘中，轻轻搅动溶液1分钟，直至铂电极图形完全显影。随后在去离子水托盘中冲洗1分钟，并用气流吹干。
- 使用电子束蒸发仪沉积3 nm的Cr，随后沉积50 nm的Pt。
注意：典型的沉积参数为本底压力 5 x 10-7 T 和 2 Å/s 的速率。 - 将晶圆浸入盛有PG剥离剂的平底烧杯中，约3小时，直至金属层完全被 undercut，仅在网状电子器件的预定电极位置保留铂（Pt）。随后用异丙醇冲洗并吹干。
- 使用PL掩模-4，通过SU-8负性光刻胶定义网格电子器件的顶层钝化层图 2D).
- 重复步骤 1.2.1 至 1.2.5，但使用对应于 SU-8 顶层钝化网格层的 PL 掩模-4 进行曝光。
- 在热板上于 190 °C 对晶圆进行坚膜烘烤 1 小时。
注意：此温度比底部SU-8的坚膜温度（步骤1.2.6）高10 °C。该较高温度会使底部SU-8发生轻微流动，从而与顶部SU-8层融合，形成单一、连续的SU-8结构。
- 网格电子器件现已完成（图 2E 和 图3）；通过溶解镍牺牲层，使样品从硅晶圆上释放。
- 将晶圆在50 W的氧气等离子体中处理1分钟。该步骤可氧化SU-8表面，使其具有亲水性，从而便于网格在水溶液中迅速分散悬浮。
- 在平底烧杯中，按体积比1:1:20分别加入盐酸、氯化铁和去离子水，配制镍蚀刻液。
- 将晶圆浸入盛有镍蚀刻液的平底烧杯中，约3小时，直至网状电子器件完全从硅晶圆上释放。
- 使用巴斯德吸管将释放的网状电子探针从镍蚀刻液转移至盛有去离子水（DI）的100 mL烧杯中。至少更换新鲜去离子水烧杯3次，以确保充分清洗网状电子器件。
- 使用巴斯德移液管将网状电子器件转移至70%/30%乙醇/水溶液中进行消毒，然后用移液管将网状电子器件转移至无菌水中冲洗。
注意：灭菌后，可将网状电子器件转移至其他溶液中进行功能化处理。例如，为促进细胞黏附，可将网状电子器件转移至含聚-D-赖氨酸（1 mg/mL）的水溶液中孵育24小时。 - 使用巴斯德吸管将网状电子探针转移至含有100 mL无菌1x磷酸盐缓冲液的烧杯中 磷酸盐缓冲液（PBS）注射前处理 体内.
2. 将网状电子器件装入针头
- 移液器支架在购买时两端均开放流通。使用环氧树脂将与圆形螺钉固定器相对的一端密封，以防止注射过程中发生泄漏（图 4A）。待环氧树脂固化后再继续操作。
- 将玻璃毛细移液针插入移液器 holder 中，使用圆形紧固螺钉和锥形垫圈固定。图4B）。本方案使用内径为 400 µm（外径为 650 µm）的玻璃毛细针。其他毛细针材料（例如，金属）和直径可能有所不同，但可能需要调整网格电子器件的设计以确保可注射性。
注意：本实验室使用过内径为150 µm至1.17 mm（外径为250 µm至1.5 mm）的毛细注射针。通过使横向与纵向SU-8网格单元之间的夹角更趋锐角、减小SU-8网格单元的宽度、使用更薄的SU-8材料以及采用更粗的（即较大的晶胞）网格结构。专为较小毛细管针设计的网格光刻掩模可通过申请或从资源网站 meshelectronics.org 获取。带有玻璃毛细管针的 内径为400 µm、外径为550 µm的导管也可商业获取。此类导管可在保持与需要400 µm内径的网格兼容的同时，减少注射引起的急性组织损伤，但本研究所述实验未使用此类导管。 - 使用一段2–4 cm长的毛细管，将1 mL注射器连接到移液器 holder 的侧端出口。
- 将玻璃毛细管针插入装有网状电子器件的100 mL PBS烧杯中。将针尖置于网状电子探针的I/O焊盘附近，手动回拉注射器，将网状电子探针吸入针管内图5 和 补充视频 1).
注意：当网状电子探针悬浮在溶液中时，I/O 焊盘、茎部互连区域和网状器件区域可通过肉眼清晰识别。这使得能够以正确方向将网状电子器件无误地装入针头中。 - 在盐水中推动/拉动注射器活塞，以调整针头内网状电子器件的位置。
注意：理想的位置是将超柔性网状器件区域尽可能靠近针头末端。这种配置可最大限度地减少注入脑内的液体体积，同时确保先注入器件区域，最后注入I/O焊盘。 - 小心地将毛细管从移液器 holder 的侧端出口取下。应缓慢拆卸，以避免产生吸力，防止吸力导致针头内网状电子器件的位置发生偏移。
3. 将网状电子器件立体定位注射至活体小鼠脑内
注意：小鼠通过腹腔注射75 mg/kg氯胺酮和1 mg/kg右美托咪啶混合物进行麻醉。手术开始前，采用脚趾夹捏法确认麻醉深度。麻醉期间，将小鼠置于37 °C恒温毯上以维持体温。手术过程中严格执行无菌操作技术，包括但不限于：所有金属手术器械使用前经高压灭菌1小时，佩戴无菌手套，术中持续使用干热珠灭菌器，维持手术区域的无菌环境，以及用70%乙醇对塑料器械进行消毒。 脱毛后的头皮皮肤在切口前用碘伏进行消毒。对于存活手术，在手术结束后，伤口周围涂抹抗生素软膏，并将小鼠放回配备37 °C加热垫的笼子中。在小鼠恢复足够的意识以维持胸卧位之前，不得使其无人看管。小鼠给予布托啡诺镇痛 术后每12小时通过腹腔注射给予0.05 mg/kg体重剂量的镇痛剂，持续最多72小时。术后小鼠需与其他动物隔离。小鼠可通过腹腔注射戊巴比妥（剂量为270 mg/kg体重）或经心脏灌注（见步骤6.1）实施安乐死。研究者可参考Geiger， 等30，Kirby， 等31，和 Gage， 等.32 有关啮齿类动物立体定位手术的详细信息。
- 麻醉小鼠，并将其固定在立体定位仪上。
- 在小鼠眼睛上涂抹眼用润滑剂，以防止麻醉期间角膜干燥。
- 使用牙科钻和立体定位仪在颅骨的预定坐标处开颅，形成颅骨窗；另在远离注射位点的位置打开第二个颅骨窗，用于植入不锈钢接地螺钉或导线。
- 用牙科水泥将夹持基板固定在颅骨上。在基板上切割出约1 mm宽的缝隙，以提高后续操作中折叠步骤的可靠性。
注：将扁平柔性电缆（FFC）裁剪成"L"形效果良好（图7A），但只要材料厚度适合32通道零插入力（ZIF）连接器（设计用于 厚度为0.18 ± 0.05 mm的电缆），其他多种材料亦可使用。 - 使用直角末端夹具将装有含网状电子器件针头的移液器 holder 安装到立体定位仪上（图4C 和 图6A）。
- 将移液器 holder 的侧向出口通过长约0.5–1 m的毛细管连接至安装在注射泵上的5 mL注射器（图6D）。
注：连接移液器 holder 前，务必确保毛细管中无气泡。气泡可能在注射过程中中断液体流动，导致网状电子器件无法平稳、可控地递送。 - 使用立体定位仪将针头尖端定位至脑内预定起始位置。
注：本实验所用的网状电子探针设计为记录电极沿约2 mm长度分布，首个电极距离网状电子器件起始边缘（图3A中最左侧边缘）约0.5 mm。因此，立体定位坐标应选择为比目标脑区深0.5 mm的位置。记录电极在网状电子结构中的分布与位置可在掩模设计阶段自由设定，应确保在沿立体定位轨迹注射时，记录电极能够覆盖目标脑区（或多个脑区）。 - 调整摄像头位置（图6B），使其显示玻璃针头内网状电子探针的顶端。部分软件允许用户在屏幕上绘制一条线，标记网状电子器件的原始位置。
- 将注射泵设置为低速并按下启动键，开始液体流动。对于内径为400 µm的毛细针头，通常以10 mL/h作为起始流速。若网状电子探针在针头内未移动，可缓慢增加流速。
注：必须尽量减少注入脑内的液体体积，以免损伤注射部位周围的组织。每注射1 mm长度的网状结构，注入体积小于25 µL时效果最佳；理想值应低于此体积的一半。在本实验室中，通常每注射4 mm长度的网状结构，注入10–50 µL。 - 当网状电子探针开始在针头内移动时，以相同速度使用立体定位仪同步回撤针头，并以标记的网状电子器件原始位置作为参考。
注：该操作方法称为视场（FoV）注射法25，可实现网状电子器件向目标脑区的精确递送，避免折叠或移位。通常在网状电子探针开始移动后可降低流速。在本实验室中，初始常需20–30 mL/h的流速以克服网状结构与毛细针管壁之间的静摩擦力，但一旦注射过程启动，即可将流速降至10 mL/h。对于更小直径的毛细针头，通常需要更低的流速和注射体积。 - 持续灌注生理盐水并回撤针头，直至针头完全退出颅骨，随后停止注射泵的液体流动。
4. 输入/输出接口
注意：此时，网状电子探针已从大脑内选定的起始点沿预定轨迹注入。注射针已回撤至颅骨开孔上方，网状电子器件的互连部分从大脑延伸至注射针，而输入/输出焊盘仍位于针内（图7B）。本步骤使用印刷电路板（PCB；图7、图8）与网状电子探针进行连接。该电路板通过绝缘基底将零插入力（ZIF）连接器与32通道标准放大器连接器相连，构成神经记录实验的前置放大头戴装置。该PCB可根据不同的头戴装置配置进行定制。我们的设计文件可根据请求获取，或从资源网站 meshelectronics.org 下载，并可用于向印刷电路板制造与组装服务商低价采购PCB。
- 使用立体定位仪小心引导针头到达 FFC 夹持基底并穿过间隙，同时通过注射泵输送溶液，使网状电子器件的互连部分产生松弛（图 7C）。
- 当针头位于夹持基底上方并穿过间隙后，恢复快速流速，将网状电子器件的 I/O 焊盘喷射到夹持基底上（图 7D）。
- 使用镊子和去离子水（DI）移液器，将 I/O 焊盘弯曲至约 90° 角，弯曲位置应尽可能靠近第一个 I/O 焊盘。
注意：弯曲是必要的，以便在后续步骤中将焊盘插入印刷电路板（PCB）上的 ZIF 连接器。ZIF 连接器的宽度与网状电子探针的 32 个 I/O 焊盘完全相同 ，因此若弯曲角度不精确为 90°，或弯曲位置未紧邻第一个 I/O 焊盘，则可能需要剪除部分 I/O 焊盘（如 图 7E 中最左侧的焊盘）。 - 当 I/O 焊盘对齐、展开并与其主干呈 90° 角时，用轻柔流动的压缩空气原位干燥。
注意：少于 32 通道的网状电子探针也可使用相同的 32 通道接口板进行连接。例如，我们实验室通常将 16 通道的网状电子探针与 32 通道的 PCB 配合使用。这可在 ZIF 连接器内提供额外空间，使连接更便捷，且未连接的额外通道可通过记录期间的阻抗测试轻松识别为开路。 - 在距离 I/O 焊盘边缘约 0.5–1 mm 处沿直线切割夹持基底。同时剪除夹持基底上可能妨碍插入 PCB 上 32 通道 ZIF 连接器的多余部分（图 7F）。
- 将 I/O 焊盘插入 PCB 上的 ZIF 连接器，并关闭锁扣（图 7G）。使用测量电子设备测量各通道与接地螺钉之间的阻抗，以确认连接成功。若阻抗值过高，应打开 ZIF 连接器锁扣，调整插入位置后重新测试，直至确认连接成功。
- 用牙科水泥覆盖 ZIF 连接器及暴露的网状电子器件互连部分以提供保护。在基底间隙处翻转 PCB，并用牙科水泥将其固定在小鼠颅骨上（图 7H）。
注意：在间隙处弯曲 FFC 可减少可能损坏网状电子器件互连部分的机械应力。 - 让牙科水泥固化，从而将 PCB 转变为坚固紧凑的头部接口装置，用于后续记录会话中的信号连接（图 7I）。
5. 神经记录实验
- 将小鼠放入尾静脉固定器或其他固定装置中33。将前置放大器PCB插入头级PCB上的标准放大器连接口。使用单独的导线将参考螺钉接地。
- 对于固定状态下的记录，保持小鼠处于固定装置中。使用数据采集系统记录所需时长的数据（图8A）。
- 对于自由活动状态下的记录，在插入前置放大器PCB并完成参考螺钉接地后，将小鼠从固定装置中释放。在小鼠自由活动的同时，使用数据采集系统记录所需时长的数据（图8B）。
- 记录结束后，如有必要，将小鼠重新放入固定装置中。移除接地导线和前置放大器，然后将小鼠放回笼中，并送回动物饲养设施，直至下一次记录会话。
6. 组织切片、染色与成像
- 注射后等待至所需时间点，然后麻醉小鼠并经心脏灌注甲醛。取出脑组织，冷冻并以10 µm厚度进行冰冻切片。有关啮齿类动物脑组织免疫组织化学与冰冻切片的详细方案可参见 Evilsizor。 等.34.
注意：即使监测电子元件仍保留在组织内，含网状电子器件的脑组织也可进行常规固定和切片。这一特性是传统神经探针所不具备的，后者必须在切片前移除，因而可能改变组织结构，或难以分析探针与组织界面的情况。 - 用1×溶液冲洗冷冻脑组织切片3次 PBS
- 在含有0.3% Triton X-100和5%驴血清的1x溶液中封闭组织切片 PBS，室温静置1小时。
- 将切片与一抗溶液孵育。所用一抗溶液为兔抗 NeuN 抗体（1:200 稀释）、小鼠抗 Neurofilament 抗体（1:400 稀释）和大鼠抗 GFAP 抗体（1:500 稀释），均含 0.3% Triton X-100 和 3% 山羊血清。4 °C 下孵育过夜。
- 将切片用1x缓冲液冲洗9次，总计40分钟 PBS
- 将脑切片与二抗溶液孵育。此处使用的二抗溶液为 Alexa Fluor 488 标记的山羊抗兔 IgG（1:200 稀释）、Alexa Fluor 568 标记的山羊抗小鼠 IgG（1:200 稀释）和 Alexa Fluor 647 标记的山羊抗大鼠 IgG（1:200 稀释）。室温孵育 1 小时。
- 将切片用1×缓冲液冲洗9次，总计30分钟 PBS
- 使用抗荧光淬灭封片剂将切片封固于载玻片上并加盖盖玻片。封片后避光静置至少24小时，再进行成像。
- 使用共聚焦显微镜，分别以488 nm、561 nm和633 nm激光作为激发光源，对Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 568和Alexa Fluor 647进行成像。在同一台显微镜上使用微分干涉差（DIC）技术对网状电子器件进行成像，以便后续图像叠加与分析。
结果
结果会因研究中的动物种类、靶向脑区、注射后经过的时间、注射过程中造成的急性损伤程度以及输入/输出接口手术的成功与否等多种因素而有所不同。单个神经元的放电活动可能在注射后1天（使用内径为150 µm的针头时）至1周内才开始出现，且放电幅度可能在长达4–6周内持续变化。图9展示了将32通道网状电子探针注射到成年雄性C57BL/6J小鼠海马体和初级体感皮层后获得的代表性电生理数据。在全部32个通道上均记录到约300 µV幅度的局部场电位（LFP），并在26个通道上记录到单个神经元的放电活动。在2至4个月期间，LFP和分离出的放电信号保持稳定，表明记录电子器件与神经元之间在此长期时间内形成了高度稳定的接口。图10展示了注射1年后含有网状电子器件的脑组织切片及免疫染色的代表性结果。对神经元胞体标志物NeuN和神经轴突标志物神经丝蛋白（neurofilament）的染色显示，注射部位几乎没有组织密度的损失，提示网状电子器件与脑组织之间实现了无缝整合。对星形胶质细胞标志物GFAP的染色进一步显示，网状电子器件周围星形胶质细胞水平接近本底，表明其存在几乎未引发慢性免疫反应。
图 1：可注射式网状电子器件实验的步骤。 本方案描述了使用网状电子器件进行典型啮齿类动物神经记录实验中的所有关键步骤。实验通常按以下顺序进行：（1）网状电子器件的制备，（2）将网状电子器件装载至毛细玻璃针头中，（3）通过立体定位将网状电子器件注射入脑内，（4）实现与网状电子器件的电学输入/输出连接，（5）固定状态或自由活动状态下的电生理记录，以及（6）对网状电子器件与组织进行切片和染色以进行组织学分析。在某些研究中，可能仅需获取组织学数据，此时可省略步骤（4）和（5）。请点击此处查看该图的放大版本。
图 2：示意图展示即插即用型网状电子器件在超柔性器件区域（第一行）、茎状互连区域（第二行）和输入/输出（I/O）区域（第三行）的制造流程。（A）使用 PL 掩模-1 对 SU-8 负性光刻胶（红色）进行图形化，以定义每个即插即用型网状电子探针的底部钝化层。（B）使用 PL 掩模-2 进行图形化，通过热蒸发和金属剥离工艺形成 Au 互连线路和 I/O 焊盘（金色）。（C）使用 PL 掩模-3 进行图形化，通过电子束蒸发和金属剥离工艺定义 Pt 电极（蓝色）。（D）使用 PL 掩模-4 对 SU-8 负性光刻胶（红色）进行图形化，以定义顶部钝化层。在每个 Pt 电极和 I/O 焊盘位置处，SU-8 上保留开口。（E）一个完整的网状电子探针，其中虚线框表示上方、中段和下方各行放大区域的位置。光刻掩模设计文件可向作者或资源网站 meshelectronics.org 申请获取。请点击此处查看该图的放大版本。
图3：即插即用型网状电子器件的照片与光学显微镜图像。（A）带有即插即用输入/输出（I/O）接口的可注射式网状电子探针的拼接光学显微图像。该探针在完成图2所示的全部 fabrication 步骤后、但尚未从镍涂层基底上释放时成像。虚线框从左至右分别对应超柔性器件区域、茎部和I/O区域，其放大图像见C、D和E。比例尺 = 1 mm。（B）包含20个已完成的网状电子探针的3英寸硅晶圆照片。比例尺 = 20 mm。（C）超柔性器件区域内直径为20 µm的铂记录电极的光学显微镜图像。比例尺 = 100 µm。（D）茎部区域高密度金互连结构的光学显微镜图像。每条金互连独立电隔离，并将单个铂电极连接至单个I/O焊盘。比例尺 = 100 µm。（E）I/O焊盘的光学显微镜图像。每个焊盘由位于茎部上的可塌陷网格区域和连续薄膜区域组成。非导电的SU-8条带将各焊盘的网格部分连接在一起，以帮助维持对准。比例尺 = 200 µm。 请点击此处查看此图的放大版本。
图4：注射过程中用于固定毛细玻璃针的装置组装示意图。（A）装置各组件的照片。组件包括：（1）毛细玻璃针，（2）移液器 holder，（3）移液器 holder 的圆形螺钉紧固件，以及（4）移液器 holder 的锥形垫圈。其中（2）至（4）项随移液器 holder 的购买一并提供。箭头标示了移液器 holder 的出口，需用环氧树脂胶将其封闭。（B）组装完成后插入毛细玻璃针的移液器 holder 照片。移液器 holder 顶部出口处可见添加的环氧树脂（箭头所示），毛细管将移液器 holder 与注射器连接（注射器未显示）。（C）使用直角端夹将移液器 holder 与毛细玻璃针固定于立体定位仪上的照片。比例尺为 1 cm。请点击此处查看该图的放大版本。
图 5：将网状电子器件装入玻璃针头。（A）即插即用型网状电子器件装入过程的示意图。将玻璃针头置于悬浮于溶液中的网状电子探针的输入/输出端附近，然后手动回抽注射器活塞，以吸入网状电子探针。理想的位置是使超柔性器件区域刚好位于针头末端内部。（B）与（A）相对应的网状电子探针装入玻璃针头的实际照片。比例尺 = 2 mm。请点击此处查看该图的放大版本。
图6：立体定位手术系统的示意图。 使用配备有移液管固定器的电动立体定位仪（A）将针头定位至目标脑区。通过物镜和连接的相机（B）监测针头及装载的网状电子器件的位置，并在计算机上（C）显示。注射泵（D）通过针头输送精确体积的生理盐水，从而实现将网状电子器件准确、可控地注射到目标脑区。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 7：即插即用型输入/输出接口连接流程。（A）将扁平柔性电缆（FFC）夹持基板用牙科水泥固定在颅骨开窗部位附近。（B）采用视场（FoV）方法，通过立体定位将即插即用型网状电子器件注入目标脑区。（C）将针头重新定位至FFC夹持基板上方，此时网状电子探针的输入/输出（I/O）焊盘仍位于针管内部。（D）恢复液体流动，通过针头将I/O焊盘推出并沉积到FFC夹持基板上。（E）将I/O焊盘相对于主干弯曲90°，展开并使导电面朝上，随后原位干燥固定。（F）使用剪刀将FFC基板修剪至距离I/O焊盘边缘约0.5 mm处的直线，切除多余基板，以便插入32通道零插入力（ZIF）连接器。（G）将I/O焊盘插入安装在定制印刷电路板（PCB）上的32通道ZIF连接器中，并闭合ZIF连接器的锁扣以实现与I/O焊盘的电接触。（H）用牙科水泥封闭锁扣，将PCB翻转贴合至颅骨表面，并用牙科水泥固定。（I）PCB形成一个紧凑的前置放大头戴装置，配备标准放大器接口，便于记录过程中快速连接。比例尺 = 1 cm。请点击此处查看该图的放大版本。
图8：固定状态与自由活动状态下的记录。（A）一只雄性C57BL/6J小鼠在记录过程中被固定于束缚装置中的照片。一个32通道前置放大器PCB已插入标准放大器连接器中。（B）同一只小鼠在进行自由活动记录实验时，携带32通道前置放大器PCB的照片。比例尺 = 1 cm。请点击此处查看该图的放大版本。
图9：代表性神经记录结果。（A）将32通道网状电子探针注射至小鼠海马体和体感皮层后获得的代表性局部场电位（LFP）热图。数据记录时小鼠在注射后2个月（上图）和4个月（下图）自由探索其笼子。LFP振幅根据右侧色标进行颜色编码。高通滤波后的迹线（黑色）显示了每个32通道频谱图上叠加的放电活动。（B）对（A）中绘制的数据进行分类后分离出的尖峰信号。在注射后2个月（上图）和4个月（下图），32个通道中的26个均检测到单细胞放电活动。每个尖峰簇上方的数字对应于（A）中的通道编号。该图改编自Fu, et al.28。请点击此处查看此图的放大版本。
图10：代表性组织学结果。（A）示意图，展示网状电子器件在水平（中图）和矢状（下图）脑切片中的取向。（B）注射16通道网状电子器件探针一年后，10 µm厚皮层脑切片的荧光显微镜图像。该切片经NeuN免疫染色（绿色）。（C）同一脑切片经神经丝蛋白免疫染色（红色）。（D）同一脑切片经GFAP免疫染色（青色）。（E）（B）至（D）的合并图像，显示网状电子器件与组织界面，其中NeuN（绿色）、神经丝蛋白（红色）、GFAP（青色）和网状电子器件（蓝色）被标记。比例尺 = 100 µm。本图改编自Fu et al.27。请点击此处查看此图的放大版本。
补充视频 1：网格电子器件在溶液中的重复装载与注射。 请点击此处下载该文件。
讨论
在网状电子器件的制备和使用过程中，所有步骤都很重要，但其中一些尤为关键。在将网状电子器件从晶圆上释放之前，必须对其表面进行氧化处理，以使网状结构能够易于悬浮于水溶液中（步骤1.6.1）。如果跳过此步骤，网状结构通常会漂浮在水面上，难以装入针头；即使能够装入，也常常会粘附在玻璃针内壁，导致需要使用较大体积的液体>100 µL）进行注射。因此，若在释放前未能对表面进行氧化处理，通常意味着网格无法使用，必须从头重新制备。另一个关键步骤是弯曲网格电子器件 "茎" 在I/O接口连接过程中（步骤4.3），应将角度调整至约90°。如果角度小于90°，则全部32个I/O焊盘将无法完全插入ZIF连接器；部分焊盘需从末端切除以实现插入，从而减少连接的电极数量。操作过程中还须轻柔进行，以防茎部断裂。
通过修改光刻掩模并采用图2中所述的相同制备流程，可以针对不同应用定制化设计网状电子器件。例如，用于记录图9中数据的网状电子探针被设计为在小鼠海马体和初级体感皮层区域分布32个记录电极，但超柔性网状结构中的电极位置可被灵活选择以靶向几乎任意脑区，也可集成用于刺激的较大电极27。基本的网状结构和制备流程保持不变，仅调整电极的位置与设计以满足特定研究需求。然而，研究人员应谨慎操作，并始终验证经修改的设计能否顺利通过预定的注射针头。网状电子器件弯曲力学性能的微小变化可能对其可注射性产生显著影响。一个典型例子是：当横向与纵向SU-8条带之间的夹角为45°时，网状电子探针可轻松注射；而当夹角为90°时，则会导致探针皱缩并堵塞针头21。
测量记录电极的阻抗有助于排查问题。当测量频率为1 kHz时，直径为20 µm的圆形铂电极的阻抗幅值应接近1 MΩ。 体内 或在1×PBS中29阻抗显著大于此值表明电极未暴露，可能由于电极被光刻胶残留物污染，或未形成有效电连接所致。后者可能发生在例如光刻过程中光掩模表面存在灰尘，导致金互连结构断开，或在输入/输出接口连接时，ZIF连接器引脚未能与网格的某个I/O焊盘接触。若测得的阻抗值约为预期值的一半，则提示该通道可能与相邻通道发生短路，形成两个电极阻抗并联的电路。测量所得的阻抗值可作为故障排查的参考依据；结合对网状电子探针的光学显微镜观察，通常可在下一次制备流程或输入/输出连接尝试中识别并纠正问题根源。
使用可注射式网状电子器件进行急性研究存在局限性，因为通常在注射后1周内无法观察到单个神经元的放电活动27，尽管近期工作（未发表）表明该问题容易克服。观察到放电活动所需时间的关键决定因素包括网状结构的设计、随网状电子器件注入脑内的液体体积，以及注射所用针头的直径，因为这些因素会影响注射过程中的组织损伤程度和愈合速度。如果网状电子器件在镍蚀刻液中释放前未经过氧等离子体处理，则可能需要较大的注射体积；也就是说，如果网状结构不具备亲水性，可能会黏附于玻璃针头。偶尔，网状结构存在缺陷，导致其弯曲力学性能不佳，难以注射。在装载网状电子器件时，重要的是要检查网状结构是否能在针头内顺畅、平稳地移动（如图所示） 补充视频 1）。如果不符合，则应使用其他网状电子探针。实现无缝神经接口的最佳效果时，每4毫米注入的网状长度对应的理想注射体积为10–50 µL。近期使用更细网状电子探针和/或更小直径毛细注射针（内径小至150 µm，外径250 µm）的结果表明，单个神经元的放电活动可在注射后不久（急性期测量）直至较长时间内被观测到。这些更细网状结构的掩模设计文件可根据请求获取，或从资源网站meshelectronics.org下载。我们估计整体的产量为 体内 使用内径400 µm（外径650 µm）的针头进行网格注射时，成功率约为70%，而在我们近期使用内径150 µm（外径250 µm）针头的工作中，成功率接近80–90%。注射失败最常见的原因包括：（1）网格无法顺利注入，导致向脑内注入意外大体积的液体，从而引起脑水肿；（2）在输入/输出接口操作过程中，手动操作导致网格断裂；（3）注射过程中损伤血管引起出血。注射时损伤血管的情况较为罕见（占失败原因的不到10%），若采用影像引导手术可进一步降低该风险。我们还注意到，血管损伤是所有涉及穿透脑组织操作的常见局限性，包括病毒颗粒注射用于转染、刚性脑探针植入以及网格电子器件的注射。
如图9和图10所示，网状电子探针能够在数月到数年的时间尺度上稳定地记录并追踪相同的单个神经元，且几乎不引发慢性免疫反应。与传统的深部电极相比，这一特性具有显著优势；传统深部电极在长期记录实验过程中通常会出现尖峰信号幅度下降、信号不稳定以及慢性炎症等问题14,15。此外，网状电子探针还具有可在组织学切片、染色和成像过程中保留在组织内的优势，而传统探针因过于刚性，必须在组织学分析前移除。因此，网状电子探针具备独特的能力，可结合免疫组织化学分析，精确研究每个记录位点周围的细胞微环境。
本文所述方案为神经科学领域开辟了令人振奋的新机遇。这种微创递送方法以及网状电子器件与脑组织的无缝整合，可最大限度地减少对神经回路的干扰，并避免慢性免疫反应，因而有望广泛适用于多种类型的长期神经记录实验。网状电子器件能够长期记录并追踪同一单个神经元的活动，这一特性尤其有助于研究人员探索毫秒级的放电活动与衰老、脑部疾病发病机制或脑发育等持续数月乃至数年的生物学过程之间的相关性16,18。此外，该方案还具有显著的拓展与定制空间，例如可在印刷电路板前端加入有源电子元件，以实现数字多路复用8,35、无线通信35,36,37和信号处理35等功能；在注射网状电子器件的同时共注射干细胞或聚合物，以促进组织再生18,38,39；或将纳米线场效应晶体管（NW-FETs）整合入网状电子器件中，开发高度局部化、多功能的脑探针24,29,40,41,42。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
C.M.L. 感谢美国空军科学研究办公室（FA9550-14-1-0136）、哈佛大学物理科学与工程加速器奖以及美国国立卫生研究院院长先锋奖（1DP1EB025835-01）对本工作的资助。T.G.S. 感谢美国国防部（DoD）通过国家国防科学 & 工程研究生奖学金（NDSEG）项目。G.H. 感谢美国心脏协会（16POST27250219）以及美国国立卫生研究院国家衰老研究所的独立研究之路奖（Parent K99/R00）提供的资助。本研究部分工作在哈佛大学纳米系统中心（CNS）完成，该中心是国家纳米技术协调基础设施网络（NNCI）的成员，由美国国家科学基金会通过NSF ECCS奖号1541959资助支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 电动立体定位仪 | World Precision Instruments | MTM-3 | 小鼠立体定位手术 |
| 512通道记录控制器 | Intan Technologies | C3004 | 神经记录系统的一个组成部分 |
| RHD2132 放大器板 | Intan Technologies | C3314 | 神经记录系统的一个组成部分 |
| RHD2000 3 英尺超薄 SPI 接口电缆 | Intan Technologies | C3213 | 神经记录系统的一个组成部分 |
| 小鼠固定器 | Braintree Scientific | TV-150 标准差 | 标准1.25英寸内径；用于在固定式记录期间限制小鼠活动。 |
| 硅片 | Nova 电子材料 | 3" P &<100> 0.001–0.005 欧姆·厘米 356–406 μ微米厚 Prime级 SSP Si 晶圆，带2个半标准平边 &&<br/> 6,000 A°±双面5%湿法热氧化层 | |
| 光刻掩模（镀铬钠钙玻璃） | 推进可重复性 | Advance Reproductions 和其他供应商可根据提供的设计文件制作光掩模。我们的光掩模设计文件可通过申请或访问资源网站 meshelectronics.org 获取。此外，部分大学的洁净室配备有光掩模写入设备，可用于现场制作光掩模。 | |
| AutoCAD 软件 | Autodesk Inc. | 用于绘制光掩模的设计软件。一个免费的替代选择是 LayoutEditor。我们的光掩模设计文件可根据请求获取，或从资源网站 meshelectronics.org 获得。 | |
| 热蒸发仪 | Sharon 真空泵 | 用于在制造过程中将镍（Ni）、铬（Cr）和金（Au）蒸发沉积到网状电子器件上。许多大学的洁净室均配备此类或类似的设备。 | |
| SU-8 2000.5 负性光刻胶 | MicroChem 公司 | 用于定义网格电子器件底部和顶部钝化层的负性光刻胶。 | |
| MA6 掩模对准器 | Karl Suss Microtec AG | 用于将每块光掩模与晶圆上的图案对齐，并用紫外光曝光晶圆。大多数大学的洁净室均配备此类或类似的设备。 | |
| SU-8显影液 | MicroChem Corp. | 用于在紫外光曝光后使SU-8负性光刻胶显影。 | |
| LOR3A 剥离型光刻胶 | MicroChem 公司 | 与Shipley 1805光刻胶配合使用，以在金属剥离过程中促进侧向刻蚀 | |
| Shipley 1805 正性光刻胶 | Microposit，陶氏化学公司 | 用于在网状电子器件中定义金属互连和铂电极的正性光刻胶 | |
| MF-CD-26 正性光刻胶显影液 | Microposit，The Dow Chemical Company | 在掩模对准仪中曝光后，使用S1805正性光刻胶进行显影。许多大学的洁净室均备有该化学品。 | |
| 旋涂仪 | 雷诺兹科技 | 用于在晶圆上涂覆正性及负性光刻胶。大多数大学的洁净室均配备有匀胶机。 | |
| PJ等离子体表面处理系统 | AST Products, Inc. | 用于在将网状电子器件释放到水溶液之前氧化其表面。大多数大学的洁净室都配备有此类或类似的设备。 | |
| 电子束蒸发仪 | Denton Vacuum | 用于在制造网状电子器件过程中蒸发铬和铂。许多大学的洁净室均配备此类或类似的设备。 | |
| PG去除剂 | MicroChem Corp. | 用于在金属剥离过程中溶解 LOR3A 和 Shipley S1805 光刻胶 | |
| 氯化铁溶液 | MG Chemicals | 415-1L | Ni刻蚀溶液的一种组分 |
| 36% 盐酸溶液 | Kanto Corp. | Ni刻蚀溶液的一种组分 | |
| 玻璃毛细管针 | Drummond Scientific Co. | 内径 0.40 mm，外径 0.65 mm。其他直径也可提供。 | |
| U型微移液管夹持器 | Molecular Devices, LLC | 1-HL-U | 用于在立体定位注射过程中固定玻璃毛细管针 |
| 1 mL注射器 | NORM-JECT®, Henke Sass Wolf | 用于将网状电子器件手动装载至毛细玻璃针中 | |
| 聚乙烯颅内导管管路 | 贝克顿·迪金森公司 | 内径 1.19 mm，外径 1.70 mm | |
| 5 mL 注射器 | Becton Dickinson and Company | 用于注射泵中，以在活体内注射网状电子器件 | |
| 目镜相机 | Thorlabs Inc. | DCC1240C | 用于在注射过程中观察毛细玻璃针内的网状电子器件 |
| 用于USB相机的ThorCam uc480图像采集软件 | Thorlabs Inc. | 用于在注射过程中观察毛细玻璃针内的网状电子器件 | |
| 注射泵 | 哈佛仪器 | PHD 2000 | 用于在注射网状电子器件时，通过毛细针精确输送溶液的体积 |
| EXL-M40 牙科钻机 | Osada | 3144-830 | 用于钻取颅骨开窗 |
| 0.9 mm 钻头 | 精细科学工具 | 19007-09 | 用于钻取颅骨开窗 |
| 热珠灭菌器 14 cm | Fine Science Tools | 18000-50 | 用于对手术器械进行灭菌 |
| CM1950 冷冻切片仪 | Leica Microsystems | 用于将冷冻组织切成切片。许多大学在共享实验平台中配备此类或类似的设备。 | |
| 0.3% Triton X-100 | Life Technologies | 用于组织学 | |
| 5% 山羊血清 | Life Technologies | 用于组织学 | |
| 3% 山羊血清 | Life Technologies | 用于组织学 | |
| 兔抗 NeuN | Abcam | ab177487 | 用于组织学 |
| 小鼠抗神经丝蛋白 | Abcam | ab8135 | 用于组织学 |
| 大鼠抗GFAP | Thermo Fisher Scientific Inc. | PA516291 | 用于组织学 |
| ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂 | Thermo Fisher Scientific Inc. | P36930 | 用于组织学 |
| 聚-D-赖氨酸 | Sigma-Aldrich 公司 | P6407-5MG | 分子量 = 70-150 kDa |
| 直角端部夹具 | Thorlabs Inc. | RA180/M | 用于将移液管固定器连接至立体定位仪框架 |
| 印刷电路板（PCB） | 高级电路 | 用于连接网状电子器件与外周测量电子设备（如Intan记录系统）。Advanced Circuits及其他厂商可根据提供的设计文件制造和组装印刷电路板（PCB）。我们的PCB设计文件可通过申请或访问资源网站meshelectronics.org获取。 | |
| 32通道标准放大器连接器 | Omnetics Connector Corp. | A79024-001 | 组件组装到PCB上 |
| 32通道扁平柔性电缆（FFC） | Molex, LLC | 152660339 | 用作夹紧基底，以连接PCB上的ZIF连接器与网格电子器件的输入/输出焊盘 |
| 32通道零插拔力（ZIF）连接器 | Hirose Electric Co., LTD | FH12A-32S-0.5SH(55) | 组件组装到印刷电路板上 |
参考文献
- Lopes da Silva, F. EEG and MEG: relevance to neuroscience. Neuron. 80 (5), 1112-1128 (2013).
- Logothetis, N. K. What we can do and what we cannot do with fMRI. Nature. 453 (7197), 869-878 (2008).
- Seymour, J. P., Wu, F., Wise, K. D., Yoon, E. State-of-the-art MEMS and microsystem tools for brain research. Microsystems & Nanoengineering. 3, 16066(2017).
- Buzsaki, G. Rhythms of the Brain. , Oxford University Press. (2006).
- Khodagholy, D., et al. NeuroGrid: recording action potentials from the surface of the brain. Nature Neuroscience. , (2014).
- Hamel, E. J., Grewe, B. F., Parker, J. G., Schnitzer, M. J. Cellular level brain imaging in behaving mammals: an engineering approach. Neuron. 86 (1), 140-159 (2015).
- Jun, J. J., et al. Fully integrated silicon probes for high-density recording of neural activity. Nature. 551 (7679), 232-236 (2017).
- Berenyi, A., et al. Large-scale, high-density (up to 512 channels) recording of local circuits in behaving animals. Journal of Neurophysiology. 111 (5), 1132-1149 (2014).
- Scholvin, J., et al. Close-Packed Silicon Microelectrodes for Scalable Spatially Oversampled Neural Recording. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 63 (1), 120-130 (2016).
- Schiller, P. H. The Central Visual System. Vision Research. 26 (9), 1351-1386 (1986).
- Benabid, A. L., Chabardes, S., Mitrofanis, J., Pollak, P. Deep brain stimulation of the subthalamic nucleus for the treatment of Parkinson's disease. The Lancet Neurology. 8 (1), 67-81 (2009).
- Hochberg, L. R., et al. Reach and grasp by people with tetraplegia using a neurally controlled robotic arm. Nature. 485 (7398), 372-375 (2012).
- Lebedev, M. A., Nicolelis, M. A. Brain-Machine Interfaces: From Basic Science to Neuroprostheses and Neurorehabilitation. Physiological Reviews. 97 (2), 767-837 (2017).
- Polikov, V. S., Tresco, P. A., Reichert, W. M. Response of brain tissue to chronically implanted neural electrodes. Journal of Neuroscience Methods. 148 (1), 1-18 (2005).
- Perge, J. A., et al. Intra-day signal instabilities affect decoding performance in an intracortical neural interface system. Journal of Neural Engineering. 10 (3), 036004(2013).
- Hong, G., Yang, X., Zhou, T., Lieber, C. M. Mesh electronics: a new paradigm for tissue-like brain probes. Current Opinion in Neurobiology. 50, 33-41 (2017).
- Dai, X., Hong, G., Gao, T., Lieber, C. M. Mesh Nanoelectronics: Seamless Integration of Electronics with Tissues. Accounts of Chemical Research. 51 (2), 309-318 (2018).
- Feiner, R., Dvir, T. Tissue-electronics interfaces: from implantable devices to engineered tissues. Nature Reviews Materials. 3 (1), 17076(2017).
- Kandel, E. R., Schwartz, J. H., Jessell, T. M., Siegelbaum, S. A., Hudspeth, A. J. Principles of Neural Science. , McFraw-Hill. (2013).
- Rousche, P. J., et al. Flexible polyimide-based intracortical electrode arrays with bioactive capability. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 48 (3), 361-371 (2001).
- Liu, J., et al. Syringe-injectable electronics. Nature Nanotechnology. 10 (7), 629-636 (2015).
- Kasthuri, N., et al. Saturated Reconstruction of a Volume of Neocortex. Cell. 162 (3), 648-661 (2015).
- Saxena, T., Bellamkonda, R. V. A sensor web for neurons. Nature Materials. 14, 1190-1191 (2015).
- Xie, C., et al. Three-dimensional macroporous nanoelectronic networks as minimally invasive brain probes. Nature Materials. 14 (12), 1286-1292 (2015).
- Hong, G., et al. Syringe Injectable Electronics: Precise Targeted Delivery with Quantitative Input/Output Connectivity. Nano Letters. 15 (10), 6979-6984 (2015).
- Zhou, T., et al. Syringe-injectable mesh electronics integrate seamlessly with minimal chronic immune response in the brain. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (23), 5894-5899 (2017).
- Fu, T. M., et al. Stable long-term chronic brain mapping at the single-neuron level. Nature Methods. 13 (10), 875-882 (2016).
- Fu, T. M., Hong, G., Viveros, R. D., Zhou, T., Lieber, C. M. Highly scalable multichannel mesh electronics for stable chronic brain electrophysiology. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (47), E10046-E10055 (2017).
- Schuhmann, T. G. Jr, Yao, J., Hong, G., Fu, T. M., Lieber, C. M. Syringe-Injectable Electronics with a Plug-and-Play Input/Output Interface. Nano Letters. 17 (9), 5836-5842 (2017).
- Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable stereotaxic surgery in rodents. Journal of Visualized Experiments. (20), (2008).
- Kirby, E. D., Jensen, K., Goosens, K. A., Kaufer, D. Stereotaxic surgery for excitotoxic lesion of specific brain areas in the adult rat. Journal of Visualized Experiments. (65), e4079(2012).
- Gage, G. J., et al. Surgical implantation of chronic neural electrodes for recording single unit activity and electrocorticographic signals. Journal of Visualized Experiments. (60), (2012).
- JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Rodent Handling and Restraint Techniques. , Journal of Visualized Experiments. Cambridge, MA. Available from: https://www.jove.com/science-education/10221/rodent-handling-and-restraint-techniques (2018).
- Evilsizor, M. N., Ray-Jones, H. F., Lifshitz, J., Ziebell, J. Primer for immunohistochemistry on cryosectioned rat brain tissue: example staining for microglia and neurons. Journal of Visualized Experiments. 10 (99), e52293(2015).
- Sodagar, A. M., Perlin, G. E., Yao, Y., Najafi, K., Wise, K. D. An Implantable 64-Channel Wireless Microsystem for Single-Unit Neural Recording. IEEE Journal of Solid-State Circuits. 44 (9), 2591-2604 (2009).
- Wentz, C. T., et al. A wirelessly powered and controlled device for optical neural control of freely-behaving animals. Journal of Neural Engineering. 8 (4), 046021(2011).
- Harrison, R. R., et al. Wireless neural recording with single low-power integrated circuit. IEEE Transactions on Neural Systems and Rehabilitation Engineering. 17 (4), 322-329 (2009).
- Landa, N., et al. Effect of injectable alginate implant on cardiac remodeling and function after recent and old infarcts in rat. Circulation. 117 (11), 1388-1396 (2008).
- Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., Di Carlo, D., Segura, T. Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks. Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).
- Zhang, A., Lieber, C. M. Nano-Bioelectronics. Chemical Reviews. 116 (1), 215-257 (2016).
- Zhou, W., Dai, X., Lieber, C. M. Advances in nanowire bioelectronics. Reports on Progress in Physics. 80 (1), 016701(2017).
- Dai, X., Zhou, W., Gao, T., Liu, J., Lieber, C. M. Three-dimensional mapping and regulation of action potential propagation in nanoelectronics-innervated tissues. Nature Nanotechnology. 11 (9), 776-782 (2016).
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