利用巴恩斯迷宫和困境中的破坏范式分析小鼠的空间学习和社会行为

Summary

该协议使用巴恩斯迷宫测量空间学习和记忆。一种新的遇险损伤范式被用来评估小鼠的运动活动和亲社会行为。

Abstract

巴恩斯迷宫是一个可靠的测量空间学习和记忆, 不需要食物限制或暴露在极度紧张的刺激。巴恩斯迷宫还可以评估其他鼠标行为, 如逃离迷宫平台的一般动机和探索性行为。巴恩斯迷宫可以测量基因突变或环境变量是否会影响空间记忆的获取和保留, 并提供有关小鼠所采用的搜索策略的信息。在这里, 我们使用巴恩斯迷宫来检测一个单一的发育乙醇暴露事件后, 成年小鼠的记忆缺陷。新描述的遇险破坏范式将一只雄性老鼠暴露在被困在竞技场开放中心场的一个房间里的雌性老鼠面前。它为老鼠提供了一个机会, 以社会反应被困的女性和表现亲社会的行为。遇险损伤范式也可以用来考察鼠标在新领域的行为, 并测量运动活动。巴恩斯迷宫和破坏困境协议都需要最低限度的财政投资, 测试的大部分方面都可以用普通的实验室用品构建。这些灵活且可访问的工具也可用于检测开发过程中的行为变化。

Introduction

该协议的目的是测量使用巴恩斯迷宫的小鼠的空间学习和记忆, 以及使用遇险破坏模式的社会响应和运动。常用的啮齿类动物空间学习和记忆测试包括径向臂迷宫, 它测量老鼠在多勺子装置的一个手臂中找到隐藏食物的能力, 以及莫里斯水迷宫, 它将老鼠放在一个大的浴缸或水池里,评估找到一个隐藏的水下平台所需的时间。通常情况下, 这些范例的培训跨越多个试验, 并允许通过短期和长期记忆试验测量学习获取率和保留率。

尽管无线电臂迷宫和莫里斯水迷宫是测试啮齿类动物记忆的可靠方法, 但它们给一些研究人员带来了并发症。两个迷宫使用剥夺或强烈的厌恶^{刺激作为增强 1}。放射状手臂迷宫使用食物剥夺, 以确保老鼠有适当的动力找到食物奖励。在莫里斯水迷宫中, 强制游泳引起的压力效应可能会改变小鼠^2号的结果。

巴恩斯迷宫是一个替代的空间意识任务, 需要啮齿类动物学习一个洞的位置, 以逃避明亮, 开放迷宫表面³。然后, 弱厌恶刺激 (光或声音) 被用来增加小鼠逃离平台的可能性。巴恩斯迷宫不需要食物剥夺, 所以动物的准备量比放射状手臂迷宫少。它可以使用没有冲突的研究人员谁正在调查的行为或分子与饮食, 激素调节, 或下丘脑途径。

巴恩斯迷宫也有优势比莫里斯水迷宫。它的压力比莫里斯水迷宫小, 导致小鼠⁴的皮质酮水平较低。此外, 它的组装要简单得多, 在测试过程和存储过程中需要的专用空间也较少。

遇险损伤试验是一个简单的两部分实验, 可以评估运动活动, 然后亲社会行为。遇险损伤法的目的是评估雄性啮齿类动物对被困雌性啮齿类动物的探索行为和社会反应能力。评估社交能力 (以及偏好社会新颖性) 的常用方法是使用 crawley 的三室社交测试, 该测试评估老鼠在靠近或远离其他老鼠⁵时的自由选择。

类似于克劳利的三室社交测试, 遇险测试也衡量如何在另一只老鼠面前花费时间的自由选择, 但它也为社会功能的更深层次提供了测量: 1) 在遇险损伤试验中, 被困的雌性小鼠被控制在一个开放的领域的中心, 所以男性对一个开放的领域的潜在厌恶与他的运动, 以社会探索或调查一个痛苦的女性锥形。2) 遇险破坏模型还提供了一种方法来评估亲社会和同情行为, 以回应被困的老鼠, 这在小鼠中并不经常探索。

动物移情肯定是可观察和测量的, 虽然没有多少的范式存在于这一目的。例如, 在老鼠身上, 被困的笼子伴侣可以诱发一种亲社会的动力状态, 在这种状态下, 老鼠将努力释放被困的动物。事实上, 老鼠甚至会选择在打开一个装有巧克力零食的类似容器之前帮助被困的动物, 然后进入巧克力并与新释放的老鼠分享.

小鼠的移情措施通常涉及疼痛的产生;事实上, 观察其他老鼠疼痛的老鼠自己对疼痛更敏感.约束应激是啮齿类动物特有的现象, 并与休克相结合, 以检查应激反应, 作为衡量小鼠^{9,10 的}移情的一种尺度。

有一些伦理方面的考虑与诱发疼痛或休克, 因此需要压力诱导的替代品。我们开发了危难破坏范式, 作为在没有疼痛或休克治疗的情况下衡量同情行为的一种尺度。在我们的遇险筑鼠协议中被困的老鼠在仅仅几分钟后就显示出明显的痛苦迹象, 因为它们无法在小容器内掉头, 但它们没有受到伤害, 同时也为其他老鼠提供了应对痛苦的机会。

为了开始遇险的评估, 一只雄性老鼠被放置在一个大型的小说竞技场, 里面有一个空的小中央圆筒。探索行为记录了几分钟, 包括竞技场有多少部分被划过, 在中央空地上花费了多少时间。这种方法提供了一种快速而简单的方法来排除运动缺陷, 因为它是学习情况下的一个潜在的混合体, 需要协调运动才能成功完成。它还提供了一个基本的衡量, 以衡量对开放中心场的厌恶程度。这两种措施都可能影响巴恩斯迷宫的性能。

在最初的探索之后, 雄性被移出竞技场, 一只雌性老鼠被放置在一个封闭的、透明的中央小圆筒中 (类似于用来收集老鼠血液的圆筒)。然后, 将原来的雄性老鼠重新引入竞技场, 再次对探索行为进行评分。遇险破坏模式评估老鼠是否对基于行为模式变化的社会交往感兴趣, 当被困女性在场时 (根据在中心广场花费的时间和挖掘次数来评分), 以及鼠标对被困女性表现出亲社会行为 (根据圆筒调查的数量和与被困女性的接触事件得分)。遇险损伤试验可用于测量社会新奇的倾向 (类似于克劳利的三室社交性测试), 这取决于研究人员是否捕获了熟悉的或新颖的老鼠。

巴恩斯迷宫和遇险破坏实验结合在一起, 可以在没有极大压力的刺激下准确评估老鼠的学习能力和社会反应能力。与所有行为检测一样, 这些实验应该对动物体验非常敏感, 最大限度地减少动物所经历的不适。

与大多数迷宫一样, 运动活动的差异可能会影响巴恩斯迷宫的性能, 因此研究人员也应该评估运动活动, 特别是当使用巴恩斯迷宫评估小鼠学习的突变可能会损害运动 (如在亨廷顿病小鼠模型中发现的, 或者那些接触毒素的人, 可能会诱发多动症或延缓运动, 如乙醇)。此外, 迷宫和室内表面应彻底清洁, 并在每种动物之间更换床上用品, 以避免气味提示糖果。

重要的是, 所有材料都可以在现场制造, 只需最低限度的财务投资, 这些检测的物理足迹很小, 这意味着这些实验几乎可以在任何环境中复制, 从而具有极大的灵活性。这种无障碍环境使良好的科学能够在资源有限的较小机构或在缺乏大量支持的情况下需要迅速收集试点数据的情况下进行。

Protocol

这里描述的所有方法都得到了汉普顿-悉尼学院或兰道夫-麦孔学院动物护理和使用机构委员会 (iacuc) 的批准 (以前在那里进行过一些工作)。

1. 老鼠的基本住房

1. 将老鼠放在塑料笼子里, 有坚固的底部和侧面, 还有一层柔软的床上用品和筑巢材料, 如碎纸材料。使用由碎玉米芯或木屑组成的床上用品, 并确保床上用品定期更换, 以确保卫生。
2. 提供食物和水.塑料笼子的顶部有一个食物漏斗。从食物料斗中配发配制的小鼠食品颗粒, 并提供饮水机。确保保持架顶部配有空气过滤器, 以保护小鼠免受外界污染物的污染。
3. 在住房设施中遵循12小时的光暗循环, 保持小鼠的自然生理节律。在一天中的同一时间进行行为测试, 最好是在动物的黑暗周期内, 比如晚上。
   注: 应注意区分外壳中的小鼠。有各种方法可以区分小鼠, 如耳拳、耳标和尾巴标记。

2. 巴恩斯迷宫测试: 建筑

1. 获取直径为120厘米的圆形木板。
2. 在圆形周围切割20个圆形孔 (直径4.5 厘米)。将每个孔放置在距离迷宫边缘2.5 厘米和距离相邻孔13厘米的地方。
3. 平滑表面并将其涂成光滑的白色 (建议使用明亮的颜色)。
4. 指定迷宫板的一侧插入大约2-3 厘米远的20个孔中的每一个小杯钩, 并为每个孔放置两个挂钩 (每个孔的两侧一个)。
5. 使用浅黑色 (塑料) 盘, 用钩子覆盖迷宫一侧的孔。使用挂钩固定厚的橡皮筋, 以便将磁盘固定在迷宫的底部。
6. 安全地将巴恩斯迷宫安装在离地面120厘米的地方, 远离其他类似的高物体, 如桌子或椅子。一个盒子或凳子可以用来支撑迷宫的中间。
7. 将每面墙上一个形状的白色大海报作为迷宫3面的超迷宫提示放置。每次试验都要在迷宫周围的墙上贴上海报。
8. 在迷宫的最后一侧, 设置一个坚实的黑色窗帘来隐藏观察者, 以便在迷宫上的老鼠看不到研究人员的情况下准确记录数据。
9. 将摄像机挂在竞技场上, 对整个迷宫表面有鸟图。
10. 在每次小鼠试验之前和之后, 用清水清洗迷宫的每一个表面 (包括黑色的圆盘和目标盒子), 然后用70% 的乙醇溶液。
11. 将 100 w 光源放置在迷宫中心25厘米处 (在试验开始时关闭), 并确保磁盘和挂钩面向地面。
    注: 在测试过程中, 应关闭室内所有其他头顶灯。建议在 100 w 光旁边添加一个超声波噪声制造商。在每次试验开始时将其关闭。

3. 巴恩斯迷宫测试: 程序

注: 确保在每次试验前后用清水和70% 乙醇溶液清洗所有迷宫组件, 以便在测试恢复之前有时间完全干燥。一定要准备好清洁用品以及试验的计时器。

1. 在使用可靠的识别方法的同时, 将所有小鼠分组。当老鼠没有在迷宫上积极奔跑时, 把它们放在试验室外。这是为了确保他们没有受到超声波噪音器过早。
2. 用手上的爪子轻轻地把老鼠从尾巴底部捡起来, 把它们拿去处理。
3. 为了训练, 让老鼠每天在迷宫上连续运行一次, 连续 7天, 以评估学习/习得。
   注: 一个单一的长期试验可以在以后的日期, 以评估内存/保留率。目前的协议训练青春期小鼠从产后32天开始, 并在4个月大的成年人中进行了长期试验。
4. 将每个鼠标随机分配到一个目标孔, 以便在整个测试期间使用。这些孔可以标记为1-20 在迷宫的底部或外部的迷宫周长, 在迷宫中的鼠标看不到它们。
5. 将分配的孔盘更换为一个小黑匣子 (23 x 11 厘米)。使用连接到最近的挂钩的橡皮筋将其牢固地连接到巴恩斯迷宫上。
   注: 目标框足够浅, 以便鼠标可以轻松地下到它或包含一个步骤, 以确保鼠标不必跳入它。
6. 将鼠标放在迷宫的中心杯下, 以适应 30秒, 直到测试开始。开始视频录制。
7. 打开光和超声波噪音器。通过弦机制提起杯子, 以避免偏移动物的初始标题。启动计时器, 坐在窗帘后面观察。
8. 鼠标进入目标孔后, 用试验开始时使用的相同不透明杯或粘合剂覆盖孔, 关闭超声波噪音器。如果鼠标在经过5分钟后仍未进入目标, 请将鼠标合并到目标孔中。
   1. 确保鼠标进入孔。当鼠标在目标箱内时, 盖孔并关闭噪音器。允许鼠标在目标框中保持1分钟不受干扰。
9. 虽然在整个训练期间, 每个鼠标的目标孔将保持不变, 但每天按随机顺序运行鼠标, 以确保它们不遵循前一只鼠标留下的任何 cues/气味。

4. 巴恩斯迷宫测试: 数据分析

1. 在巴恩斯迷宫试验期间, 记录以下定时数据: 在迷宫上花费的总时间、查找目标的时间以及输入目标孔的时间。
2. 跟踪鼠标的整体移动, 以确定在找到目标之前和之后的错误数 (探索的不正确孔数)。还要记录从目标孔到探索的第一个孔的距离 (距离是用孔的数量来衡量的), 以及任何显著的梳理行为。
3. 在每次试验中, 用迷宫的图表跟踪每只动物的运动, 并使用它来分析搜索策略, 以及确定在目标对面的象限中探索的孔的数量。使用视频分析来确认路径。

5. 遇险损伤测试: 建造约束室

1. 将一个透明的圆筒切割成长度等于雌性老鼠从尾巴底部到鼻尖的长度。确保气缸的尺寸使放置在里面的鼠标无法转动。
   注: 我们将50毫升锥形管的锥形端切割下来, 为1个月大的小鼠制作4厘米长的管, 为4个月大的小鼠制作一根8厘米长的管。
2. 盖帽的两端, 以便可以拆除和重新连接其中一个盖帽。冲孔3-4 个孔, 每个盖帽约0.5 厘米。确保孔足够大, 以便小鼠和呼吸12之间的鼻子接触.
   注: 或者, 也可以使用血液采集过程中的鼠标约束设备。

6. 遇险测试: 准备竞技场

1. 确保竞技场是一个不透明的无级塑料方盒, 38 x 38 厘米, 墙壁19厘米。将其均匀地填充到约2.5 厘米的高度。
   注: 玉米芯床上用品使挖掘事件更容易被检测到。
2. 将摄像机悬停在竞技场上, 以便整个竞技场都能看到。

7. 遇险损伤测试: 探索行为测量

1. 将封闭和空的应力室放置在竞技场的中心。
2. 开始使用悬挂的相机进行录制。
3. 选择一只雄性鼠标。如果老鼠被标记为识别, 请注意这个雄性的身份;如果没有, 请标记此鼠标, 以便在返回到保持架后可以对其进行区分。
4. 轻轻地把雄性老鼠放在竞技场左下角的杯子下面。30秒后, 通过字符串机制取出杯子。
5. 允许鼠标探索 10分钟, 注意在录制过程中远离视野。在10分钟结束时, 将鼠标移出竞技场, 并将其返回到接下来的 5分钟^{1 2分钟的保持}笼子中。
6. 停止录制并使用适当的标识符保存视频文件。

8. 遇险损害测试: 社会反应措施

1. 使用与探索性行为度量相同的竞技场和录制设置。
2. 选择女性鼠标。如果老鼠被标记为识别, 请注意这个雌性的身份;如果没有, 请标记此鼠标, 以便在将鼠标返回到保持架后对其进行区分。
   注: 根据研究问题, 可以使用垃圾、笼状或新型鼠标。如果正在执行多个试验, 请在所有试验中保持关系的类型。
3. 将雌性老鼠轻轻地抓住尾巴的底部, 或在必要时通过颈部约束, 并将其降低到约束室。关闭它背后的开放端, 并确保它无法掉头。
   注意: 考虑戴抗咬手套, 因为雌性老鼠会抵抗进入约束室。
4. 开始使用悬挂的相机进行录制。
5. 将约束室与被困的雌性老鼠放在移情竞技场的中心, 让雌性进入中心10分钟。注意远离女性的视野。
6. 雌性老鼠在约束室呆了5分钟后, 用与以前相同的过程将标记的雄性老鼠放回同理心竞技场。让雄性老鼠多5分钟探索竞技场, 再次注意远离老鼠的视野。
7. 停止录制并使用适当的标识符保存视频文件。
8. 5分钟结束后, 将两只老鼠从竞技场上取出, 放在笼子里。用70% 乙醇12取代玉米床上用品, 对竞技场和应力室进行消毒.

9. 遇险测试: 数据分析

1. 可以使用跟踪软件, 但也可以手动分析视频。一旦视频文件在计算机上可见, 将透明的工作表覆盖在屏幕上, 并使用标记勾画竞技场的正方形。把竞技场方块分成九个相等的隔间。
2. 查看初始探索性度量的前5分钟的视频数据。记录交叉的隔间数量 (运动活动行为)、在竞技场中心广场上花费的时间 (露天场地厌恶)、挖掘和梳理剧集的次数, 以及鼠标触摸空中心约束的次数室。
   注: 在男性10分钟的初步探索中, 没有进行第二次5分钟的评分, 也没有为10分钟的时间进行评分, 女性在男性缺席的情况下被困在中央房间。
3. 在男性与被困女性重新进入竞技场后, 立即查看5分钟的社会反应措施的视频数据。记录与初始探索测量相同的数据, 但另外还记录雄性鼠标用被困的雌性鼠标触摸鼻子的次数。

Results

巴恩斯迷宫

为了说明巴恩斯迷宫是如何使用的, 我们调查了早期一次乙醇暴露是否在小鼠发育过程中造成学习差异。c57bl6 j 小鼠在产后第6天注射 2.5 g/kg 乙醇溶液 (n = 8) 或两次盐水 (n = 6), 间隔两个小时。我们在青春期 (p30) 对这些动物进行了巴恩斯迷宫的训练, 然后在成年 (4个月) 进行了一次长期试验。我们收集的数据可分为几个主要类别: 1) 按时间和错误率的准确性, 2) 目标输入, (3) 映射勘探路径。

按时间和错误率的准确性:

时间测量包括几个重要方面: 到达第一个洞的延迟 (鼠标在开始试验后调查任何第一个洞所需的时间...

Discussion

巴恩斯迷宫和遇险破坏实验是一种廉价、快速、相对简单的方法来评估小鼠的空间学习、运动活动和亲社会行为。其他优势包括动物没有明显的压力源、疼痛或食物限制。与大多数学习记忆范式一样, 巴恩斯迷宫的一个缺点是, 动物需要多少试验才能知道目标孔的位置并进入。

数据采集:

在观察鼠标在这两种范例中的活动和行为时, 应一致地收集数据。对于巴恩斯迷宫, 这包括记录到达第一个洞的时间、它所探索的错误孔的数量、它到达目标孔的时间以及它进入目标孔的时间。此外, 研究人员应绘制迷宫上每只老鼠的路径图。在鼠标运行迷宫的同时, 可以使用巴恩斯迷宫的纸质地图来跟踪数据, 并且可以使用视频画面确认时间和孔号。在跟踪动物时, 每分钟更换一次笔颜色, 以跟踪可能重叠的洞探索, 可能是有帮助的。计算机辅助跟踪系统可用于确保准确性和可靠性, 如 idtracker、ctrax 或跟踪器, 少数是免费或开源的。

对于遇险破坏分析, 记录的数据应包括男性进入多少方块、男性到达雌性所需的时间、当被困的雌性出现时, 男...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Damsel-in-Distress
50 mL锥形管	Fisher Scientific	14-432-22	任何品牌的50 mL锥形管都可以使用
橡皮筋	Sprano品牌	n/a	尺寸62，用于将帽固定在胶合板
锤	Grainger	6R252	任何标准锤都可以工作
钉子（尺寸8D）	Grainger	4NFE3	类似大小的指甲应该同样有效
不透明的裸照塑料盒	AcmePlastics	CUT-TO-SIZE-ACRYLIC-CAST-BLACK-SHEET-2025	不透明塑料，按尺寸切割（30 厘米长 x 19 厘米宽 x 3-6 厘米高）。可以添加台阶以确保鼠标的入射深度不超过 3.5 厘米。
摄像机（智能手机）	N/A	N/	A 任何配备摄像头的智能手机都可以工作
防咬手套	Kent Scientific	GLVDYN02	任何提供适当保护
的品牌 透明片	订书钉	954145	任何品牌的透明塑料片都可以工作，用于评分
Barnes Maze
培养皿	康宁	353025	喷漆并用作巴恩斯迷宫孔的盖子
胶合板（3/4 英寸）	LP Building Products	22487	建造巴恩斯迷宫
喷漆	Krylon	1274937	用于将培养皿盖涂成黑色，用于涂胶合板的白色油漆
杯钩（5/8 英寸）	Ace Hardware	5360615	2 用于腹孔表面的任一侧;橡皮筋缠绕在钩子上以保持盖子平整
海报板	Creatology	n/a	用于迷宫的边缘作为额外的提示
灯泡	菲利普斯	n/a	100W 灯泡，在试验期间使用
橡皮筋	Sprano 品牌	n/a	62 号，用于将盖子固定在胶合板上
超声波噪音制造	器 Victor mini PestChaser	M753SN	用作厌恶剂刺激