高通量DNA提取与基于鳍剪法的3日龄斑马鱼幼鱼基因分型

摘要

斑马鱼已被广泛用作生物医学研究中可靠的遗传学模式生物，尤其是在基因编辑技术出现之后。当预期出现幼体表型时，DNA 提取和基因型鉴定可能具有挑战性。本文介绍了一种高效的斑马鱼幼体基因分型方法，可在受精后 72 小时即通过尾部剪切进行。

摘要

斑马鱼（Danio rerio）拥有与人类疾病相关基因中84%的直系同源基因。此外，这类动物世代周期短，易于操作，繁殖率高，饲养成本低，并可通过向胚胎显微注射DNA的方式方便地进行遗传操作。近年来基因编辑工具的进步使得在斑马鱼中精确引入突变和转基因成为可能。斑马鱼疾病模型常导致幼体出现表型变化或早期死亡，若基因型未知，则表型解读可能面临挑战。在需要样本合并的实验中（如基因表达分析或质谱研究），也需尽早确定基因型。然而，传统的基因型鉴定方法通常仅适用于成年斑马鱼或死亡后的幼鱼，限制了大规模基因分型的应用。为解决这一问题，我们改进了一种可在受精后72小时（hpf）即对活体斑马鱼幼鱼提取可用于PCR的基因组DNA的方法。该技术在先前发表的基因分型方案基础上进行了优化，具有省时、经济的优点，可利用显微取样的鳍组织进行基因型鉴定。幼鱼的鳍组织在取样后能够迅速再生。研究人员由此可借助这一高通量的基于PCR的基因分型流程，筛选并培育具有目标基因型的个体至成年阶段。

引言

斑马鱼（Danio rerio）是一种被广泛用作疾病研究以及治疗假设临床前测试模型的脊椎动物^1,2,3。这类动物具有繁殖周期短、易于操作、繁殖率高、成本低等优点，并且可通过胚胎显微注射DNA的方式方便地进行遗传操作⁴。随着锌指核酸酶（Zinc-Finger nucleases, ZFN）⁵、类转录激活因子效应物核酸酶（TAL-like Effector Nucleases, TALENs）^6,7以及成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/CRISPR相关蛋白9（Cas9）系统⁸等新型转基因和基因编辑技术的不断发展，斑马鱼有望显著促进人们对多种病理状态的理解。这些技术已被用于在斑马鱼的体细胞和生殖细胞中高效构建靶向基因敲除模型，从而成功获得遗传修饰动物⁸。文献中近期的例子包括在斑马鱼中成功建立癫痫和代谢性疾病的遗传模型^3,

方案

涉及动物实验的操作均已获得批准，并符合加拿大动物护理委员会和渥太华大学动物护理委员会提供的动物护理指南。

1. 准备

1. 用 autoclave 胶带将一个 9 cm 培养皿盖的内表面贴好，作为解剖面，并将其置于体视显微镜下。
2. 将受精后 3 - 5 天（dpf）的斑马鱼幼鱼放入培养皿中，并在含 ˜1.5 mM Tricaine 的 1x E3 胚胎培养基（5 mM NaCl、0.17 mM KCl、0.33 mM CaCl₂、0.33 mM MgSO₄，pH 7.2）中进行麻醉。
3. 使用剪刀或刀片将 P1000 移液器吸头末端剪开，使其直径约为 2 mm，以便在最小应激条件下容纳一条 3 dpf 的幼鱼。

2. 斑马鱼幼鱼的鳍部剪切

1. 使用改装过的 P1000 移液枪吸取一条已麻醉的幼鱼，并将其放置在培养皿盖上预先固定好的灭菌胶带上。
2. 用移液枪吸除幼鱼周围多余的三卡因溶液。操作区域应尽可能干燥，以便顺利切取和拾取尾鳍，但仍需保持一定湿润以确保幼鱼存活。
3. 在体视显微镜下使用显微手术刀按照 图1 所示位置切取尾鳍，操作方法参照 Wilkinson et al¹⁶

结果

通过对抗杂合子杂交后代进行基因分型，验证了该方案的效率（aldh7a1^+/ot100，此处显示为 aldh7a1^+/-) (图 3A- C)⁹。该 aldh7a1^ot100 突变等位基因在斑马鱼第一个编码外显子中插入了5个碱基对（bp） aldh7a1 导致移码和功能丧失的基因，因其存在提前终止密码子⁹使用四条引物进行多重反应，获得三条不同的条带，以区分野生型（WT）、杂合子（heterozygous）aldh7a1^+/-）和纯合突变体（aldh7a1^-/-）基因型（来自 Pena， 等

讨论

近年来，基因编辑工具已被用于在斑马鱼中精确引入突变和转基因^5,6,7,8在斑马鱼中进行疾病建模时，通常会观察到早期幼虫或幼体表型^9,12,13,14本方案描述了从小型斑马鱼幼体尾部活检样本中提取可用于PCR的DNA，能够对低至3天龄的幼体进行基因分型。早期鉴定基因型对于多种实验室应用至关重要，尤其是在 事后检验 基因分型无法实现⁹从早期开始了解基因型也有助于突变体的存活率研究和表型分析。本方案对于将特定基因型的幼鱼培育至成体阶段也尤为有用。目前，幼鱼基因分型技术尚未.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
培养皿	Corning	430167
微型手术刀	World Precision Instruments	500249
体视显微镜	Nikon	SMZ1500
三卡因/甲磺酸乙酯-3-氨基苯甲酸	Sigma-Aldrich	E10521
96孔组织培养板	Costar	3595
96孔PCR板	Fisher	14230232
NaOH	Fisher	S25548A
Tris碱	Sigma-Aldrich	T1503
NaCl	Fisher	BP358-10
KCl	Sigma-Aldrich	P3911
MgSO4	Sigma-Aldrich	230391
5% Chelex 100 钠型	Sigma-Aldrich	C7901
GelRed 1x	Biotium	41003
硼酸	Sigma-Aldrich	B6768
Sub-Cell Model 192 系统	Bio-Rad	1704508
30% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液，37.5:1	Bio-Rad	1610158
GoTaq Green Master Mix, 2X	Promega	M7123
纸巾（Kimwipes® 一次性擦拭纸）	Sigma-Aldrich	Z188956
1kb-plus 分子量标记物	Thermo Scientific	SM1343
无核酸酶水	Sigma-Aldrich	W4502
Sub-Cell Model 192 系统（高通量琼脂糖凝胶系统）	Bio-Rad	1704508
垂直凝胶电泳系统 Mini-PROTEAN Tetra Cell	Bio-Rad	1658004