方法文章

高通量DNA提取与基于鳍剪法的3日龄斑马鱼幼鱼基因分型

DOI：

10.3791/58024

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2018年6月29日

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1Children's Hospital of Eastern Ontario Research Institute, 2Department of Biology, University of Ottawa

本文内容

摘要

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斑马鱼已被广泛用作生物医学研究中可靠的遗传学模式生物，尤其是在基因编辑技术出现之后。当预期出现幼体表型时，DNA 提取和基因型鉴定可能具有挑战性。本文介绍了一种高效的斑马鱼幼体基因分型方法，可在受精后 72 小时即通过尾部剪切进行。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

斑马鱼（Danio rerio）拥有与人类疾病相关基因中84%的直系同源基因。此外，这类动物世代周期短，易于操作，繁殖率高，饲养成本低，并可通过向胚胎显微注射DNA的方式方便地进行遗传操作。近年来基因编辑工具的进步使得在斑马鱼中精确引入突变和转基因成为可能。斑马鱼疾病模型常导致幼体出现表型变化或早期死亡，若基因型未知，则表型解读可能面临挑战。在需要样本合并的实验中（如基因表达分析或质谱研究），也需尽早确定基因型。然而，传统的基因型鉴定方法通常仅适用于成年斑马鱼或死亡后的幼鱼，限制了大规模基因分型的应用。为解决这一问题，我们改进了一种可在受精后72小时（hpf）即对活体斑马鱼幼鱼提取可用于PCR的基因组DNA的方法。该技术在先前发表的基因分型方案基础上进行了优化，具有省时、经济的优点，可利用显微取样的鳍组织进行基因型鉴定。幼鱼的鳍组织在取样后能够迅速再生。研究人员由此可借助这一高通量的基于PCR的基因分型流程，筛选并培育具有目标基因型的个体至成年阶段。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

斑马鱼（Danio rerio）是一种被广泛用作疾病研究以及治疗假设临床前测试模型的脊椎动物1,2,3。这类动物具有繁殖周期短、易于操作、繁殖率高、成本低等优点，并且可通过胚胎显微注射DNA的方式方便地进行遗传操作4。随着锌指核酸酶（Zinc-Finger nucleases, ZFN）5、类转录激活因子效应物核酸酶（TAL-like Effector Nucleases, TALENs）6,7以及成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/CRISPR相关蛋白9（Cas9）系统8等新型转基因和基因编辑技术的不断发展，斑马鱼有望显著促进人们对多种病理状态的理解。这些技术已被用于在斑马鱼的体细胞和生殖细胞中高效构建靶向基因敲除模型，从而成功获得遗传修饰动物8。文献中近期的例子包括在斑马鱼中成功建立癫痫和代谢性疾病的遗传模型3,9,10,11,12。

随着斑马鱼基因组编辑技术的进步，快速且可靠的基因分型已成为不可忽视的限速步骤。鉴定预测基因组编辑靶点附近特定DNA突变是该实验方案中的关键环节。传统上，通过鳍条剪取进行基因分型的技术通常仅在幼年或成年斑马鱼中实施。然而，将斑马鱼培养至成年所需的时间（>2个月）会显著延缓研究进展。在许多情况下，由于关键基因被敲除，个体无法达到成年阶段（例如， 在疾病建模中）或导致有害表型效应的获得功能突变。此外，某些检测需要合并幼虫样本，例如进行RNA或代谢物提取时，因此需预先确定基因型，而当仅 事后检验 基因分型技术已有多种可用方法。上述例子凸显了幼体基因分型技术的重要性，这类技术需兼具精确性，同时能够实现幼体的完全回收和正常发育。目前，早期斑马鱼幼体的基因分型尚未得到广泛应用；这一点在近期发表的疾病模型研究中有所体现，这些研究通常通过死后基因分型来确定幼体基因型，而非在实验开始前进行基因分型。12,13,14本文提出了一种幼体鳍条剪切策略，旨在改进既往已建立的基因分型流程。

过去，采用蛋白酶K消化法对活体斑马鱼幼鱼进行基因分型的策略，导致了聚合酶链式反应（PCR）效率不稳定15。尽管最近发表的一种显微尾部活检技术取得了更有希望的结果16，但我们和其他研究团队均未能重现作者所报告的高效率和DNA回收率。Wilkinson  et al.16所述方案的一个主要缺陷可能是将尾部组织转移至PCR管的过程。由于组织尺寸极小，难以确保鳍组织被准确采集并通过移液操作转移。为克服这一障碍，我们开发了一种改进的方案，可对大量活体斑马鱼幼鱼进行基因分型，效率接近100%9。使用显微手术刀切除尾鳍尖端，并将其放置在滤纸片上。含有组织的滤纸片可被清晰观察，并能准确地置入PCR管中。随后进行基因组DNA提取，并通过PCR扩增目标区域以完成样本的基因分型。该方法的优势包括PCR效率高、假阳性率低以及死亡率低。此外，该方案适用于对大量胚胎进行基因分型。本文所述方案可在2至3小时内完成数百尾幼鱼的鳍组织剪取，并可在两天内准确鉴定基因型及尾鳍再生情况。

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方案

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涉及动物实验的操作均已获得批准，并符合加拿大动物护理委员会和渥太华大学动物护理委员会提供的动物护理指南。

1. 准备

  1. 用 autoclave 胶带将一个 9 cm 培养皿盖的内表面贴好，作为解剖面，并将其置于体视显微镜下。
  2. 将受精后 3 - 5 天（dpf）的斑马鱼幼鱼放入培养皿中，并在含 ˜1.5 mM Tricaine 的 1x E3 胚胎培养基（5 mM NaCl、0.17 mM KCl、0.33 mM CaCl2、0.33 mM MgSO4，pH 7.2）中进行麻醉。
  3. 使用剪刀或刀片将 P1000 移液器吸头末端剪开，使其直径约为 2 mm，以便在最小应激条件下容纳一条 3 dpf 的幼鱼。

2. 斑马鱼幼鱼的鳍部剪切

  1. 使用改装过的 P1000 移液枪吸取一条已麻醉的幼鱼，并将其放置在培养皿盖上预先固定好的灭菌胶带上。
  2. 用移液枪吸除幼鱼周围多余的三卡因溶液。操作区域应尽可能干燥，以便顺利切取和拾取尾鳍，但仍需保持一定湿润以确保幼鱼存活。
  3. 在体视显微镜下使用显微手术刀按照 图1 所示位置切取尾鳍，操作方法参照 Wilkinson et al16 的描述。切割时，在尾鳍色素间隙区域施加稳定向下的压力，位置应位于血液循环边界远端（图1A）。操作过程中需施加轻柔压力，避免损伤脊索。
  4. 在显微镜下观察切下的尾鳍，并将其移至显微手术刀刀尖表面（图2A）。将带有尾鳍的手术刀轻轻接触一小片滤纸表面。
    注：由于被切断的组织中含有黑色素细胞，此步骤中尾鳍可呈现为一个小黑点，便于观察（图2B）。
  5. 使用剪刀和镊子（图2C）将带有尾鳍的滤纸转移至 96 孔 PCR 板中，每孔预先加入 25 μL 的 50 mM NaOH 溶液（图2D）。
  6. 准备一个平底 96 孔板，并按 PCR 板的编号对孔位进行标记。使用改装过的 P1000 移液枪吸取 200 µL 新鲜的 1× E3 胚胎培养液，通过轻柔负压小心吸取斑马鱼幼鱼，并将其释放至组织培养板中与 PCR 板相对应编号的孔内（图2E）。
  7. 确保滤纸完全浸没于溶液中（图2F）。每次切割后，需将显微手术刀刀片和镊子浸入 70% 乙醇溶液中清洗，以防止交叉污染，并用洁净的纸巾或擦拭布擦干刀片。
  8. 重复步骤 2.1 至 2.7，直至完成所有胚胎的尾鳍取样。
  9. 将幼鱼保留在 96 孔板中，于 28 °C 条件下培养，直至完成基因型鉴定。
    注：由于该操作可在两天内快速完成，无需更换培养液；若需更长时间，则建议更换培养液。

3. 基因组DNA提取

  1. 密封96孔PCR板，并以1,000 × g离心样品1分钟，确保所有滤纸均浸入NaOH溶液中。
  2. 为进行组织裂解，将样品在PCR仪中95 °C加热5分钟，随后冷却至4 °C，保持10分钟。
  3. 向每个样品中加入6 μL 500 mM Tris-HCl（pH 8.0），涡旋混匀。
  4. 在室温下以1,500 × g短暂离心5分钟。
  5. 每项PCR反应使用1.5 μL DNA上清液。
  6. 按照表1-2所示方法进行PCR以对幼鱼进行基因分型。
    注意：本方案已用于两个应用方向：通过琼脂糖凝胶检测基因型的多重PCR反应9，以及通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）检测基因型的异源双链熔解曲线分析（HMA）17。

4. 使用螯合树脂的基因组替代提取方法

  1. 通过将剪下的鱼鳍连同滤纸条加入含有 30 μL 5% 螯合树脂（含成对亚氨基二乙酸离子的苯乙烯-二乙烯基苯共聚物）的 96 孔 PCR 板中，完成步骤 2.5。
    注意：此类树脂通常用于组织裂解及快速高效地制备可用于 PCR 的 DNA18。
  2. 按照所示步骤 2.6 - 2.8 操作。
  3. 密封 96 孔 PCR 板，并短暂离心样品，确保所有滤纸条均浸没于螯合树脂中。
  4. 为进行组织裂解，将样品在热循环仪中于 95 °C 加热 15 分钟，随后冷却至 4 °C，持续 10 分钟。
    注意：此步骤可实现细胞裂解，同时使极性树脂微珠与细胞组分结合，而 DNA 和 RNA 保留在溶液中。
  5. 短暂离心样品，使树脂微珠沉淀，从而获得悬浮液中的 DNA。
  6. 按照步骤 3.5 - 3.6 完成基因分型流程。

5. 应用示例1：多重PCR扩增后进行琼脂糖凝胶分析

  1. 随后 表1，建立多重 PCR 反应以区分纯合突变体、杂合子和野生型幼鱼。使用 96 孔热循环仪进行 PCR 扩增，并采用如下所述的循环条件 表3.
    注意：PCR 反应也可在任何其他常规 PCR 扩增仪中进行。本示例描述了 Pena 所采用的 PCR 策略。 等9 用于鉴定 aldh7a1 野生型和5个碱基对插入突变等位基因在同一多重反应中。
  2. 在硼酸钠缓冲液中制备含1%琼脂糖的凝胶，并加入1× GelRed染色。
    注意：20倍浓度的硼酸钠缓冲液储备液由40 mL 10 M NaOH和1800 mL ddH₂O组成。2O，用76 g硼酸将pH调至8.5，然后用ddH₂O定容至2 L2O.
  3. 在1×硼酸钠缓冲液中以250 V电压电泳15分钟。为加快流程，若条件允许，使用可兼容多通道移液器的凝胶系统，以减少加样时间，提高通量。
  4. 在紫外光（UV）下成像凝胶，以区分不同基因型。

6. 应用2：异源双链熔解分析

  1. 使用1.5 mm间隔板和15孔梳子制备12%的PAGE凝胶。制备两块PAGE凝胶，每块加入12.21 mL去离子水（ddH2O）、2.52 mL 10x Tris/硼酸/EDTA（TBE）缓冲液、10 mL 30%丙烯酰胺溶液、250 μL 10%过硫酸铵（APS）和20 μL四甲基乙二胺（TEMED）。电泳运行缓冲液使用1x TBE缓冲液（0.089 M Tris-HCl、0.089 M硼酸和0.002 M乙二胺四乙酸（EDTA））。
  2. 将PCR产物在94 °C加热5分钟。
  3. 将离心管置于冰上或在4 °C的PCR仪中冷却10分钟。
  4. 每份PCR样品上样10 μL，分子量标记物上样8 μL。
  5. 在垂直电泳系统中，以1x TBE缓冲液为运行缓冲液，150 V恒压电泳1小时，或直至分子量标记物接近玻璃板底部边缘。
  6. 在紫外光下成像凝胶，以区分不同基因型。

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结果

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通过对抗杂合子杂交后代进行基因分型，验证了该方案的高效性（aldh7a1+/ot100，此处显示为 aldh7a1+/-) (图3A- C)9。该 aldh7a1ot100 突变等位基因在斑马鱼的第一个编码外显子中插入了5个碱基对（bp） aldh7a1 导致移码并因提前出现终止密码子而丧失功能的基因9使用四条引物进行多重反应，获得三条不同的条带，以区分野生型（WT）、杂合子（heterozygous）aldh7a1+/-），以及纯合突变型（aldh7a1-/-）基因型（来自 Pena， 等

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讨论

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近年来，基因编辑工具已被用于在斑马鱼中精确引入突变和转基因5,6,7,8在斑马鱼中进行疾病建模时，通常会观察到早期幼虫或幼体表型9,12,13,14本方案描述了从小型斑马鱼幼体尾部活检样本中提取可用于PCR的DNA，能够对低至3天龄的幼体进行基因分型。早期鉴定基因型对于多种实验室应用至关重要，尤其是在 事后检验 基因分型无法实现9从早期开始了解基因型也有助于突变体的存活率研究和表型分析。本方案对于将特定基因型的幼鱼培育至成体阶段也尤为有用。目前，幼鱼基因分型技术尚未...

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披露

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作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

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作者感谢罕见病模型与机制（RDMM）网络（由加拿大卫生研究院（CIHR）和基因组加拿大资助）。CK 获得渥太华大学本科生科研奖学金（UROP）的支持。DLJ 获得加拿大研究生范尼尔奖学金的支持。IAP 获得加拿大卫生研究院（CIHR）博士后奖学金的支持。作者感谢美国遗传学学会授权发表本方案，并授权使用 Pena 等人补充图 5 的改编版本。 等.

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
培养皿Corning430167
微型手术刀World Precision Instruments500249
体视显微镜NikonSMZ1500
三卡因/甲磺酸乙酯-3-氨基苯甲酸Sigma-AldrichE10521
96孔组织培养板Costar3595
96孔PCR板Fisher14230232
NaOHFisherS25548A 
Tris碱 Sigma-AldrichT1503
NaClFisherBP358-10
KClSigma-AldrichP3911
MgSO4Sigma-Aldrich230391
5% Chelex 100 钠型Sigma-AldrichC7901
GelRed 1xBiotium41003
硼酸Sigma-AldrichB6768
Sub-Cell Model 192 系统Bio-Rad 1704508
30% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液，37.5:1Bio-Rad 1610158
GoTaq Green Master Mix, 2XPromegaM7123
纸巾（Kimwipes® 一次性擦拭纸）Sigma-AldrichZ188956
1kb-plus 分子量标记物 Thermo ScientificSM1343
无核酸酶水 Sigma-AldrichW4502
Sub-Cell Model 192 系统（高通量琼脂糖凝胶系统）Bio-Rad 1704508
垂直凝胶电泳系统 Mini-PROTEAN Tetra Cell Bio-Rad 1658004

参考文献

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  1. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), (2013).
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  17. Zhu, X., et al. An efficient genotyping method for genome-modified animals and human cells generated with CRISPR/Cas9 system. Sci Rep. 4, 6420(2014).
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PCR PCR

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