本文介绍了一种对草莓植株在三维空间中结冰过程进行成像的实验方案。通过将两台红外相机以略微不同的角度放置，生成红蓝立体视频，以观察植株在三维空间中的结冰过程。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
可以利用红外热成像技术监测植物的结冰过程，因为水在结冰时会释放热量。然而，由于颜色对比度的问题，二维（2D）红外图像在解读上存在一定困难。若能以三维（3D）形式观察红外图像或植物结冰过程的视频，则可更准确地识别冰核形成位点以及冻结的扩展过程。本文展示了一种相对简便的方法，用于生成草莓植株结冰过程的三维红外视频。草莓是一种具有重要经济价值的作物，在世界许多地区常遭受春季突发性霜冻的影响。准确理解草莓植株的结冰过程，将为育种人员和种植者提供更经济有效的手段，以防止植株在低温冻结条件下受到损伤。
该技术涉及将两个红外相机以略微不同的角度放置，以拍摄草莓冻结过程。利用屏幕捕获软件同时记录两个相机的视频流，从而实现精确同步。随后将录像导入成像软件，并采用立体红蓝成像技术进行处理。通过红-蓝眼镜观察，三维视频将有助于更准确地确定叶片表面冰核形成的精确位置。
引言
尽管我们生活在三维物理世界中，研究人员却常常受限于以二维形式呈现视觉观察结果。虽然二维图像通常足以传达重要信息，但缺乏深度信息限制了我们感知和理解现实世界物体复杂性的能力。1
这种在深度信息方面的不足促使人们自20世纪初以来主要在商业电影行业中制作3D视频1。然而，静态图像和视频中清晰3D信息的生成受到图像制作过程复杂性的限制。生成3D影片最简单的方法基于立体摄影所采用的原理。立体摄影利用同一物体从略微不同角度拍摄的两幅图像，在人脑中形成3D视觉效果。为实现这一效果，每只眼睛必须仅观看对应的图像（即左眼观看左图像，右眼观看右图像）。由于眼睛无法自然实现这种分离，因此设计了立体视觉头戴设备以实现该功能1。在3D电影的发展过程中，曾采用多种立体观察技术，以及偏振交错、时分复用和头戴式显示技术，但使用红绿（或青色）眼镜的彩色交错或称色差（anaglyph）法是最简单且成本最低的技术之一。有关3D成像及其各种技术的全面综述，可参见Geng的综述文章1。
利用红外热成像技术监测植物中的结冰过程，其原理基于水在结冰时必须释放内部能量2。这种能量以热的形式存在，可在电磁波谱的红外区域被检测到。能够记录红外能量的相机自1929年以来已投入使用3。首次发表的使用红外技术拍摄植物结冰过程的研究由Cecardi et al.2报道，但其所用相机的分辨率较低，难以准确判断结冰起始的组织位置。Wisniewski et al.4利用更高分辨率的相机，确定了多种植物中冰核形成的更精确位点。随着红外热成像技术的进步，更高分辨率的图像推动了诸如结冰屏障5以及冰形成在细胞水平上的精确定位6等发现。
在红外成像中拍摄样本时存在一个难点，即温度的微小差异会导致视野中的大多数物体呈现相似的颜色，从而难以准确判断哪些物体正在结冰。在确定特定组织（如小麦的叶片或根部）结冰顺序时，这一点尤为重要6。如果能够以三维方式获取植物结冰过程的红外视频，则可提高确定植物特定部位在某一时刻是否结冰的准确性。
草莓是美国某些地区的作物，这些地区的低温对种植者来说是一个相当严重的问题。在某些生长条件下，草莓花朵通常会在春季最后一次平均霜冻日期前2至3周出现。在阿巴拉契亚山脉的一些地区，霜冻事件甚至可能晚至6月发生7，通常会导致花朵死亡。因此，在易发生此类霜冻事件的地区，防霜措施对草莓种植者至关重要。例如，北卡罗来纳州的草莓种植者在开花前平均需要应对4至6次霜冻事件，在早花期还需应对1至2次严重霜冻8。为了帮助培育更耐冻的草莓基因型，了解冻害的各个方面非常重要，例如冰核形成的位点以及冰晶向植物其他部位传播的过程。红外热成像技术为此类问题提供了有效的研究手段。
本文以草莓为例，说明利用立体红蓝成像法（anaglyph method）记录三维空间冻结事件的技术。草莓非常适合用于此示例，因为其叶片和花朵在三维空间中分布广泛，在二维红外视频中观察时难以区分。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
1. 准备
- 准备用于记录和处理植物结冰视频的设备、材料和软件。
- 将可编程冷冻机的电源开关设为开启状态，并将温度设为 0 °C。设置冷冻机以每小时降低 1 °C 的速率降温至 -8 °C。
- 将一株生长在 1 L 容器中、具有 2 - 5 朵花的 6 周龄草莓植株放入冷冻机中。
- 使用固定带和一小块木块安装两台红外相机（例如，FLIR T620 相机），以获得镜头之间合适的会聚角度。
注意：通常认为，两台相机镜头中心之间的最佳距离与人眼间距相同1，约为 7 cm。 - 将两台相机安装在一个 10 × 10 cm 的实验室升降台上，并将升降台置于冷冻机内靠近植株的位置，以便对图像进行聚焦。调整相机的垂直和水平位置，使两台相机均能观察到植株的相同部分。使用升降台垂直调节两台相机的位置，使两个图像均包含整株植物及部分土壤。
- 使用 USB 连接线将两台相机连接至计算机上的 USB 接口。
- 将两台相机分别插入交流电源插座，以实现对植株的持续监测。
2. 录制用计算机与软件设置
- 双击红外相机软件图标两次，打开两个软件窗口（每个相机对应一个窗口）。按照帮助菜单中的说明，将左侧窗口连接到左相机，右侧窗口连接到右相机。
注意：软件使用详情可通过帮助菜单获取。本示例推荐使用单色调色板，以便于后续进行红蓝着色的3D渲染。 - 双击程序图标打开屏幕录制软件。通过点击并拖动边框调整录制区域，确保同时包含两个相机画面，从而实现对双通道视频流的同步捕获。
注意：同步录制两个相机的视频流至关重要，这可确保左右视角在后期处理中实现无缝同步。 - 以3小时为间隔录制视频，以便于视频处理软件更高效地进行后续分析。
注意：由于无法准确预知植物冻结的具体时间，因此必须在冻结事件发生前开始录制。该软件支持分段录制功能，建议设置为每3小时自动分段录制一次。软件将自动保存每段3小时的视频，并开始下一段录制。每段3小时的视频文件将按顺序在文件名后自动添加数字编号。每个视频文件大小约为10至20 GB，因此需确保硬盘具备足够的存储空间以容纳多个此类文件。 - 在控制器菜单中选择运行以启动冷冻程序，并开始屏幕录制。随后点击窗口上的录制按钮，确认显示录制区域的边框变为红色。
- 记录草莓植株降温至-8 °C的过程，并将冷冻室温度维持在该温度1小时。
- 以每小时升高2 °C的速率将冷冻室温度升至+2 °C，随后停止录制。
注意：整个冷冻实验总时长为14小时。 - 使用文件转换软件将感兴趣的视频文件从.mp4格式转换为.mov格式。
注意：本例中将使用一个包含一次或多次冻结事件的3小时视频文件。
3. 使用视频成像软件处理视频
注意：本示例将使用视频成像软件。有关该软件使用的教程可在线获取。本示例假定使用者已具备该软件的基本知识，包括对“合成”、“图层”和“渲染队列”等术语的理解，以及对各个面板及其操作方法的掌握。
- 在项目面板内任意位置双击，将感兴趣的 .mov 文件导入成像软件，然后将该文件拖动到项目面板底部的 合成 图标上。随后将项目保存至包含原始视频的同一文件夹中。
注意：录制的视频将在预览窗格中可见。 - 单击预览窗口底部的 感兴趣区域 图标，并使用光标仅圈选出左侧相机的录像内容。
- 将同一个 .mov 视频再次拖动到 合成 图标，以创建该视频的第二个合成。重复步骤 3.3，但此次仅使用光标选择右侧相机的画面。
- 针对左侧视图，选择 合成 > 将合成裁剪至感兴趣区域。对右侧视图重复此操作。将每个合成重命名，以标明其为左侧或右侧视图。
- 通过单击选中左侧合成，并在顶部主菜单中选择 合成 > 添加到渲染队列。
- 在渲染队列中，单击 输出模块，并确保视频将被渲染为视频格式（例如，QuickTime 视频）。单击 渲染设置 以降低分辨率，从而加快渲染速度。单击 输出至，将视频命名为 Strawberry Left，并保存至与原始录像和项目相同的文件夹中。点击 保存，然后单击渲染面板右上角的 渲染 按钮。
- 对 Strawberry Right 合成重复步骤 3.6。
- 双击项目面板，导入刚刚渲染完成的 Strawberry Left 和 Strawberry Right 视频。
- 同时选中这两个视频，并将它们拖动到项目面板底部的合成图标上。在弹出的窗口中输入 静态持续时间，输入数字 3 后加 5 个零，表示 3 小时的持续时间。
注意：两个视频将被精确同步地显示在项目面板中，但在合成面板中仅最上方的视频可见。 - 要查看另一幅图像，可单击图层前的 小眼睛图标 以关闭该图层。按下 Control/W 键，即可使用光标在预览面板中对图像进行旋转控制。通过切换顶层图层的显示状态，调整顶层或底层视图的旋转角度，确保两个图像处于相同的旋转平面。然后直接在 3D 眼镜子程序中调整 X 轴和 Y 轴平面。
- 在合成面板中选中顶层图层，然后从顶部菜单中选择 效果 > 透视 > 3D 眼镜。
注意：3D 眼镜效果的参数将在控制面板中弹出显示。 - 在控制面板中，单击“左视图”右侧的方框——如果控制面板未与项目面板分离，请单击项目面板顶部的控制面板标签。在下拉菜单中列出合成面板中的两个视频，然后在列表中高亮选择用于“左视图”的视频。对“右视图”重复此步骤。
- 在 3D 视图 右侧的框中，选择 红蓝左右。
- 佩戴红蓝眼镜，在项目面板中检查视图。如果 3D 效果不正确，尝试单击 交换左右。调节 场景汇聚 和 垂直对齐，以消除重影和眼部疲劳。
- 当视频的 3D 效果达到满意状态后，单击选中该合成，并选择 合成 > 添加到渲染队列，操作方式同步骤 3.7。将视频渲染至项目中其他文件所在的同一文件夹。
注意：此文件体积较大。渲染完成后，可使用视频处理软件将其重新渲染为更小的文件尺寸。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
令人意外的是，草莓植株结冰的红外视频（补充视频1）显示，并非所有叶片或花朵都在同一时间结冰。叶片和花朵各自在不同温度下独立结冰，但叶片比花朵更早结冰，且结冰温度更高。此外，结冰起始于叶片，但并不一定发生在每片叶片的相同位置。尽管此前在草莓中尚未报道过此类结果，但在其他植物物种中已观察到类似现象6。一旦叶片结冰，冰冻便沿叶柄向下蔓延至植株的冠部。当冷冻室温度再降低1至2摄氏度时，花朵开始结冰，起始于花萼，并迅速扩展至花瓣和花托（图1）。与其他大部分植物组织相比，花托保持较浅的颜色（即温度较高）的时间更长，表明其水分结冰量更大。
将二维红外图像与三维图像（佩戴眼镜观看）进行比较时，三维图像可更准确地判断叶片和花朵结冰的先后顺序（图1）。观看三维视频时，也能更...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
本方案需要两台红外相机，且必须从略微不同的角度对准被拍摄对象1。两台相机的镜头间距应保持在 5 - 8 cm 之间，但均需对准被拍摄对象的同一位置。可将这两个镜头视为观察者双眼的替代。左相机对应左眼，右相机对应右眼。后期处理软件会将左图像染成红色，右图像染成蓝色，因此佩戴红-蓝眼镜后，左眼只能看到左图像，右眼只能看到右图像。这意味着在记录冻结事件时，必须使用红外相机软件的灰度调色板。人脑会将这两幅图像融合，使观察者看到三维效果1。
该方案的另一个关键步骤是使用屏幕录制软件同时捕获两个摄像头的输出。通过同时捕获两个摄像头的输出，可确保两个摄像头输出的完美同步。同步左右图像对于生成3D影片至关重要，其细节在其他文献中已有详细讨论。1
为防止产生视觉疲劳，左右图像的垂直和水平会聚必须准确。尽管在录制前应调整摄像机位置以确保正确的会聚，但初始设置无需完全精确。本文所述的后期制作软件可对左右、上...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由美国农业部内部资金资助。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| T620 红外热成像仪及配套软件 | FLIR | 55903-5122 | 需要 2 台相机。软件仅可在基于 Windows 系统的计算机上运行 |
| After Effects | Adobe | 15.0.1.73 | 视频后期制作编辑软件 |
| Bandicam | Bandisoft | 4.1.2.1385 | 屏幕录制软件 |
| 实验室千斤顶 | Eisco | CH0642A | 钢制平台 13×15 cm |
| 固定绑带 | Velcro | 90441 | 用于将相机固定在千斤顶上。 长度应至少为 60 cm，宽度为 2 cm |
| 媒体转换器 | iSkysoft | 10.0.6 | 用于将 mp4 文件转换为 .mov 格式的软件 |
参考文献
- Geng, J. Three-dimensional display technologies. Advances in Optics and Photonics. 5, 456-535 (2013).
- Ceccardi, T. L., Heath, R. L., Ting, I. P. Low-temperature exotherm measurement using infrared thermography. HortScience. 30, 140-142 (1995).
- Wimmer, B. History of thermal imaging, Security Sales and Integration. , Framingham, MA, USA. (2011).
- Wisniewski, M., Lindow, S. E., Ashworth, E. Observations of ice nucleation and propagation in plants using infrared video thermography. Plant Physiology. 113, 327-334 (1997).
- Kuprian, E., Tuong, T., Pfaller, K., Livingston, D. P., Neuner, G. Persistent supercooling of reproductive shoots is enabled by structural ice barriers being active despite an intact xylem connection. Public Library of Science ONE. 11, e0163160(2016).
- Livingston, D. P. III, Tuong, T. D., Murphy, J. P., Gusta, L., Wisniewski, M. E. High-definition infrared thermography of ice nucleation and propagation in wheat under natural frost conditions and controlled freezing. Planta. 247, 791-806 (2017).
- Boyles, R. P., Raman, S. Analysis of climate patterns and trends in North Carolina (1949-1998). Environment International. 29 (2-3), 263-275 (2003).
- Poling, E. B. Managing Cold Events. A Growers' Guide to Production, Economics and Marketing. Poling, E. B. , NC Strawberry Association. Siler City. 75-97 (2015).
- Hacker, J., Neuner, G. Ice porpagaion in plants visualized at the tissue level by infrared differential thermal analysis (IDTA). Tree Physiology. 27, 1661-1670 (2007).
- He, J. Q., Harrison, R. J., Li, B. A novel 3D imaging system for strawberry phenotyping. Plant Methods. 13, 93-101 (2017).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
