小鼠大脑皮层细胞组织的大尺度三维成像

Summary

在这里, 我们描述一个程序, 组织清除, 荧光标记, 和大规模的小鼠脑组织成像, 从而使可视化的三维组织的细胞类型在大脑皮层。

Abstract

哺乳动物大脑皮层由许多类型的兴奋和抑制神经元组成, 每一种都有特定的电生理和生化特性, 突触连接和体内功能, 但其基本功能和解剖学组织从细胞到网络规模是不太了解。在这里, 我们描述了一个方法, 三维图像的荧光标记神经元跨大区域的大脑, 以调查皮质细胞组织。在转基因小鼠中, 用荧光逆行神经元示踪剂或荧光蛋白的表达来标记特定类型的神经元。块脑标本,例如,半球, 是在固定后准备的, 用组织清除方法透明, 并受到特定细胞类型的荧光 immunolabeling。大面积扫描使用共焦或双光子显微镜, 配备了较大的工作距离目标和机动阶段。该方法可以解决小鼠大脑皮层细胞型特定柱功能模块的周期性组织问题。该方法可用于研究不同脑区和其他复杂组织中的三维细胞结构。

Introduction

哺乳动物大脑皮层由大量的细胞类型组成, 每一个有特定的基因表达模式, 电生理和生化特性, 突触连接, 和在体内功能^{1,2 ,3,4,5,6,7}。这些细胞类型是否被组织成重复的结构是不清楚的。皮质柱, 包括视觉定向柱和体感桶, 有重复的结构, 但其细胞组织仍然不清楚^8,9。这些是存在于特定的皮质区域, 不是大脑范围的系统。

在皮层5层, 大部分神经元被分为四大类。一种主要类型的兴奋神经元, 亚脑投射神经元, 项目轴突到皮层下靶, 包括桥脑, 脊髓, 和优越的丘, 因此, 代表了主要的皮质输出通路¹⁰。皮质投射神经元, 另一种主要类型的兴奋神经元, 支配皮层¹⁰。抑制神经元也包含两大类: parvalbumin 表达和生长抑素表达细胞¹¹。

最近的分析表明, 四细胞类型被组织成重复结构^12,13,14。次级脑投射神经元^12、13、14和皮层投射神经元¹⁴组织成细胞型特异性 microcolumns, 有一直径的细胞。Parvalbumin 表达和生长抑素表达细胞与 microcolumns 的亚脑投射神经元, 而不是与 microcolumns 皮层投射神经元¹⁴。Microcolumns 自己周期性地排列形成一个六角格子阵列¹⁴并且在多皮层区域包括视觉, 感觉和马达区域在老鼠脑子^12,14并且在语言人脑的区域¹³。神经元在个体柱陈列同步活动并且有相似的感觉反应¹⁴。这些观察表明, 5 层细胞类型组织成一个柱晶格结构, 代表第一个已知的大脑范围内重复功能模块的组织。

Microcolumns 有大约10µm 的半径并且有大约40µm 的空间周期性。此外, microcolumns 的方向与它们的顶端树突平行, 并根据它们在皮层¹⁴中的位置而变化。因此, 柱系统很难分析使用传统的皮质切片的典型厚度的几微米。此外, 周期性分析需要来自广泛脑区的三维数据, 因此, 共焦显微镜和活体2 光子成像的典型成像区域太窄。

最近, 技术已经发展到清除厚组织^15,16。在这里, 我们描述了这些方法的应用, 以获得大型, 三维图像的主要细胞类型在小鼠皮层层5组成的柱系统。Subcerebral 投射神经元用逆行标记或增强绿色荧光蛋白在Crym-egfp转基因小鼠¹²中的表达进行标记, 皮质投射神经元用逆行标记标记或由 tdTomato 表达在Tlx3/Ai9小鼠¹⁷。Parvalbumin 表达和生长抑素表达细胞用免疫组化标记。(抗体标度 S) AbScale 方法¹⁸用于抗体染色实验, 而 (见深脑) SeeDB 方法¹⁹用于其他实验。这些方法克服了传统成像方法的难点, 揭示了5层¹⁴的精确细胞组织。

Protocol

所有实验程序均经山本理瓦科动物实验委员会和山本理基因重组实验安全委员会批准, 并根据山本理脑科学动物设施的机构指南进行。研究所。

1. 成像室的制备

1. 成像室¹⁹
   1. 使用硅橡胶板, 准备一个房间的厚度约5毫米和地板板的各种厚度。此外, 准备有和没有玻璃底部的培养皿 (图 1A)。
2. 切片间隔
   1. 准备垫片, 以保持样品, 使用硅橡胶板厚度为0.5 毫米 (图 1C)。

2. 示踪剂注射

注: 注射入脑桥 (2.1) 或高级丘 (2.2)。注入脑桥标签的子脑投射神经元, 在大脑区域包括视觉和运动区域, 同时注入到上级丘标签子脑投射神经元的视觉区域。为控制实验, 注射生理盐水代替荧光标记的霍乱毒素亚单位 B。为不育条件的维护使用消毒的设备和塑料手套清洗用乙醇。

1. 对成年小鼠的脑桥进行注射。
   1. 绘制1µL 荧光标记的霍乱毒素亚单位 B (25 µg/µL 在 PBS) 成26G 哈密尔顿注射器。
   2. 在注射器上放置注射器泵。
   3. 将注射器和泵放在放置在立体定向仪器上的机械手的刀架上。将机械手12°向后从垂直轴倾斜。
   4. 麻醉注射戊巴比妥钠腹腔 (60 毫克/千克体重) 或管理异氟醚 (2–3%), 对雄性或雌性成年小鼠 (C57BL/6J 或Tlx3)。等待, 直到鼠标没有反应时, 它的尾巴被钳捏, 表明鼠标完全麻醉。
   5. 把鼠标放在立体定向仪器上。
   6. 小心去除头发使用剃刀刀片, 以防止感染和削减10毫米的头皮, 使 bregma 和 lambda 可见。用吸管管理0.1 毫升1% 利多卡因。通过调整在立体定向仪器上的喉舌的垂直位置来设置头部的角度, 使 bregma 和 lambda 具有相同的 z 电平。
   7. 调整机械手的位置, 将其滑动到立体定向仪上, 使注射器尖端接近 bregma 并记录机械手的位置。通过移动机械手上的刀架来收回注射器。
   8. 移动机械手5.4 毫米向后和0.4 毫米侧面。推进注射器, 使尖端接近头骨入口点。收回注射器并标记入口点。
   9. 在标记的位置, 钻一个直径约1毫米的孔。
   10. 插入注射器尖端的孔, 使尖端深度是6.9 毫米以上的测量在 bregma。
   11. 使用泵在0.2 µL/分钟内注入1µL 的示踪剂。
   12. 从大脑中取出注射器。
   13. 如有必要, 用微纤丝止血和即时粘合剂的小片段覆盖裸露的大脑。
   14. 使用用吸管输送的生理盐水冲洗裸露的大脑, 以防止感染和缝合头皮。
   15. 从立体定向仪器中取出鼠标。允许鼠标在30˚C 的孵化器中从麻醉中恢复, 通常为1小时。不要让鼠标无人看管, 直到它恢复了足够的意识来维持胸骨卧床。在完全恢复后, 将鼠标退回到其他动物的公司。
   16. 保持鼠标3–7天。
2. 对成年小鼠的丘进行注射。
   1. 准备一个30–50µm 尖直径的玻璃吸管。
   2. 通过塑料管将玻璃吸管与哈密尔顿注射器连接 (图 2A)。
   3. 用石蜡液填充玻璃吸管、塑料管和哈密尔顿注射器。
   4. 在注射器上放置注射器泵。
   5. 将玻璃吸管放在机械手上, 将机械手向后从垂直轴倾斜 (图 2B)。
   6. 执行 2.1. 4–2.1 9。机械手的位置是1.4 毫米后, 0.5 毫米侧向 lambda。
   7. 在头骨上放置一个小的塑料石蜡膜, 然后在它上放置大约1µL 的示踪剂溶液。快速推进玻璃吸管和填充它至少0.5 µL 的示踪剂溶液。
   8. 插入玻璃吸管, 使尖端深度是3.0 毫米从大脑表面。
   9. 使用泵在0.2 µL/分钟内注入0.5 µL 的示踪剂。
   10. 从大脑中取出玻璃吸管。
   11. 执行 2.1. 13–2.1 16。

3. 固定和修整

1. 注射戊巴比妥钠 (60 毫克/千克体重) 腹腔成鼠标 (C57BL/6J 或Tlx3/Ai9, 有或没有示踪剂注射如步骤2所述。等待, 直到鼠标没有反应时, 它的尾巴被钳捏, 表明鼠标完全麻醉。
2. 弄死老鼠人道地通过灌注老鼠 transcardially²⁰与0.9% 生理盐水。
3. 修正鼠标²⁰由灌注4% 多聚甲醛 (粉煤灰) 在0.1 米磷酸盐缓冲 (pH 7.5)。
4. 用剪刀切开头皮, 使头骨暴露于²⁰。
   1. 用剪刀切开裸露头骨的中线。用镊子取出头骨。
   2. 如果标记 bregma 和 lambda 的位置是必要的, 首先删除头骨的一个半球。将薄薄的钨针插入大脑中的 bregma 和 lambda 的位置上的头骨留在大脑, 然后取出剩下的头骨。
      注意: 大脑可以存储在 PBS 4 ˚C。
5. 对抑制神经元进行抗体染色, 将脑标本切成切片。
   1. 把大脑样本放在 vibratome 上。
   2. 在室温下切成500µm 厚的切片, 然后进行步骤 5 (AbScale 方法)。
6. 如果抗体染色是不必要的, 修剪的大脑样本块 (高达3毫米厚) 使用剃刀刀片 (图 3), 并继续步骤 4 (SeeDB 方法)。
   注意: 切割或修剪后, 大脑可以在 PBS 中存储4摄氏度。SeeDB 方法是可取的, 当抗体染色是不必要的, 因为它需要较少的时间比 AbScale 方法。

4. 无抗体染色清除 (SeeDB 法)

1. 用刮刀将样品转移到含有20毫升0.5% α thioglycerol 和 20% (瓦特/v) 果糖的50毫升塑料管上, 并在室温下轻轻摇动, 将其孵化为 4 h。
2. 用刮刀将样品转移到含有20毫升0.5% α thioglycerol 和 40% (瓦特/v) 果糖的50毫升塑料管上, 并在室温下轻轻摇动, 将其孵化为 4 h。
3. 用刮刀将样品转移到含有20毫升0.5% α thioglycerol 和 60% (瓦特/v) 果糖的50毫升塑料管上, 并在室温下轻轻摇动, 将其孵化为 4 h。
4. 用刮刀将样品转移到含有20毫升0.5% α thioglycerol 和 80% (瓦特/v) 果糖的50毫升塑料管上, 并在室温下轻轻摇动, 将其孵化为 12 h。
5. 用刮刀将样品转移到含有20毫升0.5% α thioglycerol 和 100% (瓦特/v) 果糖的50毫升塑料管上, 并在室温下轻轻摇动, 将其孵化为 12 h。
6. 用刮刀将样品转移到含有20毫升0.5% α thioglycerol 和 80.2% (w/w) 果糖的50毫升塑料管上, 并在室温下轻轻摇动, 将其孵化为 24 h。
   注意: 仔细处理样品, 使变形尽可能小。不要将样品孵化得比所示的长, 因为样品很快就会变得不透明。
7. 将样品嵌入80.2% 果糖溶液填充的成像腔内 (图 1B)。如有必要, 将小块橡胶粘合剂固定在样品上。如果房间太深, 在放置样品之前, 在房间里放一层底板。
8. 将培养皿放在成像室的玻璃罩上, 将水放在盘子中, 用共焦或双光子显微镜与水浸泡长工作距离目标进行图像处理。励磁波长和发射滤波器在表 1中描述。如有必要, 使用机动舞台。

5. 用抗体染色清除 (AbSca 法)

1. 准备试剂如表 2所述。
2. 使用刮刀将切片转移到含有4毫升 Sca/eS0 溶液的5毫升塑料管上, 并在37摄氏度的温和晃动下孵化12小时 (图 4B)。
3. 用吸管将溶液从试管中取出, 加入4毫升的 Sca/eA2 溶液, 并在37摄氏度时以温和的震动孵化36小时的切片。
4. 用吸管将溶液从试管中取出, 加入4毫升的 Sca/eB4 溶液, 并在37摄氏度时以温和的震动孵化24小时的切片。
5. 用吸管将溶液从试管中取出, 加入4毫升的 Sca/eA2 溶液, 并在37摄氏度时以温和的震动孵化12小时的切片。
6. 使用吸管将溶液从管中取出, 并加入4毫升 PBS, 在室温下进行温和摇动, 以6小时的方式孵化切片。
7. 用刮刀小心地将切片移到2毫升塑料管上。
8. 用原抗体 (表 3) 在1毫升的 AbSca 溶液中孵育48-72 小时37摄氏度 (图 4C), 并轻轻摇动。
9. 用刮刀小心地将切片移到5毫升塑料管上。
10. 在室温下4毫升的AbSca 溶液中孵育2小时2次, 并进行柔和的震动。
11. 用刮刀小心地将切片移到2毫升塑料管上。
12. 孵育与荧光标记的二级抗体 (材料表, 1:100) 在1毫升 AbScale 溶液48小时在37°c 与柔和的震动。
13. 小心地删除切片使用刮刀到5毫升的塑料管含有4毫升的 AbScale 溶液和孵化的切片为6小时, 在室温下轻轻摇动。
14. 用吸管将溶液从试管中取出, 加入4毫升的 AbSca 溶液,在室温下轻轻摇动, 将切片培养成2小时2倍。
15. 用吸管将溶液从试管中取出, 加入4毫升4% 的粉煤灰, 在室温下轻轻摇动, 将切片孵化1小时。
16. 使用吸管将溶液从管中取出, 并加入4毫升 PBS, 在室温下进行温和摇动, 以1小时的方式孵化切片。
17. 使用吸管将溶液从管中取出, 并加入4毫升的 Sca/eS4 溶液, 并在37摄氏度时以温和晃动的方式孵化12小时的切片。
18. 将垫片放在玻璃滑梯上, 将切片放在间隔内, 并将切片浸入 Sca/eS4 溶液中。用盖玻璃封住垫片 (图 1D)。
19. 使用共焦或双光子显微术, 用水浸泡长的工作距离目标, 将水放在盖子玻璃和图像上。如有必要, 使用机动舞台。
    注: 检查样品的深部是否贴上类似于表面的部分, 以确认没有明显的标签偏差。
    注: 检测到的抗体的穿透性在表 3中描述。

6. 细胞位置测定

1. 对于扫描图像中的每个位置, 使用三维图像过滤器¹⁴ (图 5A-5D) 计算相关值。
2. 确定相关值峰值的位置 (图 5D)。
3. 调查围绕峰值的图像以定位单元格 (图 5E)。

Results

我们标记皮层投射神经元的 tdTomato 在Tlx3/Ai9 转基因小鼠和可视化的亚脑投射神经元, 通过注射逆行示踪 CTB488 进入脑桥。大脑的左半球受 SeeDB 方法扫描, 使用双光子显微镜, 配备了水浸泡长工作距离目标 (25X, 1.1, 工作距离2毫米) 和机动阶段。一叠401张图像 (512 x 512 像素; 像素大小 = 0.99 µm) 在 z 步 = 2.8 µm 在每30个扫描位置被获得了。两种细胞的细胞体在广泛的脑区可见 (图 6), 光学切片显示周期性 microcolumns (图 7A)。此外, Crym-egfp小鼠 (杂合子 C57BL/6J 背景) 的大脑被 SeeDB 方法清除, 并在上面成像。EGFP 表达的亚脑投射神经元的细胞体和顶端树突在光学切片中可见 (图 7B)。

Discussion

我们已经提出的程序, 以获得大规模的三维图像的细胞类型特定组织的主要细胞类型的小鼠皮层层5。与传统的切片染色相比, 该方法在确定大脑皮层的三维组织方面更为有用。该方法使图像获得从更广泛和更深层次的大脑区域相比, 典型的活体2 光子显微镜或常规共焦显微术, 从而可以让皮层细胞的综合分析组织。

该方法的一个关键步骤是抗体穿透。抗体的子集显示, 渗透到厚的标本 (表 3), 因此, 不能用于 AbScale 方法。为了获得与本研究所用抗体一致的标签, 有必要将大脑切成500µm 切片。使用更小的抗体片段,例如,晶圆或 F (ab ') 2 片段, 和/或其他清算^{方法 21,22,23,24,...}

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Crym-egfp 转基因小鼠	MMRRC	012003-UCD
Tlx3-cre 转基因小鼠	MMRRC	36547-UCD
ROSA-CAG-flox-td番茄小鼠	杰克逊实验室	JAX #7909
硅橡胶板	AS ONE	6-611-01	0.5 mm 厚度
硅橡胶板	AS ONE	6-611-02	1.0 mm 厚度
硅橡胶板	AS ONE	6-611-05	3.0 mm 厚
皿	Falcon	351008
盖玻片	松波	C022241
霍乱毒素亚基 B（重组），Alexa Fluor 488 偶联物	Invitrogen	C22841
霍乱毒素亚基 B（重组），Alexa Fluor 555 偶联物	Invitrogen	C22843
霍乱毒素亚基 B（重组），Alexa Fluor 594 偶联物	Invitrogen	C22842
霍乱毒素亚基 B（重组），Alexa Fluor 647 偶联物	Invitrogen	C34778
26 G 汉密尔顿注射器	Hamilton	701N
进样泵	KD Scientific	KDS 310	Pons 进样
进样泵	KD Scientific	KDS 100	Superior colliculus 注射
机械手	Narishige	SM-15
戊巴比妥钠	Kyoritsu Seiyaku	Somnopentyl
Isoflurane	辉瑞
利多卡因	阿斯利康	赛洛卡因注射液 1% 与肾上腺素
钻头	Toyo Associates	HP-200
Avitene 微纤止血器	Davol Inc	1010090
Alonalfa	Daiichi-Sankyo	Alonalpha A
手术丝	Ethicon	K881H
培养箱	UVP	HB-1000 杂交器
玻璃移液器	Drummond Scientific Company	2-000-075
电极拉拔器	Sutter Instrument Company	P-97
石蜡液，轻质	Nacalai tesque	26132-35
盐水	Otsuka	1326
多聚甲醛	Nacalai tesque	26126-54
钨针	Inter medical	Φ0.1 *L200 mm
振动切片机	Leica	VT1000S
50 mL 塑料管	Falcon	352070
α-硫代甘油	Nacalai tesque	33709-62
D（-） Fructose	Nacalai tesque	16315-55
BluTack	Bostik	CKBT-450000
双光子显微镜	Nikon	A1RMP
水浸式长工作距离物镜	尼康	CFI Apo LWD 25XW， NA 1.1， WD 2 mm
水浸式长工作距离物镜	尼康	CFI LWD 16XW， NA 0.8， WD 3 mm
电动载物台	COMS	PT100C-50XY
滤光片	Semrock	FF01-492/SP-25
滤光片	Semrock	FF03-525/50-25
滤光	Semrock	FF03-575/25-25
滤光
尿素	Nacalai tesque	35905-35
Triton X-100	Nacalai tesque	35501-15
Glyserol	Sigma-aldrich	191612
D（-）-山梨糖醇	Wako	191-14735
甲基-β;-环糊精	东京化学工业	M1356
&γ;-环糊精	Wako	037-10643
N-乙酰基-L-羟脯氨酸	皮肤必需活性物质	33996-33-7
DMSO	Nacalai tesque	13445-45
牛血清白蛋白	Sigma-aldrich	A7906
吐温-20 （1.1 g/mL）	Nacalai tesque	35624-15
山羊抗小鼠 IgG （H+L） 交叉吸附二抗抗体， Alexa Fluor 555	Invitrogen	A21422
山羊抗兔 IgG （H+L） 交叉吸附二抗， Alexa Fluor 555	Invitrogen	A21428
山羊抗小鼠 IgG （H+L） 交叉吸附二抗， Alexa Fluor 647	Invitrogen	A21235
山羊抗小鼠 IgG （H+L） 高度交叉吸附二抗， Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11029
驴抗兔 IgG （H+L） 高度交叉吸附二抗，Alexa Fluor 488	Invitrogen	A21206
共聚焦显微镜	Olympus	FV1000
水浸式长工作距离物镜	Olympus	XLUMPLFLN 20XW， NA 1.0， WD 2 mm
抗 NeuN	Millipore	MAB377
抗 NeuN	Millipore	ABN78
抗 CTIP2	Abcam	ab18465
抗 Statb2	Abcam	ab51502
抗 GAD67	Millipore	MAB5406
抗 GABA	Sigma	A2052
抗小白蛋白	Swant	235
抗小白蛋白	Frontier Institute	PV-Go-AF460
抗小清蛋白	Sigma	P3088
抗小白蛋白	Abcam	ab11427
抗生长抑素	Peninsula Laboratories	T-4103
抗 c-fos	钙生化学	PC38