本文介绍一种通过获取并用甲苯胺蓝染色1-2 µm切片来可视化周围神经细微结构的实验方案
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摘要
摘要
周围神经遍布全身，通过运动或感觉轴突支配靶组织。由于分布广泛，周围神经常因创伤或疾病而受损。随着用于评估动物模型中周围神经损伤、功能及再生的方法和策略不断发展，对周围神经进行形态测量分析已成为一项重要的终末结局指标。对树脂包埋神经切片获得的神经横截面进行甲苯胺蓝染色，是一种可重复的方法，可用于周围神经的定性和定量评估，能够显示神经形态、轴突数量以及髓鞘化程度。与许多其他组织学方法一样，仅依靠标准书面方案，该技术较难学习和掌握。因此，本出版物旨在结合坐骨神经标本（来源于大鼠）的实验操作视频，强化甲苯胺蓝染色步骤的书面方案。在本方案中，我们描述了 体内 外周神经的固定与组织取材，2% 四氧化锇后固定，神经组织环氧树脂包埋，以及超薄切片机切片至 1–2 μm 厚度。将神经切片转移至载玻片，经甲苯胺蓝染色后进行定性与定量评估。文中展示了最常见问题的示例，并提供了相应问题的解决步骤。
引言
周围神经遍布全身，通过运动或感觉轴突支配靶组织1。由疾病和创伤引起的周围神经缺损是一个重要的公共卫生问题，并带来巨大的经济负担2,3。尽管在评估周围神经损伤后果及理解神经再生机制方面已取得进展，传统方法如神经组织学和染色技术仍是动物模型或切除的人体组织中用于定性和定量评估神经健康状况的终端结局测量的重要工具。这些方法常与周围神经功能的电生理学测量相结合，其中形态测量可揭示功能性神经再生发生或未发生的原因。
树脂包埋的周围神经半薄切片经甲苯胺蓝染色是一种用于成像有髓神经纤维的专门方法，可提供高质量且清晰显示神经结构细节的图像4,5,6。甲苯胺蓝是一种嗜酸性异染染料，由威廉·亨利·珀金（William Henry Perkin）于1856年发现7，已被应用于多种医学用途8。通过对树脂包埋的神经节段制备的周围神经切片进行甲苯胺蓝染色，可清晰显示神经结构。使用四氧化锇进行后固定可进一步增强髓鞘结构的可视化效果4,9。四氧化锇是一种有毒的氧化剂和脂类固定剂，可与脂质中的双键发生反应，从而使富含脂质的髓鞘轮廓鲜明10。然而，四氧化锇具有毒性、价格昂贵、需要较长的神经节段孵育时间，因此并不总是被采用。
已开发出多种替代方法用于处理和染色以观察周围神经的形态；石蜡包埋、冷冻切片以及环氧树脂包埋神经切片后，采用甲苯胺蓝或对苯二胺溶液染色，已被用于量化周围神经再生过程中的形态学变化11,12。这些方法各有优势，可提供有关轴突数量、髓鞘厚度、轴突直径以及轴突直径与有髓神经纤维直径之比（g值）的关键数据11,13,14,15。
本方案中树脂包埋的主要特点是，由于树脂的硬度，能够获得1-2 μm厚度的横切面，同时保持神经组织的组织学特性。与石蜡包埋获得的4-5 μm厚切片相比，这些更薄的切片可提供更高分辨率的周围神经切片，从而实现对轴突髓鞘化程度（如g值比）更准确的定量分析，而这种分析无法通过较厚的切片获得16。尽管冷冻切片也可用于获取1-2 µm厚的切片，但根据我们的经验，获得无大量裂纹切片的难度更大。此类有裂纹的切片可能导致轴突数量及髓鞘化特征的计数不准确。
除了甲苯胺蓝染色17，银染法18和马松三色染色4也可用于显示神经轴突。然而，对大鼠正中神经切片进行苏木精-伊红染色或马松三色染色后采用树脂包埋，所显示的髓鞘较淡且结构难以辨认，而甲苯胺蓝染色则能清晰显示髓鞘结构，并易于进行定量分析4。尽管存在一些局限性，对树脂包埋的周围神经进行甲苯胺蓝染色仍是一种有价值的技术，适用于需要高分辨率神经形态图像的研究。
树脂包埋的主要缺点是耗时较长，且由于抗原 retrieval 的难度较大，无法对同一组织进行免疫染色，与石蜡包埋和冷冻包埋切片技术相比尤其如此。因此，通常无法将经过树脂包埋处理用于甲苯胺蓝染色的同一组织再用于免疫染色。尽管本文未采用此方法，但如果希望在树脂包埋切片上进行免疫组织化学染色，可使用乙二醇甲基丙烯酸酯包埋树脂，该树脂允许在组织切片上进行免疫组织化学检测，但成本相对较高19。这一问题可通过将外周神经切成多个独立片段部分缓解，一部分用于树脂包埋，另一部分在固定后直接用于免疫染色。
甲苯胺蓝染色法用于树脂包埋的周围神经组织，与大多数组织病理学分析一样，可分为五个步骤，包括固定、脱水、包埋、切片和染色20。本文旨在提供一项实验方案和实用操作指南，介绍如何利用甲苯胺蓝染色的大鼠坐骨神经树脂切片获取高质量图像。
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方案
本项目使用成年斯普拉格-多利大鼠，所有操作均经怀俄明大学机构动物护理和使用委员会批准。
1. 手术与干预 活体 神经固定
注意：本方案中使用的所有材料和设备的供应商信息均列在材料表中。
注意：体内神经固定用于保存组织，并减少从动物死亡到神经采集期间可能发生的结构降解。 体内组织固定是神经系统组织制备用于组织学分析的标准操作，通常以灌注作为其前期步骤。外周神经的位置和大小允许进行原位固定。由于存在组织降解的可能性，我们不推荐在动物安乐死后进行组织采集与固定。
- 将大鼠置于含有 2-3% 异氟烷的诱导室中以准备全身麻醉，随后将已麻醉的大鼠俯卧位放置在解剖板上，并通过麻醉鼻罩维持 1-2% 异氟烷。 为确保麻醉深度充分，需测试动物后肢足部的缩足反射，并通过触碰眼内眦检查是否存在眼睑反射缺失。
注意：腹腔注射氯胺酮是吸入异氟烷的一种常用替代方法。 - 为暴露坐骨神经，剃除后肢的毛发，并用 70% 乙醇清洁剃毛区域。使用手术刀或剪刀沿后肢从膝关节向上至大转子处做一 2-3 cm 的皮肤切口，期间可用无菌手术刀触诊股骨，以确保切口位置准确。 股骨位于坐骨神经最易接近段的近端。尽管此为非存活手术，仍需保持无菌操作技术。
- 完成皮肤切口后，找到股二头肌与臀大肌之间的解剖平面，使用显微解剖剪分离其下方的筋膜，暴露 2-3 cm 的下方坐骨神经。为暴露一段清晰的坐骨神经，可使用牵开器扩大两块肌肉之间的间隙（图 1A）。使用精细镊子和虹膜剪小心地将神经与其周围结缔组织分离，操作时务必避免压迫或切断神经。
- 在含有暴露神经的腔隙中加入足量的 Trump 固定液（4% 甲醛，1% 戊二醛溶于 1× PBS（磷酸盐缓冲盐水），每 100 mL 含 1.16 g NaH2PO4·H2O），使液体完全覆盖神经，静置 10 分钟。如有必要，可在后肢下方垫纱布以改善角度，从而向腔隙中加入更多固定液。10 分钟后移除固定液 ，并重复此步骤两次。
- 在解剖显微镜下，使用精细解剖剪从两侧切断坐骨神经，注意避免牵拉或夹捏神经，立即将神经段放入含有 Trump 固定液的 15 mL 离心管中，于 4 °C 保存一周，每 48 小时更换一次固定液。
- 手术操作的任何阶段均不得使动物无人看管。取材完毕后，在麻醉状态下通过颈椎脱位法对动物实施安乐死。
2. 四氧化锇处理与树脂包埋
- 后固定后，仔细去除神经上残留的脂肪和结缔组织，用锋利的手术刀将神经切成约 5 mm 长的节段（可将神经节段分开放置并标记于不同的管中）。配制新鲜的 2% 四氧化锇（用 Trump 固定液稀释），置于玻璃管中。将神经节段浸入 2% 四氧化锇溶液中 2 小时，此短暂处理期间可使用塑料管。
注意：某些塑料管会与四氧化锇发生反应，导致溶液变暗，因此不建议长时间在塑料管中储存四氧化锇溶液。 - 使用环氧树脂包埋介质试剂盒，配制最终包埋混合液：
- 将环氧树脂包埋介质与 DDSA 溶液（十二烯基琥珀酸酐；混合液 A）混合，并将环氧树脂包埋介质与 NMA 溶液（甲基纳迪克酸酐；混合液 B）混合。将混合液 A 和 B 均使用磁力搅拌器搅拌至少 20 分钟 。
- 使用前立即混合 A 和 B 混合液，并加入加速剂 DPM-30（2,4,6-三(二甲氨基甲基)苯酚），添加量为混合液总体积的 1.5% 至 2.0%。请注意，DPM-30 溶液应精确量取，以防止包埋块颜色变深且变脆。所有树脂试剂均有毒性，操作时需格外小心，避免皮肤接触或吸入。
- 使用 1.5 mL 管，用 PBS 清洗神经节段，并开始脱水过程：将神经节段依次置于不同浓度的丙酮/蒸馏水溶液中： 30%、60%、90%，每种浓度各 10 分钟，随后置于 100% 丙酮中 3 次，每次 10 分钟。 注意：乙醇可替代丙酮使用。
- 进行树脂渗透：将神经节段置于 1 份最终包埋混合液与 1 份 100% 丙酮的混合液中 30 分钟，然后置于 2 份最终包埋混合液与 1 份 100% 丙酮的混合液中 30 分钟，最后将神经节段置于纯的最终包埋混合液中 30 分钟。
- 将神经节段放入硅橡胶包埋模具中（我们使用的模具尺寸为 106 mm 长 × 71 mm 宽 × 7 mm 深；包埋块尺寸为 11 mm 长 × 6 mm 宽 × 3 mm 深）。轻轻将树脂加至神经上方，确保完全覆盖所有神经节段，并避免产生气泡。将含有神经节段和树脂的模具置于 60 °C 下过夜聚合。
3. 超薄切片机切片
- 使用玻璃刀制备仪制备玻璃刀（图1B），并制作带有舟状槽的玻璃刀（图1C），用于收集漂浮在蒸馏水表面的神经切片。
- 将树脂包埋的神经组织块放入超薄切片机的持刀座中，使梯形面朝上。在超薄切片机显微镜下，使用单刃刀片（如剃须刀片）修除神经组织周围多余的树脂，使修整后的块面呈梯形，并尽可能接近神经的纵切面。注意不要切穿神经节段的纵切面，该表面因四氧化锇染色较深而易于识别。
注意：修除多余树脂可减小需要切片的树脂面积，从而提高刀片性能和后续切割效果。 - 使用超薄切片机，先用普通玻璃刀切去足够多的横切面，以暴露出神经组织均匀的横截面。完成后，更换舟状槽中盛有室温蒸馏水的玻璃刀，并将超薄切片机调整至1–2 μm，以切取薄切片。
- 用金属环将漂浮在玻璃刀舟状槽中的薄切片转移至载玻片上的去离子水滴中（图1D）。通过将载玻片在火焰上短暂多次烘烤的方式干燥切片，注意避免过热。干燥后的切片应立即用甲苯胺蓝染色，或在室温下保存数天后再行染色。
注意：切片也可在60 °C的加热板上干燥15分钟。缓慢干燥过程有助于使切片更加平整。
4. 甲苯胺蓝染色
- 通过将2 g硼砂溶解于100 mL去离子水中，制备1%的甲苯胺蓝溶液，然后加入1 g甲苯胺蓝，搅拌至完全溶解。使用滤纸（孔径：11 µm）过滤该溶液，并将溶液置于不透光瓶中，室温保存，最多可使用两周。
- 使用塑料移液管或微量移液器，在神经组织切片表面滴加一滴甲苯胺蓝溶液，染色20–30秒。
- 将载玻片轻轻浸入去离子水瓶中，彻底冲洗掉多余的甲苯胺蓝溶液，重复3–4次，直至切片清晰透明。将载玻片在60 °C下干燥至少15分钟，或在室温下过夜干燥，然后使用常规封片介质加盖盖玻片。制备完成后可立即观察，或于室温下保存。
- 在光学显微镜下观察。建议使用100倍油镜获取用于计算g-比值的详细图像。
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结果
用树脂包埋的周围神经切片经甲苯胺蓝染色后，可实现准确的组织学数据定量分析。该操作流程概览见（图2）。坐骨神经切片经树脂介质包埋并用甲苯胺蓝染色后，呈现出清晰且分辨率理想的图像（图3）。神经损伤可导致神经形态结构发生多种变化，例如神经纤维、轴突直径以及髓鞘厚度的改变。该方法能够以接近天然的状态保存神经结构，从而便于测量多个参数，例如轴突直径与总纤维直径的比值（即g比值；图4）。多种因素可能导致周围神经切片质量不理想，例如由于神经处理不当而在切片中出现裂纹（图5A）；脱水不充分可能导致切片中出现孔洞（图5B）；另一个可能的操作误差是切片折叠（图5C），可通过使用接种环将切片转移至载玻片上来避免。
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讨论
周围神经损伤与再生的形态学结构研究是常见的研究课题13。在本实验方案中，我们描述了如何利用包埋在树脂块中的大鼠坐骨神经组织，经甲苯胺蓝染色后获得高质量图像，以进行组织学数据定量分析的步骤。该技术可呈现神经形态图像，通过测量轴突数量、髓鞘化程度、纤维化组织浸润情况以及神经健康状况，对神经再生进行量化评估。尽管图像展示的是未损伤神经的切片与处理样本，但只要组织固定充分，相同步骤和材料同样适用于受损神经，以及通过导管或组织移植实现再生的神经20,21。
尽管本方案的所有步骤都很重要，但其中某些步骤更可能导致切片质量差或图像不佳。组织脱水不充分可能导致神经切片出现孔洞（图5B）。一种可能的解释是树脂与水不相溶，组织中残留过多水分会阻碍树脂渗入组织。因此，留出充足的脱水时间并使用纯丙酮对于确保脱水步骤的成功至关重要。虽然本方案中使用了丙酮，但乙醇也...
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披露
作者声明不存在利益冲突。
致谢
作者谨此感谢怀俄明大学詹金斯显微技术中心提供的帮助，以及布什曼实验室成员凯莉·罗巴洛（Kelly Roballo）、海登·特鲁（Hayden True）、乌普乌·奥西马尼江（Wupu Osimanjiang）和苏巴斯·敦加纳（Subash Dhunghana）在动物护理方面给予的协助。本出版物的完成得益于美国国立卫生研究院下属国立普通医学科学研究所提供的机构发展奖（IDeA，资助号 # 2P20GM103432）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 杜氏磷酸盐缓冲液 | Gibco | 14200-075 | |
| 戊二醛溶液 | Sigma-Aldrich | G6257 | |
| 多聚甲醛 | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| 一水合磷酸二氢钠 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| 甲苯胺蓝 O | Sigma-Aldrich | T3260 | |
| 十水合四硼酸钠 | Acros Organics | 205950010 | |
| 异氟烷 | Piramal | NDC 66794-013-25 | |
| 环氧树脂包埋试剂盒 | Sigma-Aldrich | 45359 | |
| 氢氧化钠溶液 | Sigma-Aldrich | 72068 | 用于调节 Trump 固定液的 pH 值 |
| 丙酮 | Fisher Chemical | 170942 | |
| 四氧化锇溶液 | Sigma-Aldrich | 75632 | |
| VWR 显微载玻片，Superfrost Plus | VWR | 48311-703 | |
| 显微镜盖玻片 | Fisher Scientific | 12545102 | |
| Pelco 包埋模具 | Fisher Scientific | NC9671811 | |
| 玻璃刀制备仪 | RMC Products | GKM-2 | |
| 超薄切片机 | RMC Products | MT-XL | |
| 15 mL 锥形管 | Falcon | ISO 9001 | |
| Eppendorf 1.5 mL 微量离心管 | Sigma-Aldrich | T9661 | |
| 4 mL 玻璃小瓶 | Sigma-Aldrich | 854190 | |
| 剃须刀片 | VWR | 55411-050 | 用于修整树脂块 |
| 完美捞取环 | Electron Microscopy Sciences | 70944 | 用于捞取薄树脂切片 |
| 超薄玻璃刀条 6.4 mm × 25 mm × 400 mm | Electron Microscopy Sciences | 71012 | |
| 100 瓦烘箱 | Millipore | 6350115 | |
| Whatman 滤纸 | Sigma-Aldrich | WHA10010155 | |
| 3 mL 塑料移液管 | Sigma-Aldrich | Z331740 | |
| 显微外科手术套件 | World precision instruments | ||
| Olympus 荧光显微镜 | 双 CCD 彩色与黑白相机 DP80 |
参考文献
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