甲苯胺蓝染色法用于评估周围神经形态的树脂包埋切片染色

摘要

本文介绍一种通过获取并用甲苯胺蓝染色1-2 µm切片来可视化周围神经细微结构的实验方案

摘要

周围神经遍布全身，通过运动或感觉轴突支配靶组织。由于分布广泛，周围神经常因创伤或疾病而受损。随着用于评估动物模型中周围神经损伤、功能及再生的方法和策略不断发展，对周围神经进行形态测量分析已成为一项重要的终末结局指标。对树脂包埋神经切片获得的神经横截面进行甲苯胺蓝染色，是一种可重复的方法，可用于周围神经的定性和定量评估，能够显示神经形态、轴突数量以及髓鞘化程度。与许多其他组织学方法一样，仅依靠标准书面方案，该技术较难学习和掌握。因此，本出版物旨在结合坐骨神经标本（来源于大鼠）的实验操作视频，强化甲苯胺蓝染色步骤的书面方案。在本方案中，我们描述了 体内 外周神经的固定与组织取材，2% 四氧化锇后固定，神经组织环氧树脂包埋，以及超薄切片机切片至 1–2 μm 厚度。将神经切片转移至载玻片，经甲苯胺蓝染色后进行定性与定量评估。文中展示了最常见问题的示例，并提供了相应问题的解决步骤。

引言

周围神经遍布全身，通过运动或感觉轴突支配靶组织¹。由疾病和创伤引起的周围神经缺损是一个重要的公共卫生问题，并带来巨大的经济负担^2,3。尽管在评估周围神经损伤后果及理解神经再生机制方面已取得进展，传统方法如神经组织学和染色技术仍是动物模型或切除的人体组织中用于定性和定量评估神经健康状况的终端结局测量的重要工具。这些方法常与周围神经功能的电生理学测量相结合，其中形态测量可揭示功能性神经再生发生或未发生的原因。

树脂包埋的周围神经半薄切片经甲苯胺蓝染色是一种用于成像有髓神经纤维的专门方法，可提供高质量且清晰显示神经结构细节的图像^4,5,6。甲苯胺蓝是一种嗜酸性异染染料，由威廉·亨利·珀金（William Henry Perkin）于1856年发现⁷，已被应用于多种医学用途⁸。通过对树脂包埋的神经节段制备的周围神经切片进行甲苯胺蓝染色，可清晰显示神经结构。使用四氧化锇进行后固定可进一步增强髓鞘结构的可视化效果

方案

本项目使用成年斯普拉格-多利大鼠，所有操作均经怀俄明大学机构动物护理和使用委员会批准。

1. 手术与干预 活体 神经固定

注意：本方案中使用的所有材料和设备的供应商信息均列在材料表中。

注意：体内神经固定用于保存组织，并减少从动物死亡到神经采集期间可能发生的结构降解。 体内组织固定是神经系统组织制备用于组织学分析的标准操作，通常以灌注作为其前期步骤。外周神经的位置和大小允许进行原位固定。由于存在组织降解的可能性，我们不推荐在动物安乐死后进行组织采集与固定。

1. 将大鼠置于含有 2-3% 异氟烷的诱导室中以准备全身麻醉，随后将已麻醉的大鼠俯卧位放置在解剖板上，并通过麻醉鼻罩维持 1-2% 异氟烷。 为确保麻醉深度充分，需测试动物后肢足部的缩足反射，并通过触碰眼内眦检查是否存在眼睑反射缺失。
   注意：腹腔注射氯胺酮是吸入异氟烷的一种常用替代方法。
2. 为暴露坐骨神经，剃除后肢的毛发，并用 70% 乙醇清洁剃毛区域。使用手术刀或剪刀沿后肢从膝关节向上至大转子处做一 2-3 cm 的皮肤切口，期间可用无菌手术刀触诊股骨，以确保切口位置准确。 股骨位于坐骨神经最易接近段的近端。尽管此为非存活手术，仍需保持无菌操作....

结果

用树脂包埋的周围神经切片经甲苯胺蓝染色后，可实现准确的组织学数据定量分析。该操作流程概览见（图2）。坐骨神经切片经树脂介质包埋并用甲苯胺蓝染色后，呈现出清晰且分辨率理想的图像（图3）。神经损伤可导致神经形态结构发生多种变化，例如神经纤维、轴突直径以及髓鞘厚度的改变。该方法能够以接近天然的状态保存神经结构，从而便于测量多个参数，例如轴突直径与总纤维直径的比值（即g比值；图4）。多种因素可能导致周围神经切片质量不理想，例如由于神经处理不当而在切片中出现裂纹（图5A）；脱水不充分可能导致切片中出现孔洞（图5B）；另一个可能的操作误差是切片折叠（图5C），可通过使用接种环将切片转移至载玻片上来避免。

讨论

周围神经损伤与再生的形态学结构研究是常见的研究课题¹³。在本实验方案中，我们描述了如何利用包埋在树脂块中的大鼠坐骨神经组织，经甲苯胺蓝染色后获得高质量图像，以进行组织学数据定量分析的步骤。该技术可呈现神经形态图像，通过测量轴突数量、髓鞘化程度、纤维化组织浸润情况以及神经健康状况，对神经再生进行量化评估。尽管图像展示的是未损伤神经的切片与处理样本，但只要组织固定充分，相同步骤和材料同样适用于受损神经，以及通过导管或组织移植实现再生的神经^20,21_。

尽管本方案的所有步骤都很重要，但其中某些步骤更可能导致切片质量差或图像不佳。组织脱水不充分可能导致神经切片出现孔洞（图5B）。一种可能的解释是树脂与水不相溶，组织中残留过多水分会阻碍树脂渗入组织。因此，留出充足的脱水时间并使用纯丙酮对于确保脱水步骤的成功至关重要。虽然本方案中使用了丙酮，但乙醇也.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
杜氏磷酸盐缓冲液	Gibco	14200-075
戊二醛溶液	Sigma-Aldrich	G6257
多聚甲醛	Sigma-Aldrich	P6148
一水合磷酸二氢钠	Sigma-Aldrich	S9638
甲苯胺蓝 O	Sigma-Aldrich	T3260
十水合四硼酸钠	Acros Organics	205950010
异氟烷	Piramal	NDC 66794-013-25
环氧树脂包埋试剂盒	Sigma-Aldrich	45359
氢氧化钠溶液	Sigma-Aldrich	72068	用于调节 Trump 固定液的 pH 值
丙酮	Fisher Chemical	170942
四氧化锇溶液	Sigma-Aldrich	75632
VWR 显微载玻片，Superfrost Plus	VWR	48311-703
显微镜盖玻片	Fisher Scientific	12545102
Pelco 包埋模具	Fisher Scientific	NC9671811
玻璃刀制备仪	RMC Products	GKM-2
超薄切片机	RMC Products	MT-XL
15 mL 锥形管	Falcon	ISO 9001
Eppendorf 1.5 mL 微量离心管	Sigma-Aldrich	T9661
4 mL 玻璃小瓶	Sigma-Aldrich	854190
剃须刀片	VWR	55411-050	用于修整树脂块
完美捞取环	Electron Microscopy Sciences	70944	用于捞取薄树脂切片
超薄玻璃刀条 6.4 mm × 25 mm × 400 mm	Electron Microscopy Sciences	71012
100 瓦烘箱	Millipore	6350115
Whatman 滤纸	Sigma-Aldrich	WHA10010155
3 mL 塑料移液管	Sigma-Aldrich	Z331740
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