方法文章

利用人多能干细胞来源的星形胶质细胞与神经元三维共培养构建突触微环路模型

DOI：

10.3791/58034

⸱

2018年8月16日

 ,  , 
1Center for Neuroregeneration, Department of Neurosurgery, Houston Methodist Research Institute

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在本实验方案中，我们旨在描述一种可重复的方法，用于将解离的人多能干细胞来源的神经元与星形胶质细胞共同组合形成三维球状共培养体系，在悬浮条件下维持这些细胞球的生长，并随后通过免疫分析和多电极阵列记录来检测细胞球中突触环路的活性。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

目前，研究各种细胞类型和信号如何参与突触环路功能的主要障碍之一，是缺乏可用于研究人脑的合适模型。为解决这一问题，一种新兴技术是采用三维（3D）神经细胞培养系统，即所谓的“类器官”或“球状体”，以长期维持包括细胞外黏附分子在内的细胞间相互作用。然而，这些培养体系耗时较长，且难以实现系统性制备。本文详细介绍了一种利用人多能干细胞快速且稳定地生成神经元与星形胶质细胞三维共培养体系的方法。首先，将预先分化好的星形胶质细胞和神经前体细胞进行解离并计数。随后，将细胞以特定比例混合，并加入Rho激酶抑制剂，接种于成球培养皿中，以形成大小可重复的细胞球。经过数周悬浮培养后，共培养物（“星状体”，asteroids）可被切片用于免疫染色，或接种至多电极阵列上，以检测突触密度和突触强度。总体而言，本方案预期可获得表达成熟细胞类型特异性标志物、形成功能性突触并表现出自发性突触网络簇状放电活性的三维神经球。该体系相较于单层培养模型，更适用于药物筛选以及疾病机制的研究。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

星形胶质细胞是中枢神经系统（CNS）中数量极为丰富的胶质细胞类型，其功能远不止提供结构支持。通过分泌可溶性突触生成因子和细胞外基质（ECM）成分，星形胶质细胞在发育过程中促进成熟突触的形成与聚集1。它们还通过细胞外信号传导在维持突触健康和可塑性方面发挥关键作用2,3,4,5，并通过调节细胞外钾离子和谷氨酸水平，以及分泌能量底物和ATP，参与内环境稳态的长期稳定6,7,8。此外，星形胶质细胞可通过影响突触外电流参与神经传递9，并可通过影响其他细胞类型（如促进髓鞘形成10）间接调控神经活动。重要的是，由于星形胶质细胞的异常或功能障碍可导致多种神经发育综合征及成年期神经病理改变，因此为了更真实地模拟内源性脑环境，有必要在构建的神经网络中将星形胶质细胞与神经元共同纳入。星形胶质细胞的一个重要特征是其能够与神经元突触形成动态相互作用1,11,12。在缺乏胶质细胞的情况下，神经元形成的突触数量有限，且这些突触通常缺乏功能上的成熟性13。

人类星形胶质细胞表现出形态学、转录组学和功能上的特征——例如体积增大、分支更为复杂，以及具有物种特异性的基因——这些特征在啮齿类动物中并未重现12,14,15因此，利用人多能干细胞（hPSC）衍生的神经细胞开展研究已被广泛接受为研究中枢神经系统相关疾病的一种手段。 体外 在开发新疗法、损伤模型和培养范式的同时16,17此外，人多能干细胞（hPSCs）使得无需使用原代组织即可研究人类突触的形成与功能18,19.

目前对各类细胞类型和信号如何影响突触环路功能的理解存在障碍，其主要原因在于缺乏与人类大脑相关联的模型。迫切需要一个合适的平台，以高保真度和可重复性重现大脑的突触网络。近年来，人们开始关注三维（3D）培养系统（通常称为“类器官”、“球状体”或“迷你大脑”）20的构建，用于在细胞和宏观层面模拟复杂的三维结构。三维培养系统能够保留细胞外基质（ECM）以及细胞间的相互作用，而这些在传统的二维共培养模式中通常缺失或受限21,22。目前已有多种技术可用于培养三维神经球状体23,24,25；然而，许多方法需要漫长的培养周期（数月到数年），以实现自发发育和分层结构的维持，且实验者对最终结果的控制能力非常有限。

本文介绍了一种系统性方法，通过将人多能干细胞（hPSCs）来源的多种细胞类型（预先分化的神经元和星形胶质细胞）组装成球形共培养体系（“asteroids”）26，从而在三维环境中快速且稳定地构建神经相互作用，重现人类特有的形态复杂性。该高密度神经体系可生成均匀分布的神经亚型，随时间推移逐渐获得成熟特性，并可用于高通量筛选或检测。我们首次证明，在此类三维共培养体系中，人源星形胶质细胞可诱导突触网络簇状放电活动。此外，本实验方案易于调整，可用于生成不同大小的细胞球，适用于具有不同中枢神经系统区域特征的细胞，并可根据需要研究多种其他细胞类型之间的相互作用。

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方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 细胞培养与试剂配制

注意：本节中的实验方案按照其在分化方案（第 2 节）中出现的顺序编写。有关材料及目录编号，请参见材料表。

  1. 准备用于细胞培养的包被板。
    1. 将细胞外基质（ECM）包被溶液用DMEM/F12培养基稀释，配制浓度为1 mg/mL的储存液。将稀释后的ECM储存液分装至30个锥形管中，每管3 mL，并立即于-20 °C保存。使用前，取3 mL ECM储存液加入33 mL预冷的DMEM/F12培养基中，终体积为36 mL，得到浓度为80 µg/mL的工作液。
    2. 用ECM工作液以每孔1 mL的量包被6孔细胞培养板。每孔额外加入1 mL DMEM/F12培养基（如需要），以确保孔底表面完全被覆盖。将包被好的6孔板在室温下静置至少1小时后使用。
      注意：包被后的培养板可在培养箱或4 °C保存最多2周。
  2. 准备培养基配方、生长因子和小分子化合物。
    1. 配制500 mL人多能干细胞（hPSC）培养基27时，按照生产商说明书添加20x和500x补充剂。
    2. 配制500 mL神经培养基（NM）时，向含L-谷氨酰胺补充剂的500 mL DMEM/F12培养基中加入肝素至终浓度为2 mg/mL，以及1x抗生素/抗真菌溶液、1x B27补充剂或1x N2补充剂，具体如前所述28。
    3. 配制10 mM（1,000x）浓度的Rho激酶抑制剂Y27632（Y）储存液：将10 mg粉末溶于3 mL磷酸盐缓冲液（PBS）中。过滤除菌后分装，并于-20 °C保存。使用时在培养基中的工作浓度为10 µM。
    4. 配制20 mM（10,000x）浓度的SB431542储存液：将10 mg粉末溶于1.3 mL二甲基亚砜（DMSO）中；配制2 mM（1,000x）浓度的DMH1储存液：将10 mg粉末溶于13.1 mL DMSO中。过滤除菌后分别分装，并于-20 °C保存。使用时在培养基中的工作浓度均为2 µM（NM + SB431542 + DMH1）。
      注意：本方案推荐SB431542和DMH1的工作浓度均为2 µM，依据为我们的观察结果及他人报道29，表明该浓度可有效促进hPSC向神经方向诱导。也有文献报道使用更高浓度30。此外，在其他培养体系中已有研究表明，小分子化合物并非实现高效神经转化所必需31。因此，最佳工作浓度可能因不同的细胞培养环境而异，需由研究人员根据实际情况进行优化测试。
    5. 分别配制100 µg/mL（10,000x）浓度的表皮生长因子（EGF）和成纤维细胞生长因子-2（FGF2）储存液：将各1 mg粉末分别溶于10 mL含0.1% BSA的PBS中。将EGF和FGF2储存液分装为每份50 µL，并于-80 °C保存。使用时在培养基中的工作浓度为10 ng/mL；例如，向50 mL NM中加入5 µL EGF和5 µL FGF2（NM + EGF + FGF2）。
    6. 配制盐酸多西环素（Dox）储存液时，先将粉末溶于DMSO中至100 mg/mL，于-20 °C保存。再用PBS稀释为2 mg/mL（1,000x）的储存液，并于-20 °C保存。使用时在培养基中的工作浓度为2 µg/mL；例如，向50 mL NM中加入50 µL Dox（NM + Dox）。
      注意：溶液解冻后请勿再次冷冻。

2. 由人诱导性多能干细胞（hPSCs）生成神经亚型

注意：所有细胞培养物均应在含 5% CO2 的 37 °C 培养箱中进行培养。这些培养物维持在室温氧浓度下，但也可使用较低的氧浓度。

  1. 从人多能干细胞（hPSCs）中生成并维持星形胶质细胞前体细胞（hAstros）。
    注意：本节提供一个简要且简化的分化方案。如需详细描述（包括拟胚体形成、神经玫瑰花结选择及区域模式化步骤），请参考先前报道的方案28（图1A，绿色虚线框）。
    1. 将hPSC细胞团（图1B）接种至经细胞外基质（ECM）包被的6孔板中，每孔加入2 mL hPSC培养基 + Y。每日换液，直至细胞融合度约达50%，根据需要进行传代。
      1. 传代hPSC时，向孔中加入1 mL传代试剂，1分钟后吸除，室温孵育5分钟，加入1 mL hPSC培养基，将细胞团以1:10比例传代至新的ECM包被孔中，每孔加入2 mL hPSC培养基 + Y。
    2. 维持干细胞培养至融合度约50%后，更换为NM + SB431542 + DMH1培养基以诱导神经分化（第0天）。当细胞融合度达约95%时，以1:6比例传代至新的ECM包被孔中，使用相同培养基。
    3. 第14天，使用解离溶液解离细胞，并转移至未包被的培养瓶中，加入Y以促进细胞团聚集。
      注意：添加Y可促进细胞存活和球体形成，但并非每次换液均需添加。
    4. 如需生成神经前体细胞和神经元（hNeurons），可使用第14天的细胞，具体方法如下。或者，在神经元成熟或胶质发生启动之前，也可在后续时间点从单层或球体培养中取用这些细胞。
      注意：默认情况下，本方案生成背侧皮层来源的星形胶质细胞。但如需获得特定区域亚型的星形胶质细胞，可通过添加模式化形态发生素实现28,32,33。添加视黄酸（RA）可使细胞向脊髓表型尾侧化，而 sonic hedgehog（SHH）、smoothened激动剂（SAG）或purmorphamine可诱导腹侧表型。
    5. 如需在自发形成的三维细胞团（hAstrospheres）中生成星形胶质前体细胞和星形胶质细胞，更换为NM + EGF + FGF2培养基，每周换液一次（或根据需要维持稳定pH），具体操作如前所述34。
      1. 当细胞团出现深色中心时，使用解离溶液轻柔解离hAstro细胞团，并移除自发贴壁的球体。每周轻柔吹打破碎球体一次，以维持球体健康，避免形成坏死核心。
        注意：解离溶液处理时间不得超过5分钟。
      2. 经过4–6个月扩增后，确认细胞身份，可选择按照说明书使用冻存液冻存，或采用其他适宜条件长期保存于液氮中，也可直接用于实验。
    6. 复苏冻存的hAstrospheres时，将冻存管在室温下快速解冻，转移内容物至一个空的15 mL离心管中，以300 ×g离心1分钟。小心吸除上清，用DMEM/F12洗涤一次，重复洗涤共两次。将细胞重悬于T25培养瓶中，加入总量为6 mL的NM + EGF + FGF2 + Y培养基（或根据需要按比例放大）。
  2. 从人多能干细胞（hPSCs）中生成并维持可诱导神经元（iNeurons）。
    1. 将转基因hPSCs（携带稳定表达的多西环素诱导型neurogenin 2转基因35）接种至ECM包被的6孔板中，每孔加入2 mL hPSC培养基 + Y（接种方法同非转基因细胞系）。每日每孔换液2 mL，直至细胞融合度达70%时准备传代。传代方法见步骤2.1.2。
    2. 当细胞融合度约达35%时，加入NM + Dox以诱导分化为iNeurons。在进入步骤3.2前，以NM + Dox维持单层培养2天。
      注意：细胞将转变为神经前体细胞，但尚未开始延伸神经突（图1C）。

3. 三维球体共培养物的制备与维持

  1. 将悬浮状态的3D聚集体中的hAstros解离（如步骤2.1.5.1所述）。
  2. 从2D单层培养物中解离hNeurons或iNeurons。
    1. 从6孔板中移除培养基，并向每孔含有单层培养物的孔中加入500 µL解离溶液。在37 °C下孵育5分钟。轻轻加入2–3 mL DMEM/F12以去除贴壁细胞。
    2. 收集细胞和培养基至15 mL锥形管中，在300 xg下离心1分钟。吸除上清液，加入1 mL新鲜培养基，并使用1,000 µL移液器轻轻吹打数次，以获得单细胞悬液。
  3. 使用微孔培养板形成3D球体。
    1. 通过向微孔板的每个孔中加入0.5 mL抗黏附冲洗液来准备板。在2,000 xg下离心板5分钟。吸除冲洗液，向每孔加入1 mL DMEM/F12进行洗涤，然后再次吸除。
      注意：使用离心机时务必确保其处于平衡状态。
    2. 使用血细胞计数板或自动细胞计数器对每种细胞类型进行计数。将解离后的hAstros与hNeurons或iNeurons按所需比例加入各孔中，总体积为2 mL NM + Y（若使用iNeurons，则包含Dox）。在100 xg下离心板3分钟，然后放回培养箱。
      注意：24孔微孔板（见材料表）每孔包含300个微孔。每孔在2 mL培养基中至少加入6 × 105个细胞（每个球体含2 × 103个细胞），最多加入6 × 106个细胞（每个球体含2 × 104个细胞）。若需在此范围内获得特定密度的可存活球体，请使用确定数量的细胞并除以300，以计算每个球体的细胞数。如有需要，也可使用其他球体形成方法和工具。请遵循制造商关于细胞密度可接受范围的说明。
    3. 在接下来的2天内，让细胞在微孔板中自组装成紧密堆积的球体（图2A）。若培养基变黄，则更换50%的培养基。
      注意：更换培养基时仅替换一半体积，并在移除和添加培养基时轻柔操作移液器，以免扰动球体。施加较大力量可能导致球体从微孔中脱离并相互融合。
    4. 2天后，使用1,000 µL移液器轻轻将球体从微孔中移出（图1D）。用培养基轻轻施力于微孔底部，以去除任何额外黏附的球体。让球体在15 mL锥形管中沉降，吸除旧培养基，并加入新鲜培养基。
  4. 设置旋转烧瓶生物反应器系统以形成3D球体。
    1. 用70%乙醇清洁磁力搅拌板表面，并将其放入细胞培养箱中。对各个旋转烧瓶进行高压灭菌以实现消毒。
    2. 向每个旋转烧瓶中加入球体及至少50–60 mL培养基（图1D，插图）。将烧瓶置于设定为60 rpm的磁力搅拌板上。在旋转烧瓶中培养球体直至准备进行数据采集。
      注意：需要至少3周的培养时间以实现突触形成。若不希望使用旋转烧瓶生物反应器系统，也可在静止条件下于细胞培养瓶或培养皿中培养球体。球体也可包埋于ECM或水凝胶中。

4. 使用多电极阵列（MEAs）测量活体突触生理学

  1. 准备用于细胞培养的多电极阵列（MEA）。
    1. 用1 mL去污剂清洁每个多电极阵列（MEA）表面，持续1小时。用无菌去离子水（DI水）冲洗，再用70%乙醇冲洗以灭菌，然后在生物安全柜内的紫外光下风干。
      注意：多电极阵列（MEA）可在无菌条件下保存于4 °C的去离子水中，直至使用。
    2. 将50 mg多聚鸟氨酸（PLO）溶解于100 mL硼酸缓冲液中，配制成0.5 mg/mL的PLO溶液。在每个多电极阵列（MEA）表面加入1 mL PLO溶液，使表面具有亲水性，并在37 °C下孵育至少4小时。去除PLO溶液，用去离子水清洗表面，加入1 mL细胞外基质（ECM）（见步骤1.1.1），并在37 °C下孵育至少4小时。
    3. 去除细胞外基质（ECM），将神经球置于1.5 mL培养基中，放置在多电极阵列（MEA）表面，确保神经球位于电极阵列上方（图3A、3A’）。使其贴附2天。每2–3天更换一半培养基（必要时可更频繁），注意避免扰动神经球。
      注意：添加生长因子可能有助于提高培养物的存活率和成熟度。
  2. 测量神经球的电活动。
    1. 设置一个多电极阵列（MEA）系统，配备温度控制的前置放大器。创建一个软件程序，设置高通滤波器为5 Hz，低通滤波器为200 Hz，动作电位检测阈值为5倍标准差（SD）。
    2. 将多电极阵列（MEA）放置在前置放大器上，记录自发性电活动（图3B、B’）。保存原始数据，包括动作电位频率和振幅，用于统计分析。
      注意：可结合灌流系统使用多电极阵列（MEA），以便添加药理学试剂或在长期记录期间增加新鲜培养基的流动。可根据需要对动作电位进行进一步的后处理36，37。

5. 使用免疫细胞化学法测量突触密度

  1. 准备试剂。
    1. 配制 500 mL 的 4% 多聚甲醛（PFA）储备液：在通风橱内的玻璃烧杯或搅拌板上加入 400 mL 的 1× PBS，放入搅拌子，加热至 60 °C 并持续搅拌，切勿煮沸。将 20 g PFA 粉末加入加热的 PBS 溶液中，并逐滴缓慢加入 1 N NaOH，调节 pH 至 6.9。
      注意：4% PFA 溶液可分装后于 4 °C 保存，最长可保存一个月。
    2. 向 100 mL PBS 中分别加入 20 g 或 30 g 蔗糖，配制成 20% 和 30% 的蔗糖溶液。
    3. 向 10 mL PBS 中加入 1 mL 去垢剂，配制 10% 储备液，反复倒置数次以混匀。
    4. 向 10 mL PBS 中加入 250 µL 10% 去垢剂储备液（终浓度为 0.25%），以及山羊和驴血清各 500 µL（终浓度均为 5%），配制一抗封闭缓冲液。
    5. 向 10 mL PBS 中加入山羊和驴血清各 100 µL（终浓度均为 1%），配制二抗封闭缓冲液。
  2. 准备样品。
    1. 将类球体转移至 15 mL 圆锥管中，静置使其沉降至管底，吸除旧培养基。用 500 µL PBS 清洗类球体一次，静置沉降后吸除 PBS。加入 500 µL 4% PFA（或足量以完全覆盖类球体），于 4 °C 孵育 30 分钟。
    2. 吸除 PFA 溶液，用 PBS 轻柔洗涤两次。加入 20% 蔗糖溶液，于 4 °C 孵育数小时或过夜。小心吸除溶液后，加入 30% 蔗糖溶液，于 4 °C 继续孵育数小时或过夜。
      注意：样品可在 PBS 或蔗糖溶液中于 4 °C 保存最多一周后再进行下一步操作。若不进行切片，可将类球体保持为三维结构（图 4A-C），置于 1.5 mL 管中，直接进入步骤 5.3。
    3. 若需切片，将类球体小心转移至置于干冰上的冷冻包埋模具中。吸除 30% 蔗糖溶液，缓慢加入组织包埋液直至完全覆盖样品，避免产生气泡。待溶液完全冻结后，于 -80 °C 保存，直至进行冷冻切片。
    4. 使用 -20 °C 的冷冻切片机将包埋块切成 30 µm 厚的切片（或按需调整厚度），转移至载玻片上。切片可于 -80 °C 保存，直至染色使用。
  3. 对类球体进行免疫染色。
    1. 使用疏水性 PAP 笔在载玻片边缘划线，防止液体溢出。根据材料表配制一抗和二抗封闭溶液。每张载玻片或管中加入 500 µL 一抗封闭缓冲液，室温孵育 30 分钟。
    2. 吸除液体，每张载玻片或管中加入含稀释后一抗的 500 µL 新鲜一抗封闭缓冲液，于 4 °C 过夜孵育。移除一抗溶液，用 PBS 洗涤 3 次，每次 10 分钟。
    3. 每张载玻片或管中加入含稀释后二抗的 500 µL 二抗封闭缓冲液，于 4 °C 孵育 1 小时。移除二抗溶液，用 PBS 洗涤 3 次，每次 10 分钟。
      注意：材料表中列出了推荐使用的抗体，也可根据需要选用其他抗体或染料。自步骤 5.3.3 起，避免荧光样品暴露于光照下。
    4. 滴加 50 µL 封片液覆盖样品表面，小心盖上盖玻片，避免产生气泡。室温干燥 24 小时后，于 4 °C 保存。
  4. 成像分析载玻片。
    1. 使用配备 63X 油镜的共聚焦或双光子荧光显微镜对类球体切片中的突触前和突触后蛋白丰度及其共定位进行成像（图 4D）。使用 20X 或 40X 物镜观察 hAstros 的形态学特征。
    2. 使用 ImageJ 软件打开荧光图像文件。使用 Cell Counter 插件手动计数突触前和突触后斑点，采用无偏倚计数方法（如先前文献38所述），或使用其他替代方法进行分析。

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

若操作得当，本方案将生成由人多能干细胞（hPSCs）分化而来的功能明确的星形胶质细胞28,33,34与神经元35共培养体系（图1A-1C），具体步骤如前文所述26，并在本文2.1–2.2步骤中详细描述。该分步操作结合微孔板的使用，预期可获得大小和形状均一的三维神经球（步骤3.3；图1D），细胞分布均匀，且无明显细胞死亡迹象。不同起始细胞密度（保持目标细胞类型比例）将产生不同尺寸的神经球。若不使用微孔板，细胞将聚集成显著更大且不均一的团块，其直径（> 2 mm）将超过扩散极限（图2A

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在本实验方案中，我们描述了一种系统性方法，用于生成神经共培养的三维球体。这些球体由星形胶质细胞和神经元组成，二者均独立来源于人多能干细胞（hPSCs）。尽管本方案的重点不在于此，但从hPSCs中获得高纯度星形胶质细胞群体28是其中关键且技术上具有挑战性的步骤，若缺乏前期经验，操作难度较大。在构建这些突触微环路的过程中，第一步必须严格把握时间并注重操作细节。使用hPSC来源的星形胶质细胞的一个局限性在于其分化周期较长；然而，通过预先大量制备细胞并冻存以备后续实验时解冻使用（见步骤2.1.5），可避免每次均从初始的hPSC阶段重新开始。尽管由转基因hPSCs生成的诱导神经元（iNeurons）本身具有突触形成能力，并能表现出自发性突触后电活动，但这些特性在胶质细胞存在时显著增强12,35——包括本方案中详述的hAstros。因此需注意，细胞类型、数量以及发育阶段或成熟度的选择是本方案中的关键因素，任何调整均可能导致电活动特征或突触可视化结果的差异。然而，本方案也允许研究者根据自...

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们感谢加州大学旧金山分校（UCSF）的 Erik Ullian 博士在这些实验方案设计方面提供的学术指导，感谢美国国立卫生研究院（NIH）的 Michael Ward 博士在诱导神经元分化技术方面的建议，以及 Saba Barlas 在初步图像分析方面的工作。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
6 孔板Fisher Scientific08-772-1B
15 mL 圆锥形离心管Olympus Plastics28-101
AccutaseSigmaA6964-100ML细胞解离溶液
AggreWell 板Stemcell Technologies34850
防粘附冲洗液Stemcell Technologies7010防止细胞粘附至微孔板
Anti/antiThermofisher15240062
B27Thermofisher17504044培养基添加剂
BrainPhys 神经元培养基Stemcell Technologies5790神经生理学基础培养基替代品
圆形玻璃盖玻片NeuvitroGG-12-oz
Cryostor CS10Stemcell Technologies7930含 10% DMSO 的冷冻保存培养基
DMEM/F12Thermofisher10565-042含 GlutaMAX 添加剂
DMH-1Stemcell Technologies73634危险：吞咽有毒。工作浓度：2 μM
驴血清Lampire Biological Laboratories7332100工作浓度：一抗封闭缓冲液中为 5%，二抗封闭缓冲液中为 1%
盐酸多西环素（Dox）SigmaD3072-1ml危险：对孕妇有毒。工作浓度：2 μg/mL
表皮生长因子（EGF）PeprotechAF-100-15工作浓度：10 ng/mL
成纤维细胞生长因子-2（FGF）Peprotech100-18B工作浓度：10 ng/mL
Fluoromount-G 封片液Southern Biotech0100-01
载玻片Fisherbrand22-037-246
山羊血清Lampire Biological Laboratories7332500工作浓度：一抗封闭缓冲液中为 5%，二抗封闭缓冲液中为 1%
血细胞计数板或自动细胞计数仪Life TechnologiesAMQAX1000
肝素SigmaH3149-50KU工作浓度：2 mg/mL
磁力板DLAB8030170200
Matrigel 基质膜Corning354230ECM 包被溶液。工作浓度：80 μg/mL。需在冰上配制，并确保移液器、离心管和培养基预先冷却。
MEA 2100 系统Multichannel SystemsMEA2100
封片液
N2Thermofisher17502048培养基添加剂
OCTTissue-Tek4583冷冻切片组织包埋液
疏水笔（Aqua Hold）Scientific Device Laboratory9804-02
多聚甲醛（PFA）Acros Organics169650025危险：吸入有毒。工作浓度：4% PBS 溶液
磷酸盐缓冲液（PBS）Stemcell TechnologiesCA008-300
多聚-L-鸟氨酸（PLO）SigmaP3655-100MG工作浓度：0.5 mg/mL
矩形玻璃盖玻片Fisherfinest Premium Superslip12-545-88
ReLeSRStemcell Technologies5872细胞解离与传代试剂
Rho 激酶抑制剂 Y27632-（Y）Tocris1254工作浓度：10 uM
SB431542Stemcell Technologies72234工作浓度：2 μM
旋转培养瓶Fisher Scientific4500-125
蔗糖Fisher ChemicalS5-3工作浓度：20% 或 30% PBS 溶液
T25 培养瓶Olympus Plastics25-207带透气盖
T75 培养瓶Olympus Plastics25-209带透气盖
Terg-A-zymeSigmaZ273287-1EA洗涤剂。工作浓度：1%
TeSR-E8 基础培养基Stemcell Technologies5940人多能干细胞（hPSC）培养基
TeSR-E8 添加剂Stemcell Technologies5940人多能干细胞培养基添加剂
TritonX-100SigmaX100-500ML用于细胞通透的洗涤剂。工作浓度：封闭缓冲液中为 0.25%
台盼蓝InvitrogenT10282
抗体
AlexaFluor 488ThermofisherA-11029二抗
AlexaFluor 594ThermofisherA-11037二抗
EzrinThermofisherMA5-13862一抗；星形胶质细胞突触周围标记
GFAPChemiconMAB360一抗；星形胶质细胞
GFPAvesGFP-1020一抗；星形胶质细胞
Glt1Jeffrey Rothstein 博士惠赠n/a一抗；星形胶质细胞
HomerSynaptic Systems160 011一抗；神经元，突触后
MAP2Synaptic Systems188 004一抗；神经元
PSD95Abcamab2723一抗；神经元，突触后
S100Abcamab868一抗；星形胶质细胞
Synapsin 1Synaptic Systems106 103一抗；神经元，突触前
TuJ1/β3-微管蛋白（TUBB3）CovanceMMS-435P一抗；神经元

参考文献

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