通过等离子体金纳米颗粒可控成核空化以增强高强度聚焦超声应用

摘要

本方案通过同时使用近红外脉冲激光和高强度聚焦超声（HIFU）照射凝胶模型，实现了空化成核的可控诱导。所产生的空化效应可用于增强HIFU的成像效果和/或治疗应用。

摘要

在本研究中，等离子体金纳米颗粒在组织模拟凝胶模型中同时暴露于脉冲近红外激光和高强度聚焦超声（HIFU），以实现空化现象的可控成核。 体外 该方案旨在验证此方法在癌症成像增强与治疗应用中的可行性。通过调节高强度聚焦超声（HIFU）系统的照射时间，同一装置既可用于成像，也可用于治疗。在短时照射（10 µs）条件下，通过金纳米颗粒周围受控的惯性空化成核过程产生宽带声发射，这些声信号可直接定位纳米颗粒。在未来的应用中，这些纳米颗粒可偶联分子靶向抗体（例如用于乳腺癌的抗HER2抗体），从而实现对癌变区域的精确定位，补充常规诊断性超声成像。在连续波（CW）照射条件下，利用空化活动增强HIFU照射引起的局部加热，导致凝胶仿体中更大的热损伤区域。在此类CW照射过程中，通过被动空化检测（PCD）系统监测惯性空化活动所产生的声发射，以实时反馈空化活动情况。只有将纳米颗粒、激光光与HIFU三者独特结合，才能实现增强的局部加热效果。该技术尚需在癌症的临床前模型中进一步验证。

引言

高强度聚焦超声（HIFU）或聚焦超声手术（FUS）是一种非电离、非侵入性的技术，可用于皮下组织的热消融¹。HIFU 的主要用途是治疗软组织肿瘤²，但其也开始应用于其他领域，例如治疗骨肿瘤³或神经系统疾病⁴。目前限制 HIFU 在临床广泛应用的主要因素有两个：一是治疗引导困难，二是治疗时间较长⁵。本方法所描述的 HIFU 与脉冲激光照射及等离子体金纳米棒相结合的技术，有望为克服 HIFU 当前的局限性提供一种途径⁶。

在HIFU照射过程中，组织消融的主要机制是热损伤。然而，空化活动也可能发挥作用⁸。HIFU照射期间发生的空化活动可能包括机械介导和/或热介导的空化。机械介导的空化通常被称为声学空化⁷，可进一步细分为气泡表现出非惯性或惯性行为⁹。热介导的空化则源于气体囊泡的形成，通过脱溶或汽化实现，通常称为“沸腾”¹⁰。研究表明，空化活动（最常见的是惯性空化）能够增强HIFU照射所达到的热升温速率¹¹，从而有助于克服HIFU的一项关键局限性。然而，HIFU照射期间空化的形成和活动可能具有不可预测性，并可能导致不良影响，例如过度治疗区域或不对称的热消融¹²。为了控制HIFU照射期间的空化活动，已有研究探索引入外部成核中心，包括微泡¹³、相变型纳米乳液¹⁴或等离子体纳米颗粒¹⁵。微泡和纳米乳液均已被证明可提高成像信噪比并增强热消融效果。然而，由于它们具有短暂的性质，在多次重复的HIFU照射中功能有限。对HIFU照射期间空化活动的监测可通过主动或被动空化检测（分别为ACD或PCD）进行。PCD是空化检测的首选技术，因其可与HIFU照射同步进行，并提供频谱内容信息。该频谱信息可进一步分析，以帮助识别正在发生的空化活动类型¹⁶。宽带声发射被用于检测，因为这些发射信号是惯性空化存在的特有标志¹⁰，并与增强的HIFU加热效应相关¹¹。

光声成像（PAI）是一种新兴的临床成像技术¹⁷，它结合了脉冲激光激发的光谱选择性与超声成像的高分辨率优势¹⁸。该技术此前已被用于引导高强度聚焦超声（HIFU）照射¹⁹，但其成像能力受限于激光穿透深度。等离子体金纳米颗粒可作为“对比剂”，增强局部激光吸收，从而提高光声信号的强度²⁰。在足够高的激光注量下，可诱导产生微小的蒸汽泡，用于实现高空间分辨率的成像²¹。然而，此类照射参数通常超过人体使用激光的安全最大允许暴露限值²²，因而应用受限。本研究采用的方法此前已证实，当等离子体纳米颗粒同时暴露于激光照射和高强度聚焦超声时，诱导微小蒸汽泡成核所需的激光注量和声学压力显著降低，同时成像信噪比得以提升²³。本文描述了一种将等离子体纳米颗粒与激光及高强度聚焦超声联合使用的方法，以实现对蒸汽泡成核及其活动的高度可控性。

方案

1. 组织模拟体模的制备

注意：本研究中所有实验所用的光学透明组织模拟体声学特性详见 Choi，等²⁴

注意：每个模型模具包含约 50 mL 溶液，每批共填充五个模具。因此，共需制备 250 mL 模型溶液。

1. 向一个500 mL玻璃烧杯中加入148.2 mL（60% v/v）去离子、过滤并脱气的水，静置至与室温平衡。随后向烧杯中加入75 mL 40%（重量/体积）丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液（30% v/v）、25 mL 1 M TRIS缓冲液（pH 8）（10% v/v）以及2.15 mL 10%过硫酸铵（APS；0.86% v/v）。
2. 将玻璃烧杯放入位于磁力搅拌器上的真空腔室内，并在烧杯内放入一根长40 mm的聚四氟乙烯（PTFE）磁力搅拌子。以中等搅拌速度（即， 确保充分混合且不产生涡流的情况下，缓慢加入22.5 g（9% w/v）牛血清白蛋白（BSA）粉末。
3. 所有BSA加入溶液后，关闭真空室并开启真空泵。维持80 mBar/H的真空度，继续搅拌60分钟，随后释放真空。此时溶液应呈澄清状态，略带淡黄色。
4. 上述方法学适用于添加与未添加纳米颗粒的模体。如果需要纳米颗粒，加入10 µL（浓度为1x10⁸ 纳米棒的浓度为 np/mL，其表面等离子体共振（SPR）波长为 850 nm，直径为 40 nm。
5. 最后，加入125 µL四甲基乙二胺（TEMED）以催化模体的聚合反应。继续等待5分钟以确保充分混合，然后将模体溶液倒入5个独立的模具中，静置20分钟使其凝固。凝固后，从模具中取出模体，并存放于密封容器中直至使用。模体应在制备后24小时内使用。

2. HIFU 换能器自由场声压的校准

注意：在每次损毁/成像实验前，无需执行本方案的此部分内容。该步骤为定期进行的校准程序，以确保系统的声学输出正确。

1. 将一个丙烯酸水箱（280×141×132 mm）注入 4.5 L 去离子且脱气的水。将 HIFU 换能器安装在水箱一端的固定支架上，朝向水箱内部。在 HIFU 换能器的近似焦点位置（63 mm）处，与之平行地将一个已校准的（由英国国家物理实验室校准）膜式水听器安装在三轴手动千分尺平台上。
2. 将 HIFU 换能器（几何焦点为 63 mm）连接至阻抗匹配电路，然后连接至功率放大器（如图 1所示）。随后将膜式水听器直接连接至数据采集系统，并确保由连接至功率放大器的函数发生器提供触发信号（图 1）。
3. 将函数发生器的输出电压设置为 30 mV，输出 10 个周期、频率为 3.3 MHz 的正弦波，脉冲重复频率为 100 Hz。
4. 使用测量软件（见材料表）观察检测到的声学信号，并通过千分尺平台调节，使检测到的声脉冲对应正确的飞行时间（42.5 µm）。每次仅使用千分尺平台的一个径向方向，使检测到的声学信号最大化。确认达到最大信号后，关闭软件，并保持膜式水听器在当前位置不变。
5. 将函数发生器的输出电压以 20 mV 为步长，从 20 mV 逐步增加至 400 mV。在每个电压水平下，使用 MatLab 采集软件记录水听器信号。在每个水平采集 100 个脉冲，并利用提供的校准数据将电压信号转换为压力信号。对数据进行平均处理，并测量所有输出电压水平下的峰值正压和峰值负压。由此获得自由场峰值负压的校准数据，用于后续的脉冲和连续波研究。

3. 脉冲与连续波研究实验装置的配置

1. 将4.5 L去离子且脱气的水注入一个丙烯酸水箱（280×141×132 mm）中。将HIFU换能器和共轴宽带水听器安装在三轴手动千分尺平台上，然后将换能器和水听器完全浸入水箱中。示意图见图1。
2. 将HIFU换能器连接至阻抗匹配电路，使其能够在第三谐波（3.3 MHz）下工作。该电路直接连接至射频功率放大器的输出端。数字函数发生器连接至功率放大器的输入端，并通过远程程序进行控制。
3. 在模体材料中进行辐照前，使用已校准的差分膜式水听器测量该系统在函数发生器给定输入电压下产生的峰值负压，方法如第2步所述。利用这些参考电压值，在数字函数发生器上设定所需的声压水平。
4. 将安装在HIFU换能器中央孔径内的宽带水听器（几何焦距63 mm）直接连接至5 MHz高通滤波器，然后通过40 dB前置放大器连接至14位数据采集卡（DAQ）。确保高通滤波器正确连接偏置电压。
   注：该采集卡安装于台式计算机中，用于控制所有硬件（相关软件示例见补充文件），并在本研究期间保存数据以供离线处理。
5. 使用晶体管-晶体管逻辑（TTL）数字延迟脉冲发生器，通过Bayonet Neill-Concelman（BNC）电缆连接脉冲激光系统和函数发生器，以确保这些系统之间的同步，从而使7 ns激光脉冲与HIFU换能器发出的第四个稀疏波峰值在目标区域同时发生。
6. 采用第1步所述方法，省略BSA和纳米颗粒以制备对准模体，该模体为含有1 mm球形金属靶标（滚珠轴承）的标准模体材料。为实现此目的，将25 mL模体材料倒入模具中，加入62.5 µl TEMED催化剂，静置约20分钟使其凝固。随后将金属靶标置于模体中心位置，再加入25 mL模体溶液及62.5 µl TEMED催化剂，继续静置20分钟。
7. 将对准模体放入3D打印支架⁶中，安装在自动三维平台上，并大致调整位置，使金属靶标位于HIFU换能器的焦点峰值处。
8. 利用HIFU换能器发射一个持续时间较短的10个周期脉冲（3 µs），并用水听器接收信号（直接连接至DAQ卡），通过脉冲回波定位法优化相对于对准靶标的位置。实时检测到的信号将在计算机上显示。使用安装HIFU换能器和水听器的手动千分尺平台调节飞行时间及信号幅度。当飞行时间设定为85 µs（单程往返时间）且径向两个方向上的信号幅度均达到最大时，系统即完成对准。
9. 利用由532 nm纳秒脉冲激光器泵浦的光学参量振荡器（OPO），通过一根2 mm光纤束将光能耦合进入模体。将该光纤安装在第二个千分尺平台上，并置于模体前方、与声轴成45˚角的位置（图1）。将激光波长设为680 nm以便于对准观察。观察到光斑后，调节千分尺平台，使激光照明区域中心对准，形成直径为15 mm的圆形光斑，且金属靶标位于其中心。
10. 将20–90倍数字显微镜（工作距离90 mm）和白光光源分别置于水箱两侧，垂直于HIFU换能器的传播平面。显微镜安装在小型千分尺平台上，调节其位置，使金属对准靶标位于视场（5×6 mm）中央并清晰对焦。
    注：完成上述步骤后，该系统的各个组件（HIFU换能器、水听器、激光照明系统和显微镜）均已共轴对准至同一特定位置。此时可将对准模体替换为本研究使用的组织模拟模体。由于模体安装在连接至三维定位系统的支架上，可在保持系统对准的前提下，对模体的不同区域进行靶向实验。

4. 脉冲HIFU照射下的空化阈值检测

注意：无论是否含有纳米颗粒，以下步骤均相同，且应重复三次。

1. 在按照3.8节所述对准步骤断开连接后，确保PCD系统已重新连接，并将激光波长调谐至纳米颗粒的表面等离子体共振（SPR）。使用自定义控制程序，设置函数发生器产生一个10个周期（3 µs）的高强度聚焦超声（HIFU）脉冲，该脉冲与激光系统同步。同时通过调节激光系统中闪光灯触发与Q开关开启之间的时间间隔，利用该程序将激光能量密度设定为0.4、1.1、2.1或3.4 mJ/cm²。
2. 将HIFU系统的焦点峰值定位在仿组织体模内深度10 mm处，并在垂直方向上以5 mm间隔选取13个不同位置。在每个位置，使用单一的峰值负压HIFU压力进行一次暴露，同时结合4.2节中所述的四种激光能量密度进行实验。
3. 针对以下三种暴露条件：无纳米颗粒的体模中开启激光、含纳米颗粒的体模中关闭激光、以及含纳米颗粒的体模中开启激光，分别使用峰值负压范围为0、0.91、1.19、1.43、1.69、1.92、2.13、2.34、2.53、2.71、2.83、3.00和3.19 MPa的参数进行暴露。为模拟“假”激光照射，按上述方式运行系统，但关闭OPO输出端的手动快门，此方法可确保产生的任何射频噪声仍会传递至PCD系统。
4. 将所有设置参数和暴露位置编程输入控制程序，然后执行以完成这些测量。PCD数据通过数据采集卡直接数字化并存储，用于后续处理。对于每组暴露参数，采集500次重复暴露数据⁶。
5. 采用McLaughlan et al. (2017)⁶详细描述的方法，对PCD系统检测到的短时HIFU暴露在体模中产生的宽带发射信号进行处理。

5. 连续波HIFU照射下的热变性

注意：以下步骤对于含有或不含纳米颗粒的模型均相同，且重复进行了三次。

1. 将激光系统设置为提供 3.4 mJ/cm² 的能量密度，并将函数发生器设置为提供连续波暴露（每 330,000 个周期的脉冲串与一个激光脉冲同步）。在模型中的 11 个不同位置，分别选择峰值负压为 0.20、0.62、0.91、1.19、1.43、1.69、1.92、2.13、2.34、2.53 或 2.71 MPa。
2. 总暴露时间设为 17 秒，以便在模型中进行 15 秒的连续波 HIFU 暴露前后各采集 1 秒的基线数据。在此总暴露期间，数据采集系统记录 PCD 数据。显微镜连接至控制用 PC，同时记录图像帧，以直接可视化热损伤的形成过程。
3. 针对 4.4 中列出的所有不同暴露条件，重复 4.3 中的过程。
4. 对所有 PCD 数据进行离线处理，以计算每次暴露的惯性空化剂量²⁵。

结果

脉冲HIFU照射下的空化检测

被动空化检测系统记录了在含有和不含有纳米颗粒的仿组织体模中，不同HIFU和激光照射条件下的电压/时间数据。图2展示了多种照射条件下的代表性结果。这些图中的时间尺度被截断，以突出显示由于声发射传播时间而预期出现宽带声发射的区域。图2表明，只有当纳米颗粒、HIFU照射和激光照射三者同时存在时，才能检测到宽带发射信号。然而，这一现象仍具有阈值特性，如图2h所示，在较低声压下未检测到宽带发射。这些发射信号的持续时间通常与HIFU照射时间一致，在本研究中约为10 µs。

连续波HIFU照射引起的热变性

图3展示了在一次HIFU照射过程中，通过通用串行总线（USB）相机在三种不同照射条件（有/无激光照射和/或纳米颗粒）下采集到的一系列图像帧。该图展示了在每种条件下凝胶仿体中热损伤灶形成的示例。在此视图中，HIFU照射从左向右进行。在图3所示示例中，负压峰值为2.53 MPa，这是本研究中所使用压力的上限值。

记录连续波高强度聚焦超声照射下的惯性空化剂量（ICD）

图4展示了在连续波HIFU照射期间记录的ICD计算结果的代表性数据。这些数据是通过对PCD系统在照射过程中记录的发射信号进行后期处理得到的。图4a、4c和4e显示，在较低的负压峰值下，未检测到宽带发射信号；而图4b、4d和4f显示，在整个照射过程中均记录到了ICD信号。在同时接受HIFU和激光照射的含纳米颗粒凝胶中，照射期间观察到了最强的ICD信号（图4f）。

图1. 本研究中所用实验装置的示意图。 为清晰起见，图中省略了USB显微镜和光源，但用蓝色虚线框标示了观察区域。CNC - 计算机数字控制，AuNR - 金纳米棒。该图改编自 McLaughlan et al. (2017)⁶。请点击此处查看此图的放大版本。

图2. 使用被动空化检测系统在短时HIFU照射期间记录的电压信号示例，包含/不包含同步激光照射。 如使用激光，激光能量密度为2.1 mJ/cm²，负压峰值分别为 (a-c) 3.0、(d-f) 2.13 和 (g-i) 1.43 MPa。LS - 激光，NR - 纳米颗粒。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3. 在HIFU照射期间，由USB显微镜记录的0、5、10和15秒时刻的单帧图像。 激光能量密度为3.4 mJ/cm²，峰值负压为2.53 MPa。序列（a）为施加激光照射且在不含纳米颗粒的模拟组织中，（b）为未施加激光照射但在含纳米颗粒的模拟组织中，（c）为同时施加激光照射且在含纳米颗粒的模拟组织中。请点击此处查看此图的放大版本。

图 4. 在有（a, b, e, f）和无（c, d）激光照射条件下暴露期间记录的计算惯性空化剂量（ICD）。 峰值负压分别为 (a, c, e) 0.91 或 (b, d, f) 2.53 MPa。在 (a, b) 中使用的仿组织体不含任何纳米颗粒。请点击此处查看此图的放大版本。

讨论

本方案分为四个独立部分，描述了从制备模拟组织的仿体到在其中进行连续波（CW）辐照以产生热致变性的全过程。仿体的这种变性模拟了软组织在经受高强度聚焦超声（HIFU）时所发生的热致凝固性坏死¹。在制备过程中，需确保过硫酸铵（APS）与四甲基乙二胺（TEMED）的比例适当，以避免催化反应过快。由于该过程为放热反应，反应速率越快，达到的温度就越高²⁵，从而可能导致牛血清白蛋白（BSA）蛋白在辐照前即发生变性。本方案中设定的APS与TEMED比例应可避免此情况的发生，但也可将模具置于冰水中进行凝胶聚合，以进一步降低该风险。

由于本方案的重点是通过结合纳米颗粒、激光照射和高强度聚焦超声（HIFU）暴露来诱导空化成核，因此在制备凝胶模体时的一个关键步骤是在真空条件下脱气至少30分钟。一旦模体暴露于HIFU（特别是连续波暴露）下，即使未形成热损伤病灶，也必须在凝胶模体中选择新的位置进行靶向，以避免已有空化核的影响。当使用计算机控制的平移系统移动模体时，必须确保HIFU焦点的深度（即对齐区域）保持一致。这可保证在每组特定暴露参数下，HIFU声压和激光能量密度水平均保持均匀。在本方案中，完成模体支架的初始定位后，仅沿垂直轴方向进行平移。

温度敏感型组织模拟凝胶因其能够提供热损伤形成的可视化机制，已被高强度聚焦超声（HIFU）研究领域广泛使用²⁵。本研究首次将此类凝胶与纳米颗粒结合，并通过可控空化效应，证实了其对损伤形成具有增强作用。然而，尽管这类凝胶在温度响应方面被归类为组织模拟材料，但其光学和声学衰减特性并不具备组织模拟性。由于需要在凝胶中可视化观察损伤的形成过程，因此这些仿体几乎透明，略带淡黄色。由于需调整激光能量密度以补偿这一特性，导致照射到目标区域的激光为平行光束，而非在正常组织中常见的散射光。因此，为了实现临床转化，需要采用多个照明光源，以确保表面获得足够的能量密度。目前，本研究遵循皮肤暴露条件下激光安全使用指南²²。这将限制深层组织所能达到的最大激光能量密度；因此，该技术最初适用于治疗浅表性癌症，例如乳腺癌或头颈部癌症。此外，针对此类癌症表面受体的等离子体纳米颗粒可提高治疗的选择性。然而，尽管这是当前高度活跃的研究领域，目前尚无此类颗粒被批准用于临床。

含有纳米颗粒的仿组织体的声衰减测量值为 0.7±0.2 dB/cm⁶，与软组织的 3–4 dB/cm 相比显著更低。因此，这些凝胶在高强度聚焦超声（HIFU）照射下的产热将低于软组织中的情况。已有研究表明，在凝胶中添加玻璃微珠可使衰减水平接近软组织²⁵。然而，在本应用中，该方法不可行，因为这些微珠即使在无纳米颗粒存在时也会成为空化活性的成核位点，从而歪曲空化阈值。与 Choi et al. (2013)²⁵ 研究结果相比，其在 14–23 MPa 的峰值压力范围内产生了热损伤（未说明是正向还是负向峰值压力）。由于该实验在 1.1 MHz 下进行，仿组织体中的衰减低于本研究的条件。尽管如此，本研究中基于纳米颗粒成核的方法在 1.19 至 3.19 MPa 的压力范围内即可在这些仿组织体中产生热损伤，表明其效率优于现有方法。

该方法学的未来测试应在in vivo模型中进行，以整合肿瘤缩小、组织灌注、纳米颗粒的分子靶向以及相关的声学衰减参数。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
单元素HIFU换能器	Sonic Concepts	H-102
55 dB功率放大器	E&I	A300
函数发生器	Keysight Technologies	33250A
差分膜片式水听器	Precision Acoustics Ltd
TTL脉冲发生器	Quantum Composers	9524
Nd:YAG脉冲激光器	Continuum	Surelite I-10
OPO Plus	Continuum	Surelite
光纤束	Thorlabs Inc	BF20LSMA01
能量传感器	Thorlabs Inc	ES145C
纳米棒	Nanopartz	A12-40-850
宽带探测器	Sonic Concepts	Y-102
5 MHz高通滤波器	Allen Avionics
40 dB前置放大器	Spectrum GmbH	SPA.1411
14位数据采集卡	Spectrum GmbH	M4i.4420x8
去离子过滤水	MilliQ
丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液	Sigma Aldrich	A9927
1 mol/L TRIS缓冲液	Sigma Aldrich	T2694
过硫酸铵	Sigma Aldrich	A3678
牛血清白蛋白	Sigma Aldrich	A7906
TEMED	Sigma Aldrich	T9281
3D打印机	CEL-UK	Robox
三轴定位系统	Zolix
数字显微镜	Dino-lite	AM4113TL
水箱	Muji	亚克力水箱
光学元件	Thorlabs Inc	多种
光机械元件	Thorlabs Inc	多种
BNC电缆	RS
台式计算机	定制
加热磁力搅拌器	Fisher
SBench6	Spectrum GmbH		测量软件