分别测量小鼠的主动和被动温顺性

摘要

动物的温顺性包括对人类回避反应的减少（被动温顺）以及主动接近人类行为的增加（主动温顺）。本文中，我们描述了三种行为学测试（主动温顺测试、被动温顺测试和停留手上测试）的详细实验方案，用于分别测量小鼠的主动温顺性和被动温顺性。

摘要

狗和实验小鼠等驯化动物表现出高度的温顺性，这对于人类易于操控它们至关重要。温顺性包含两个行为组分：不愿回避人类（被动温顺）和主动接近人类的动机（主动温顺）。为了量化小鼠中的这两个组分，我们此前开发了用于检测主动温顺、被动温顺以及停留在人手上的意愿的行为学实验，每个实验均设计为在3分钟内完成。所获得的数据用于选择性育种，每代分析大量小鼠。主动温顺实验测量小鼠朝向人手的运动及其与人手的接触情况；被动温顺实验测量小鼠耐受人类触碰的持续时间。在停留于手部实验中，将小鼠放置于人手上，并用该手的拇指缓慢触碰，记录动物停留在手上的持续时间。本文中，我们描述了实验装置与设备，说明了操作步骤，并讨论了适当的数据分析方法。最后，我们解释了如何解读实验结果。

引言

在驯化过程中，选择性育种改变了驯养动物的特征，使其更适应与人类共同生活^1,2,3。"温顺性"是驯养动物中常见的一种行为特征。针对动物温顺性的选择性育种研究揭示了驯化过程中其表型的变化方式。在一项著名的研究中，狐狸被进行温顺性选择育种，并成功建立了一群表现出高度温顺性的狐狸种群²。这些狐狸还表现出其他表型变化，涉及形态学、繁殖、毛色以及生理特征。对小鼠——一种常用的实验动物——进行温顺性的选择性育种，有助于揭示驯化过程中多种表型变化背后的机制。

温顺性包含两个行为学组分：主动接近人类（主动温顺性）和减少对人类的回避行为（被动温顺性）⁴。在之前的一项研究中，我们建立了三种行为学测试方法，用于评估小鼠的温顺性水平：主动温顺性测试、被动温顺性测试和停留于手部测试⁵。第一种测试旨在通过测量小鼠自发接近人类的潜伏期及其与人手接触所持续的时间，来量化其主动温顺性。第二种测试旨在通过测量小鼠耐受人手触碰的时间长短，来量化其被动温顺性。停留于手部测试则用于量化小鼠对被人手轻微抚摸这一行为的回避程度。这三项评估仅需使用敞箱实验装置、一台数码相机和一把较大的镊子即可完成。整个测试过程可在3分钟内依次完成，从而实现每日大量数据的采集。

在之前的研究中，我们利用一系列近交系小鼠品系——包括10个野生品系、1个源自日本花色小鼠的品系以及6个实验室品系——对温顺行为进行了表征和比较⁵。大多数驯化品系在被动温顺性方面显著高于野生品系，但两组之间的主动温顺性并无差异。基于这些结果，我们得出结论：作为实验室品系祖先的驯化小鼠，在其育种历史中主要被选择的是被动温顺性，而非主动温顺性。

接下来，我们利用八种野生小鼠品系进行选择性育种，以建立一个遗传异质性群体⁶。我们选择在主动温顺性测试中得分较高的个体，并在连续世代中成功提高了其主动温顺性，与对照组相比差异明显。该结果表明，这些测试能够可靠地评估小鼠的温顺性。

本文中，我们介绍了利用三种行为学实验测量行为学指标的完整方法。首先，阐述实验所需的装置设置及仪器设备。接着，详细说明开展实验的逐步操作流程、通过视频采集数据的方法，以及使用我们开发的免费软件对这些数据进行分析的具体步骤。最后，展示选择性繁育小鼠群体与对照组之间比较的代表性实验结果。

方案

所有实验均按照日本遗传学研究所（NIG）的动物实验指南进行，并经NIG动物护理与使用委员会批准（批准号：26-9）。

1. 动物

1. 选择性育种
   1. 创建野生来源杂合品系（WHS）⁶ 通过杂交8个近交系小鼠（MSM、HMI、BLG2、PGN2、KJR、CHD、NJL和BFM/2）培育小鼠，同时避免近亲交配（同胞或表亲间的交配）⁷从第三代（G3）开始进行选择性育种，根据主动温顺性测试（见步骤3.1）结果，选择“接触时间”较长的小鼠（选育组，16对交配组合）进行繁殖。
   2. 生成未选择对照组（同样为16对交配组合的家庭） 通过 从G3代开始进行随机交配。在代表性实验中，使用来自WHS小鼠选育组（S1）和非选育组（C1）的小鼠，通过三项温顺性测试（见步骤3.1–3.3）展示主动和被动温顺性的表现模式。实验中每组（S1和C1）使用10只G15代小鼠。
2. 代表性 实验动物
   1. 在3周龄时将所有小鼠与其母鼠断奶，并在测试前以同性别同胞小鼠为组，饲养于装有木屑的标准尺寸塑料笼中。所有动物均置于日本国立遗传学研究所（NIG）动物设施内，维持12/12小时明暗循环（光照时间为06:00至18:00）及恒定温度（23 ± 2 °C）。
   2. 确保食物和水的供应 随意摄取在小鼠6周龄时，于光照期进行测试，以分析其在人类通常活跃的时段内与人类的互动情况。
3. 操作规程
   1. 使用套有硅胶管的大型镊子轻轻夹住小鼠尾巴，将其转移至新笼子中。在断奶时使用镊子将小鼠与其母本分离，并在实验过程中用镊子移动小鼠。在进行温顺性测试之前，任何小鼠均不应接受人为抓握处理。
   2. 在进行温顺性测试前，将小鼠转移至实验室内。
   3. 测试后应将雄性小鼠相互分开放置，以避免WHS小鼠发生雄性间攻击行为。

2. 仪器设备

1. 使用旷场实验装置（400 × 400 × 400 mm，灰白色聚氯乙烯材质）。
2. 使用夹式灯具，配备中性白光灯泡（100 lux），固定在旷场装置上方450 mm处，以照亮旷场区域（图1）。
3. 使用市售便携式数码相机，通过三脚架固定在旷场装置上方850 mm处，记录所有行为（图1）。
4. 在进行被动温顺性测试时，需在乳胶手套内佩戴布质手套，以防止被动物咬伤（此反应较为罕见）。
5. 使用秒表测量测试持续时间。

3. 测试

注意：前两项测试（主动温顺性和被动温顺性）每项持续1分钟，停留手部测试则少于1分钟。这三项测试均在敞箱实验装置中进行，并使用数码相机记录。 所有装置在进行任何行为学研究前均应进行碘伏消毒处理。

1. 操作步骤 主动温顺性测试
   1. 打开数码相机并开始录制。
   2. 使用大号镊子轻轻夹住小鼠尾巴（参见步骤1.3.1），将其从饲养笼转移至旷场实验装置的中央。
   3. 启动秒表。
   4. 将左手放在仪器的左下角。
   5. 保持手掌向上，缓慢而稳定地移动手指，以确保小鼠将手与人连接。将全部四个手指从小指到食指依次移动的平均时间应约为0.5秒，并持续重复该运动周期。
   6. 将手缓慢移向小鼠，平均速度约为13 cm/s，至距小鼠体侧10 cm处停止。
   7. 若小鼠试图远离，保持相同距离。若小鼠靠近，手部保持原位并继续轻微活动手指。若小鼠试图沿手臂爬升，用另一只空闲的手将其移回操作区域。
   8. 1 分钟后结束测试，收回手，然后进行被动温顺性测试。
2. 操作步骤 被动温顺性测试
   1. 参照主动温顺性测试的相同步骤操作，但不再在距离小鼠身体10 cm处停止，而是用指尖缓慢触碰小鼠。
   2. 保持手指位置不变，持续接触小鼠，直到小鼠移开。当小鼠试图脱离接触时，跟随其移动，移动的平均速度约为23 cm/s，并重新开始触碰。
   3. 1 分钟后结束测试。立即重新启动秒表，开始手部停留测试。
3. 操作步骤 手部留存测试
   1. 用一对大镊子夹住小鼠尾巴将其提起，轻轻放置于左手掌上。保持手部接近旷场实验装置的底部。
   2. 用左手拇指以平均每秒0.5次的频率轻柔地抚摸小鼠，直至其离开手掌。
   3. 重复步骤 3.3.1 - 3.3.2，共 3 次。
   4. 第三次试验结束后，停止视频录制；所有温顺性测试至此全部完成。
4. 实验后处理步骤
   1. 称量小鼠体重，并计数旷场中遗留的粪便和尿液数量。
   2. 对小鼠进行个体标记 通过 耳缘打孔
   3. 用浸有0.2%碘伏消毒剂的纸巾擦拭仪器和实验人员手套。
   4. 用干燥的纸巾擦拭仪器。

4. 行为学分析

注意：视频记录使用 tanaMove 0.01 版（Windows 7）进行评分，该软件为用于行为分析的事件记录软件（图2）。该软件可免费获取（补充材料1），也可从我们的网站下载（http://www.mgrl-lab.jp/MGRL_software.html）。所有视频均由一位对实验条件设盲的研究人员进行评分。所有行为指标的持续时间均以0.1秒为单位进行测量。在评分过程中，观察者在观察到特定行为时按下键盘上对应的字母键（见步骤4.1）。

1. 视频分析按键分配
   1. 为每项行为指标分配按键。在步骤 4.3 中为自动汇总数据，为每项行为指标分配合适的按键至关重要。
      注意：本研究中使用的按键分配如图3所示。
2. 视频分析
   1. 对每段视频记录分别进行 3 次不同行为指标的分析（图3B）。自我理毛行为不进行评分。请确保打开计算机的内置扬声器，以便在视频中听到计时器声音。
   2. 启动 tanaMove 软件。
   3. 将待分析的视频文件拖放到 tanaMove 窗口中。确认文件已加载，并检查数据文件 [.csv]框中输出的 CSV 文件路径和文件名是否正确。
   4. 点击准备按钮。这将激活一个新窗口，用于输入已分配的按键。
   5. 点击播放按钮以开始播放视频文件。点击停止按钮以暂停视频文件。
   6. 当观察到小鼠“朝向”或接近手部时（包括站立嗅闻），按下A键。在主动温顺性测试期间，当观察到小鼠“移动”但未朝向手部时，按下R键。
   7. 当在 60 秒时听到计时器声音时，按住W键至少 0.3 秒（窗口中至少三个时间间隔）。
   8. 在被动温顺性测试中，当左手进入视频画面后开始分析。当观察到小鼠朝向或接近手部时按A键，当观察到小鼠移动但未朝向手部时按R键。
   9. 当在 60 秒时听到计时器声音时，按住W键至少 0.3 秒（窗口中至少三个时间间隔）。
   10. 在“停留于手”测试中，当观察到小鼠“停留在手”上时，按下T键。
   11. 完成“停留于手”测试后，点击停止按钮以结束视频观察。
   12. 点击返回按钮，并为输出的 CSV 数据文件输入新的文件名。
   13. 点击准备按钮，激活一个新窗口以输入已分配的按键。
   14. 点击播放按钮以重新开始播放视频，并启动主动温顺性测试的观察。
   15. 在主动温顺性测试期间，当观察到小鼠“接触”人类时按下T键，包括所有主动接触行为，但不包括偶然接触（例如跳跃后落在手掌上）。
   16. 当在 60 秒时听到计时器声音时，按住W键至少 0.3 秒（窗口中至少三个时间间隔）。
   17. 在被动温顺性测试期间，当小鼠允许实验者触碰其身体时，按下T键。
   18. 当在 60 秒时听到计时器声音时，按住W键至少 0.3 秒（窗口中至少三个时间间隔）。
   19. 点击停止按钮以停止视频播放。
   20. 点击返回按钮，并为输出的 CSV 数据文件输入新的文件名。
   21. 点击准备按钮，激活一个新窗口以输入已分配的按键。
   22. 点击播放按钮以重新开始播放视频，并启动主动温顺性测试的观察。
   23. 在主动温顺性测试期间，当观察到小鼠“跳跃”时，按下J键。
   24. 当在 60 秒时听到计时器声音时，按住W键至少 0.3 秒（窗口中至少三个时间间隔），然后开始被动温顺性测试的观察。
   25. 在被动温顺性测试期间，当观察到小鼠“跳跃”时，按下J键。
   26. 当在 60 秒时听到计时器声音时，点击停止按钮以结束视频观察。
   27. 点击返回按钮，并为输出的 CSV 数据文件输入新的文件名。
3. 汇总数据
   1. 将所有原始数据文件（CSV）与补充材料2.xlsm文件（补充材料2）保存在同一文件夹中。
   2. 打开补充材料2.xlsm文件，并点击汇总按钮。
   3. 将结果另存为单独文件，用于进一步分析温顺性行为。

结果

我们先前对小鼠进行了主动温顺性的选择性育种，成功培育出表现出高度主动温顺性的小鼠⁶选择组与非选择组小鼠在第15代进行的温顺性测试的代表性结果^th 第15代（G15）如图所示 图4在主动温顺性测试中，所选组的小鼠得分更高，与人类手部接触的持续时间显著长于对照组小鼠。该接触时长被用作选择性育种的指标。两组在头部运动、运动或跳跃持续时间方面无显著差异。图 4A, 表1），但被选中的小鼠在被动温顺性测试中得分更高，与对照组小鼠相比，能显著更长时间地耐受人类接触。此外，被选中的小鼠表现出显著更短的运动和跳跃持续时间（图4B, 表1）。最后，在停留于手部测试中，被选择的小鼠停留在人手上的时间显著长于对照组小鼠。图 4C

讨论

代表性结果涵盖了主动温顺性、被动温顺性以及停留手部测试中的九项行为指标。对选择组与对照组得分的比较显示出在温顺性方面存在明显差异。这些结果表明，这三项测试可用于有效测量小鼠的温顺性。

动物的温顺程度在实证上难以量化。已有多种方法被开发用于评估鹿、小鼠和大鼠的温顺性^8,9,10。然而，这些方法并未分别量化主动温顺性和被动温顺性。在之前的一项研究中，我们建立了三种用于量化小鼠温顺性的测试方法⁵。利用主动温顺性测试的评分，我们开展了选择性育种实验，并成功培育出具有较高主动温顺性的小鼠品系⁶。除了在主动温顺性测试中更愿意接近和接触人类外，这些经过选择性育种的小鼠在被动温顺性测试中也能更长时间地耐受人类接触，尽管该测试的结果并未作为选育依据。这些结果表明，这两种测试并非完全独立，而是存在一定程度的重叠。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
旷场实验装置	O’Hara & Co. Ltd.	OF-3102	400×400×400 mm，灰白色聚氯乙烯材质
便携式数码相机	Ricoh Company, Ltd.	CX-5	该产品已停产
纯乳胶手套	AS ONE	BioLab, IKG-8002
秒表	SEIKO	SSBJ018
碘伏消毒剂	Ecolab G.K. (CLEA Japan)	CL-4123	Mikro Klene