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方法文章

哺乳动物细胞系的厌氧培养与维持

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DOI：

10.3791/58049

⸱

2018年7月21日

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, Midwestern University

本文内容

摘要

本文介绍一种可实现已建立细胞系厌氧长期培养的新方法。所测试的最长存活时间为17天。该方法适用于细胞毒性试剂的检测以及缺氧复制细胞生理学的研究。

摘要

大多数黏膜表面以及肿瘤中心和干细胞微环境是机体中无氧的区域。以往研究表明，在常氧（空气中含5% CO2）或低氧（低氧水平）条件下孵育后，再进行无氧（无游离氧）孵育，细胞存活时间有限（2–3天）。本研究开发了一种新方法，可实现无氧细胞培养（至少17天；已测试的最长时间）。该方法最关键的环节是确保系统中不引入任何氧气。这通过培养基脱气，以及使用厌氧气体混合物（H2、CO2、N2）对导管、培养皿、培养瓶和移液器进行吹扫，并在使用前使这些材料充分平衡至无氧（无氧）环境中来实现。 在获取显微照片时需格外谨慎，以确保所得图像不含伪影。在无氧条件下，细胞形态发生显著改变。所有厌氧培养的细胞均表现出两种不同的形态类型。在无氧条件下培养和维持哺乳动物细胞的能力，可应用于细胞生理学分析、多微生物相互作用研究，以及新型抗癌药物开发中的生物合成途径表征。

引言

实体瘤中的细胞、干细胞微环境中的细胞以及黏膜表面的细胞均存在于氧含量降低甚至无氧的环境中1,2,3,4. 在正常的生理状态下，氧合程度的变化范围可从缺氧延伸至无氧（完全缺乏氧气）5,6.人们意识到大气中的氧气对哺乳动物细胞的增殖具有不利影响，且 体外 早在20世纪70年代初就有报道称，细胞生长可在低氧条件下得到优化。 Richter 等7 研究表明，与大气氧浓度（20%）相比，1–3%的氧气水平（低氧）可提高细胞接种效率。在低氧培养条件下，人二倍体细胞的寿命也得以延长。8.

体内，当氧气储备耗尽时，即出现缺氧条件（例如, 在剧烈运动期间，骨骼肌中的ATP生成方式会从有氧呼吸转变为发酵（无氧呼吸），其终产物为乳酸9病理上，由于血管化不良，癌性肿瘤内部处于从缺氧到无氧的状态10通过专性厌氧菌定植的肿瘤内部区域，独立验证了有限灌注对肿瘤内部的影响。1从机制上讲，肿瘤细胞在缺氧条件下的存活被认为完全依赖于缺氧诱导因子1-α基因（HIF1A）的表达。HIF1-α），这是对缺氧的初始自发反应4,11,12. HIF1-α 在缺氧条件下由热休克蛋白诱导，后者可结合 HIF1-α 启动子并上调基因转录12这些热休克蛋白被认为有助于诱导肿瘤缺氧微环境中所观察到的各种表型。这些表型表现出细胞膜葡萄糖转运蛋白的表达增加以及糖酵解速率升高（即瓦伯格效应）。13结果是线粒体氧化磷酸化转变为乳酸发酵。

无氧存活也可利用葡萄糖以外的替代物质来支持这种存活现象14,15。研究最为深入的哺乳动物例子是鼹形鼠，其可在无氧条件下存活近20分钟，依赖果糖驱动的糖酵解发酵途径14。另一种适应机制存在于某些鱼类中（例如，鲤鱼 [Carassius sp.]，可通过以乙醇为终末副产物的糖酵解过程存活更长时间）15。在这两种情况下，发酵作用推动代谢过程，使生物体在无氧环境中得以存活。目前关于无氧存活的假说是，只要在缺氧期间HIF1-alpha被激活，线粒体呼吸便可在无氧条件下进行16。此外，据推测，利用发酵途径实现缺氧/无氧存活可增强肿瘤细胞的存活能力，因为细胞避免了可能对细胞存活有害的氧化应激17。这一假说得到了最近一项研究的支持，该研究表明在心肌细胞中，缺氧可降低肿瘤细胞所承受的氧化应激17。

迄今为止，由于无法将哺乳动物细胞在完全无氧的条件下培养超过3天，文献中普遍认为发酵途径对于无氧条件下哺乳动物细胞的存活至关重要。然而，在细菌中存在一种糖酵解之外的无氧生存替代途径。在某些细菌中，氮或硫酸盐（以及其他化合物）可在缺氧条件下作为细胞色素氧化酶系统的末端电子受体18。尽管细菌与真核生物自最后的共同祖先分化后便平行演化，但据估计，线粒体在海洋发生氧化之前已有约154.2万年为细胞提供能量的历史19。由于研究人员已证明，分离的线粒体在以亚硝酸盐作为末端电子受体的情况下，可在无氧环境中生成ATP，因此可以合理推测，细胞在无氧条件下存活的时间可能超过3天20,21,22,23。本研究中描述的方法可用于多种哺乳动物细胞系的无氧培养。

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方案

1. 准备用于多种哺乳动物细胞系厌氧培养的培养基

  1. 制备用于厌氧细胞培养的完整PS-74656培养基25.
    1. 通过将17.25 g亚硝酸盐溶解于50 mL去离子蒸馏水中制备无菌亚硝酸盐储备液（5 M；100倍），然后过滤除菌。
    2. 每50 mL低糖DMEM（含1 g/L葡萄糖、110 mg/L L-谷氨酰胺、584 mg/L丙酮酸钠和10%胎牛血清（FBS；热灭活））中加入0.5 mL亚硝酸盐储备液。
      注意：使用浓度高于10%的FBS具有毒性。值得注意的是，一种测试的癌细胞系对含亚硝酸盐的培养基耐受性较低（MDA-MB-231，乳腺癌细胞系），因此该细胞系在无亚硝酸盐条件下培养。此外，尽管PS-74656培养基支持了所有测试细胞系的生长（n = 9），某些细胞系（例如，Vero细胞在含高糖（4.5 g/L）的PS-74656 DMEM培养基中表现出更高的细胞浓度和更高的存活率25.
    3. 将20 mL培养基置于无菌的50 mL锥形离心管中。不要拧紧管盖，应保持松动。
    4. 将试管以约45°角置于真空干燥器中，对培养基进行脱气，以最大化培养基的表面积。
    5. 使用真空泵或等效设备在室温下抽真空。维持真空状态直至不再观察到气泡（24–48 小时）。
    6. 从瓶子中取出试管，立即盖紧管盖，密封试管以尽量减少空气进入培养基。
    7. 将试管放入商用厌氧室中。
    8. 松开管盖，使管内空气与厌氧室内的厌氧气体混合物至少平衡24小时。
      注意：培养基应保留在腔室中直至用完。为加快进程，使用无菌移液管吸取无氧气体混合物冲洗管道至少3次，该无氧气体混合物由H2, CO2，以及 N2.
    9. 将所有试管（10–15 分钟）置于厌氧培养箱中脱气，操作如上所述，然后密封试管并放入培养箱。使用前，用已用无氧气体冲洗至少 3 次的 1.5–2 mL 移液管或移液器吸头，以厌氧气体混合物冲洗。
    10. 在厌氧工作站内，取100 µL培养基至无菌脱气的微量离心管中，并在工作站内使用氧探针检测溶解氧含量。
      注意：使用前需根据制造商方案对氧电极进行校准。经充分脱气并达到平衡的无氧气体混合培养基的读数为0。
      警告：如果氧气读数高于0.3 ppm，请继续将培养基在厌氧箱中孵育，因为培养基需要更长时间才能达到平衡。

2. 各种哺乳动物细胞系的无氧培养

  1. 指定第-1天
    1. 将细胞在T150培养瓶中于37 °C、5% CO2条件下培养至90%汇合度，用于缺氧和常氧培养对照，以提供足够数量的细胞用于三块24孔板（80%汇合度）。
      注：本研究使用HeLa 229和Vero细胞。该方案也已在其他七种细胞系的培养与维持中经过测试并证明成功25。
    2. 通过抽吸去除培养瓶中的培养基，并用10 mL HBSS洗涤一次。
    3. 加入5 mL胰蛋白酶替代原培养基，轻轻振荡培养瓶直至细胞在显微镜下可见从塑料表面脱离。抽吸大部分胰蛋白酶后轻敲培养瓶以使贴壁细胞完全脱落，随后加入10–15 mL高糖DMEM（含4.5 g/L葡萄糖、110 mg/L L-谷氨酰胺、10%胎牛血清、50 µg/mL庆大霉素）以中和胰蛋白酶活性。
    4. 使用25 mL移液管反复吹打细胞悬液，直至所有细胞团块完全分散。
    5. 使用血细胞计数板结合台盼蓝染色排除法或相应的自动化设备对细胞进行计数并测定细胞活力。
    6. 将细胞重悬于上述高糖DMEM中，调整细胞密度至2.24 × 105 个/mL。
    7. 向24孔组织培养板的每孔加入1 mL细胞悬液（即每孔2.24 × 105 个细胞，达到80%汇合度）。为缺氧培养接种一块板，另为常氧对照培养接种一块板。
    8. 将细胞置于37 °C、常氧条件（5% CO2）下培养24小时。
      注：细胞可接种于不同孔径的培养板中。然而，若在培养瓶中进行缺氧培养，除非小心操作以彻底置换瓶内大气气体，否则存在氧气进入系统的风险。
  2. 指定第0天
    1. 经过24小时常氧培养后，将用于缺氧培养的培养板放入厌氧培养箱（商用厌氧培养箱；图1）中。
    2. 立即更换为不含抗生素、已脱气且已在厌氧培养箱中平衡24小时的PS-74656培养基。将培养板放入带有湿润毛巾的容器中，并松散封闭以保持湿度。
      注：常氧培养的培养板处理方式相同，唯一区别是所有操作均在大气条件下进行。
  3. 指定第1天
    1. 厌氧培养的第1天从细胞在商用厌氧培养箱中（内含标准厌氧气体混合物：10% H2、10% CO2 和80% N2）培养24小时后开始。
    2. 将细胞在厌氧条件下孵育不同时间段。
    3. 随时间观察厌氧培养基的颜色变化。
      注：若培养基颜色由红橙色变为洋红色，提示需更换培养基，此过程可能长达两周。若培养基由红橙色变为黄色，则提示可能存在细菌污染。
    4. 当培养基颜色由红橙色变为洋红色时，通过抽吸去除漂浮细胞。
    5. 将含有漂浮细胞的废弃培养基转移至已脱气并经厌氧气体平衡的微量离心管中，确保密封后关闭管盖，随后离心（326 × g，室温，10分钟）。立即向孔中补充1 mL新鲜脱气的PS-74656培养基。
    6. 在打开前，将含有细胞沉淀的微量离心管保持在厌氧培养箱内。抽吸弃去旧培养基，加入新鲜脱气的PS-74656培养基，总体积调整为1 mL。
    7. 将管中的细胞重新转移回24孔组织培养板中的一个孔内。

3. 通过厌氧培养细胞的显微镜观察评估表型细胞分化

  1. 在厌氧环境中，将培养皿放入一个可密封的盒子中，用厌氧气体混合物冲洗后关闭盒子。
    注意：盒内必须放置一张湿润的纸巾以提供湿度，防止培养皿干燥。用于显微镜观察时，自封袋效果最佳，因为其材质较薄。
    1. 为在显微镜下观察细胞，需将袋子完全密封后从厌氧环境中取出。
    2. 小心地将塑料袋拉伸覆盖在培养皿上，使用带有相机附件的倒置相差显微镜观察细胞，并在不同放大倍数下拍摄显微图像。
    3. 将装有培养皿的密封袋放回厌氧环境，继续按照步骤 2.3.3 所述进行培养。
    4. 若需单独分析处于悬浮状态的游走型细胞，请遵循步骤 2.3.5 中所述的操作流程。
      注意：这些细胞随后可用于有氧条件下的检测，也可重新放回厌氧环境中，用于对该特定细胞群体的实验分析。

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结果

本方案的优势在于其能够支持多种细胞系的长期存活与生长，并认识到细胞形态发生了显著的改变与分化25。本研究最关键的环节是在严格厌氧条件下进行细胞的转移与维持。这需要配备一个专为优化本方案而设计的厌氧工作站（图1），并确保用于显微镜观察或其他检测而取出的细胞始终处于密闭环境中。迄今为止，在检测的九种细胞系中，永生化癌细胞系在无氧条件下的存活时间可达15–17天，转化细胞系最长也可达17天。当细胞转入无氧环境后，活细胞比例至少下降10%，最多可达90%，随后趋于稳定。所有细胞系均恢复为两种表型共存的状态（贴壁型与游离型），其中悬浮状态的细胞比例随时间逐渐增加。即使经过数周的长期培养，仍存在部分贴壁细胞，但大多数细胞呈现为圆形的游离形态（图2）。如已有报道所述，这些游离细胞具有活性，并能继续完成细胞周期。需要注意的是，可能需要调整的变量包括葡萄糖水平和亚硝酸盐浓度。尽管如此，在测试的60余种不同培养基配方中，PS-...

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讨论

该方法首次实现了哺乳动物细胞在无氧条件下长期培养。根据目前的观察结果，这种无氧生长能力 通过 一种非发酵途径似乎在哺乳动物细胞系中具有普遍性28，其中厌氧生长导致表型分化。该现象在所有测试的细胞系中均被观察到。在厌氧培养条件下，越来越多的细胞变为圆形，形成类似悬浮的细胞群体，并能够增殖。另一种细胞类型则仍附着于基质，但其细胞形态恢复为纺锤形（树突状）。这些发现揭示了在无氧组织培养分析与观察中的一个常见错误。通常认为，哺乳动物细胞在常氧条件下（5% CO₂）培养时2细胞变圆并脱落通常意味着其正在死亡。然而，在无氧条件下培养的细胞中，情况似乎恰恰相反：那些变圆并脱落的细胞仅是形态上存在差异的细胞亚群。

缺氧培养条件的优化取决于细胞系。培养基PS-74656总体上支持所有细胞系在常氧和缺氧条件下的生长，但乳腺癌细胞系MDA-MB-231除外，该细胞系更倾向于在无亚硝酸盐的条件下生长。一个令人鼓舞的观察结果是，即使每孔细胞死亡率达到98%，剩余存活的细胞仍能增殖，最终形成高度适应的细胞群体。关键操作在...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢中西部大学研究与资助项目办公室提供的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Whitney A35 厌氧培养箱Don Whitley Scientific Microbiology International可拆卸前板的设计使得将仪器放入培养箱内部变得简便，无需担心仪器无法通过传递舱。
CO2 培养箱Fisher Scientific3531
组织培养超净台LabconcoDO55735
移液器辅助器Drummond4-000-100
无菌移液管Santa Cruzsc-358867
50 cc 无菌锥形离心管DOT451-PG
真空罐Nalgene 111410862889BTA-Mall 5311-0250
DMEM 高糖（4.5 g/L）CellGro10-017-CM
DMEM 低糖（1 g/L）CellGro10-014-CV
FBSVWR1500-500
HBSSVWR20-021-CV
胰蛋白酶VWR25-052-CI
庆大霉素Gibco15750-060
无菌移液管CellTreat229210B, 229205B
组织培养瓶（T75 或 T150）Santa Cruzsc-200263, sc-200264
24 孔组织培养处理板DOT667124
Glad 密封三明治袋ZiplocCostco
倒置相差显微镜（配备 10、20、40 倍物镜及相机接口）Nikon EclipseTS100
台盼蓝InvitrogenT10282
血细胞计数板InvitrogenC10283
Countess 自动细胞计数仪Life TechnologiesAMQAF1000
Rainin 多通道移液器Mettler ToledoRainin Classic Pipette PR-100
多通道移液器吸头Santa Cruz Biotechnologysc-213233 & sc-201717 
试管架（适用于 50 cc 管）The Lab DepotHS29050A
亚硝酸钠Sigmahttps://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigald/237213?lang=en®ion=US
带盖透明收纳盒Rosti MepalRubber maid
纸巾实验室自制
细胞刮刀CellTreat229310
PBS实验室自制
70% 乙醇Fisher Scientific64-17-5
无菌微量离心管Santa Cruzsc-200273
带支架的生物危害废物袋（桌面型）Heathrow ScientificHS10320
腈类手套VWR89428
氧电极eDAQEPO354
pH 计Jenway3510
pH 试纸 / pHydrionSigma AldichZ111813

参考文献

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