从小鼠骨髓中鉴定与分离寡能性及谱系定向的髓系祖细胞

摘要

我们展示了如何利用磁珠分选与荧光激活细胞分选技术（MACS 和 FACS）相结合的方法，从小鼠骨髓中鉴定并分离出 6 个髓系祖细胞亚群。该方案可用于 体外 培养实验（甲基纤维素培养或液体培养） 体内 过继转移实验，以及RNA/蛋白质分析。

摘要

能够产生中性粒细胞、单核细胞和树突状细胞（DCs）的髓系祖细胞可在小鼠骨髓中被识别并分离，用于血液学和免疫学分析。例如，对髓系祖细胞群体的细胞与分子特性的研究可揭示白血病转化的潜在机制，或阐明免疫系统如何响应病原体暴露。以往报道的用于识别髓系祖细胞的流式细胞术策略已在多个领域推动了重要进展，但其所鉴定的细胞组分具有高度异质性。最常用的设门策略所定义的骨髓细胞组分虽富集了目标细胞群体，但仍包含大量"污染性"祖细胞。我们近期的研究已很大程度上解析了这种异质性，本文所呈现的方案可从先前定义的两个骨髓组分中分离出6个寡能性和谱系定向的髓系祖细胞亚群。该方案包括三个阶段：1）骨髓细胞的分离；2）通过磁珠激活细胞分选技术（MACS）对造血祖细胞进行富集（即通过MACS去除谱系阳性细胞）；3）利用流式细胞术鉴定髓系祖细胞亚群（如需要，可进一步进行荧光激活细胞分选，FACS）。该方法可用于多种体外（in vitro）和体内（in vivo）应用中的祖细胞定量与分离，并已为中性粒细胞、单核细胞及树突状细胞分化相关通路与机制的研究提供了新的见解。

引言

单核细胞、中性粒细胞和树突状细胞（DCs）是来源于造血祖细胞的髓系细胞，主要在骨髓中通过一种称为髓细胞生成（myelopoiesis）的过程产生。共同髓系祖细胞（CMPs）具有产生髓系细胞以及巨核细胞和红细胞的潜能，但不能产生淋巴细胞。粒细胞-单核细胞祖细胞（GMPs）由CMPs衍生而来，可生成粒细胞和单核细胞，但已失去生成巨核细胞和红细胞的潜能。单核细胞以及经典型和浆细胞样树突状细胞（cDCs/pDCs）也被认为起源于一种称为单核细胞-树突状细胞祖细胞（MDPs）的共同祖细胞，而MDPs由CMPs产生。谱系潜能的逐步受限最终形成谱系定向的祖细胞：粒细胞祖细胞、单核细胞祖细胞和树突状细胞祖细胞（图1）。

Weissman 及其同事报道，小鼠骨髓中 CMPs 存在于 Lin^- c-Kit⁺ Sca-1^- (LKS^-) CD34⁺ FcγR^lo 细胞群中，而 GMPs 则位于 LKS^- CD34⁺ FcγR^hi 细胞群中¹。然而，这些“CMP”和“GMP”细胞群具有高度异质性。例如，“GMP”细胞群还包含已定向分化的粒细胞前体细胞和单核细胞前体细胞^1,2。MDPs 被独立报道为表达 CX3CR1⁺ Flt3⁺ CD115⁺ 的前体细胞，同时亦表达 CD34 和 FcγR^3,4。MDPs 可分化为能产生 cDC 和 pDC 的共同树突状细胞前体（CDPs），研究表明 CDPs 表达较低水平的 c-Kit（CD117），且不属于 LKS^- 细胞群⁵。

过去人们认为单核细胞通过单一途径产生（CMP-GMP-MDP-单核细胞）。与此模型一致，由粒细胞-单核细胞前体（GMPs）产生的单核细胞定向前体细胞（称为单核细胞前体，MPs）² 和由MDPs产生的前体细胞（称为共同单核细胞前体，cMoPs）⁶，基于其共有的表面标志物表达，似乎属于同一类细胞。然而，我们最近的研究表明，单核细胞可分别由GMPs和MDPs独立产生，并通过单细胞RNA测序能够区分MPs与cMoPs⁷。

我们最近改进了Weissman提出的“CMP”和“GMP”分选策略，用于鉴定C57BL/6J小鼠骨髓中的6个亚组分，这些组分包含不同类型的寡能性及谱系定向的髓系祖细胞亚群。我们首次报道，通过Ly6C和CD115染色可从“GMP”组分（LKS^- CD34⁺ FcγR^hi 门控；图1）中分离出寡能性的GMPs，以及粒细胞祖细胞（GPs）和单核细胞祖细胞（包括MPs和cMoPs，目前尚无法将二者分离）²。随后我们证明，MDPs主要存在于“CMP”组分（LKS^- CD34⁺ FcγR^lo 门控）中，该组分还包含Flt3⁺ CD115^lo 和 Flt3^- 亚群⁷（图1）。在过继性移植实验中，CMP-Flt3⁺ CD115^lo 组分可生成GMPs和MDPs。而CMP-Flt3^- 亚群所含的祖细胞似乎处于CMP-Flt3⁺ CD115^lo 细胞与GMPs之间的中间阶段。与MDPs不同的是，CMP-Flt3⁺ CD115^lo 和 CMP-Flt3^- 组分均具有生成巨核细胞和红细胞的潜能。

然而需要注意的是，目前尚不清楚“CMP”组分是否包含真正具有寡能性潜能的前体细胞（例如，CMP-Flt3⁺ CD115^lo 组分中具有中性粒细胞、单核细胞、树突状细胞、巨核细胞和红细胞潜能的单个细胞），还是仅由具有更局限谱系潜能的前体细胞混合而成。集落形成实验（甲基纤维素培养）在“CMP”、CMP-Flt3⁺ CD115^lo 和 CMP-Flt3^- 组分中均检测到具有粒细胞（中性粒细胞）、红细胞、单核细胞和巨核细胞潜能的细胞（GEMM细胞）^1,7，但该方法无法评估树突状细胞潜能。相比之下，集落形成实验已证实“GMP”组分中存在寡能性的GMPs（具有中性粒细胞和单核细胞潜能的前体细胞）^1,2，这一发现也得到了近期单细胞转录组分析的支持⁸。然而，目前尚不清楚这些寡能性GMPs是否也能产生其他类型的粒细胞（嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和肥大细胞）。

基于这些研究，我们现在展示了如何利用7种表面标志物（c-Kit、Sca-1、CD34、FcγR、Flt3、Ly6C和CD115）来鉴定并分离这6种具有寡能性及谱系定向的髓系前体细胞亚群。本文所述方案可应用于 体外 培养实验（甲基纤维素培养或液体培养） 体内 小鼠的过继转移实验，以及分子分析（批量和单细胞RNA测序、蛋白质印迹） 等等。).

该方案包括三个阶段：1）制备骨髓细胞的单细胞悬液，2）通过磁珠激活细胞分选法富集造血祖细胞，3）利用流式细胞术（根据需要选择分析仪或分选仪）鉴定并分离祖细胞亚群。第一步是从安乐死小鼠的股骨和胫骨中分离骨 marrow 细胞，该步骤与其他已有描述的方案类似。⁹接下来，使用针对红细胞、中性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞表面标志物的抗体混合物，对样本进行干细胞和祖细胞的富集。 等等， 以耗竭分化细胞。此步骤并非强制要求，但强烈建议执行，以优化祖细胞亚群的检测效果，并减少用于祖细胞鉴定的抗体用量以及流式细胞术所需时间。以下谱系耗竭方案采用磁珠激活细胞分选（MACS）技术，使用小鼠谱系细胞耗竭试剂盒（包含针对CD5、CD45R（B220）、CD11b、Gr-1（Ly6G/C）、7-4和Ter-119的生物素标记抗体，以及抗生物素微珠）和自动化磁性分离装置。最后一步是通过流式细胞术对祖细胞亚群进行鉴定（如需要，可进行分选）。下述抗体组合方案（另见 表1设计用于配备4种激光器（405 nm、488 nm、561 nm、640 nm）的流式细胞仪（分析型或分选型）。

图1：中性粒细胞、单核细胞和树突状细胞的祖细胞及其分化途径。 图示为近期修订的髓系造血模型⁷，并叠加了Weissman提出的“CMPs”（蓝色）和“GMPs”（绿色）分选门控¹。本图改编自Yáñez et al. 2017⁷。请点击此处查看此图的放大版本。

方案

本文所述所有方法均经西达斯-西奈医学中心机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。

1. 小鼠骨髓的分离及单细胞悬液的制备

1. 根据机构指南对小鼠实施安乐死。
2. 将安乐死的小鼠仰卧放置，并用70%乙醇（EtOH）喷洒。使用锋利的尖头剪刀在每侧后肢踝关节水平处做一个3–5 mm的小切口，将皮肤向上朝向身体方向撕下，以去除腿部皮肤，暴露肌肉和骨骼。
3. 去除肌肉（股四头肌、腘绳肌， 等等。用剪刀沿骨骼方向修剪，从骨骼上分离组织，注意不要损伤骨骼。
4. 将股骨从髋关节处脱臼，切除结缔组织和肌肉以分离下肢，注意避免切割到骨骼。
5. 通过将踝关节从胫骨脱位来去除足部，将骨骼放入含有无菌PBS或培养基的离心管中，并置于冰上运送到组织培养室。
   注意：对于某些其他应用（例如， 从总骨髓细胞中分离巨噬细胞时，可将骨骼暂时置于冰上；但在分离祖细胞时，应尽快操作，以避免重要表面标志物（尤其是CD115）的下调。
6. 在生物安全柜中，用纸巾擦拭骨骼以去除残留的软组织。
   注意：如果细胞培养需要无菌样品，则应在生物安全柜中进行该实验方案。 体内 FACS分选后的检测。如果不需要无菌细胞，整个过程可在实验台面上进行。
7. 将骨骼短暂浸入70% EtOH中进行消毒，随后浸入无菌PBS中洗涤。
8. 通过膝关节处切断，将股骨与胫骨和腓骨分离，并弃去腓骨。
9. 用锋利的剪刀剪去骨骼的两端。
10. 用预冷的无菌 PBS 按如下方法收集骨髓，直至骨骼呈白色：
    1. 用镊子夹住每块骨骼，将连接有含冷灭菌 PBS 的 10 mL 注射器的 26G 针头从骨骼一端插入骨干部。
    2. 将骨骼置于50 mL离心管上方，用2 - 5 mL PBS冲洗骨骼以收集骨髓。
    3. 从小鼠的4根骨骼（2根股骨和2根胫骨）中收集骨髓。
11. 用1 mL移液器轻轻吹打，使骨髓组织分散，形成细胞悬液。
12. 通过30 μm尼龙滤网过滤骨髓悬液，以去除骨组织碎片和细胞团块，从而获得单细胞悬液。
13. 以 280 × g 离心单细胞悬液 5 分钟，弃上清后将细胞沉淀重悬于无菌染色缓冲液（PBS + 0.5% FBS + 2 mM EDTA）中，每只小鼠使用 5 mL 染色缓冲液例如， 来自2只小鼠股骨和胫骨的细胞，每份10 mL。
14. 取10 μL样品，与10 μL台盼蓝混合，将10 μL经台盼蓝标记的样品加载至血细胞计数板。使用光学显微镜进行细胞计数。
    注意：如果细胞浓度过高而不利于准确计数，可在加入台盼蓝之前对样品进行稀释。

2. 通过磁激活细胞分选（MACS）富集前体细胞

1. 将全部单细胞悬液（或为获得所需产量而需要的足够数量的细胞）在 4°C 条件下以 280 × g 离心 5 分钟，并按每 10⁷ 个细胞加入 40 μL 染色缓冲液（PBS + 0.5% FBS + 2 mM EDTA）重悬细胞沉淀。
   注意：也可使用谱系耗竭试剂盒厂商提供的 MACS 缓冲液（见材料表）作为染色缓冲液的替代。
2. 根据谱系耗竭试剂盒附带的说明书进行谱系耗竭操作。以下步骤适用于材料表中列出的试剂盒。若使用其他试剂盒，请遵循其厂商说明书操作，然后继续执行步骤 2.3。
   1. 按每 10⁷ 个细胞加入 10 μL 生物素标记抗体混合液，用移液器吹打混匀，在 4 °C 下孵育 10 分钟。
   2. 按每 10⁷ 个细胞加入 30 μL 染色缓冲液/MACS 缓冲液，混匀。
   3. 按每 10⁷ 个细胞加入 20 μL 抗生物素磁珠，充分混匀后在 4 °C 下继续孵育 15 分钟。
      注意： 加入磁珠前需涡旋振荡，以确保磁珠完全分散。
   4. 按每 10⁷ 个细胞加入 1 mL 染色缓冲液/MACS 缓冲液，以 280 × g 离心 5 分钟，然后将细胞沉淀重悬于最多 10⁸ 个细胞对应的 500 μL 染色缓冲液/MACS 缓冲液中。若细胞数量超过 10⁸ 个，应按比例增加染色缓冲液/MACS 缓冲液的体积。
   5. 根据厂商说明书准备自动磁性分离装置。
   6. 将含有标记细胞的离心管放入分离装置中，选择阴性筛选程序。
   7. 收集阴性组分，其中含有富集的谱系阴性（Lin^-）前体细胞；弃去阳性组分，其中含有被磁性标记的谱系阳性细胞。
3. 将 Lin^- 细胞以 280 × g 离心 5 分钟，并按每只小鼠加入 2 mL 染色缓冲液/MACS 缓冲液重悬细胞沉淀（例如，若骨髓来自 2 只小鼠，则加入 4 mL）。
   注意：由于红细胞已被耗竭，此时细胞沉淀应呈白色而非红色。
4. 取 10 μL Lin^- 细胞悬液，与 10 μL 台盼蓝混合，取 10 μL 混合后的台盼蓝标记样品加载至血细胞计数板。使用光学显微镜进行细胞计数。
   注意：若细胞浓度过高导致计数不可靠，应在加入台盼蓝前对样品进行稀释。

3. 通过荧光激活细胞分选（FACS）鉴定和分离髓系祖细胞

1. 标记9个微量离心管（1.5 或 2 mL），分别用于：1）未染色细胞，2–8）分别用荧光素偶联的抗FcγR（CD16/32）、c-Kit、Sca-1、CD34、Flt3（CD135）、Ly6C和CD115抗体单染的细胞，用于电压调节和颜色补偿，以及9）待用全部7种抗体染色的样本细胞，用于前体细胞鉴定与分选。
2. 将100,000个细胞分别加入各对照管（1-8号管），其余所有细胞（或根据需要减少数量）加入样品管（9号管）。
   注意：如果样本体积大于1.5–2 mL，可能需要将样本细胞分装至15 mL离心管中，离心后重悬沉淀（见下文步骤3.3），然后将细胞转移至微量离心管中进行后续染色步骤。
3. 以 1,500 离心细胞 x g 离心 5 分钟，将对照管沉淀重悬于 100 μL 染色缓冲液（PBS + 0.5% FBS + 2 mM EDTA）中，每 5 × 10⁶ 样本管沉淀也重悬于 100 μL 染色缓冲液中⁶ 细胞（例如， 200 μL，用于1 × 10⁷ 细胞。
4. 向FcγR单染管和样品管中加入2 μg/mL抗-CD16/CD32-APC-Cy7。轻轻涡旋混匀，于4 °C孵育10分钟。
   注意：在加入其他抗体之前，必须先用 FcγR（CD16/32）抗体对样本细胞进行染色，以防止因非特异性 Fc 介导的抗体结合而导致的竞争。切勿使用 FcγR 封闭试剂孵育细胞。
5. 将其他抗体分别加入相应的单染管（每管1种抗体）和样本管（共6种抗体）：10 μg/mL c-Kit-Pacific Blue、2 μg/mL Sca-1-PE-Cy7、25 μg/mL CD34-FITC、10 μg/mL Flt3-APC、2 μg/mL Ly6C-PerCP-Cy5.5 和 4 μg/mL CD115-PE。轻轻涡旋混匀，4 °C 避光孵育15分钟。
6. 向对照管中加入 900 μL 染色缓冲液，每 10 个样品加入 1 mL 染色缓冲液⁷ 将细胞加入样本管中。在1,500 × g离心5分钟，弃上清后用染色缓冲液重悬细胞沉淀：每个对照管加200 μL，每个25 × 10⁶细胞管加500 μL⁶ 样本管中的细胞。将重悬的细胞转移至5 mL流式管中。
   注意：如果样品体积大于1.5–2 mL，可能需要将细胞转移至15 mL离心管中进行离心。
7. 根据制造商的说明准备流式细胞仪（分析仪或分选仪）。
8. 运行未染色和单染对照细胞样本，通过流式细胞仪设置电压和荧光补偿。
9. 运行待测细胞样本，按照下文所述并总结如下，对前体细胞亚群进行设门分析 图2，如需要，可进行FACS分选以分离相关的前体细胞亚群。
   注意：通常需要获取约 200,000 个细胞，以确保每个前体细胞门中至少获得 1,000 个事件。
   1. 创建所有细胞的点图，横轴显示FSC-A，纵轴显示SSC-A，并设门以排除碎片和死细胞 => "活体" 细胞
   2. 创建点图 "活体" 细胞，显示FSC-H（x轴）与FSC-W（y轴），设门以排除双联体=> 活细胞/单细胞（FSC）门控
   3. 创建活细胞/单细胞（FSC）的点图，横轴显示SSC-H，纵轴显示SSC-W，并设门排除双联体细胞> 活细胞/单细胞（FSC）/单细胞（SSC）门控
   4. 创建活细胞/单细胞（FSC）/单细胞（SSC）的点图，显示 Sca-1（x 轴）和 c-Kit（y 轴），并设门圈选 c-Kit⁺ Sca-1^- 细胞 => LKS^- 细胞
   5. 创建LKS的点状图^- 细胞，显示 CD34（x 轴）和 FcγR（y 轴），设门以选择 CD34⁺ FcγR^lo 细胞 => "CMPs"，以及 CD34⁺ FcγR^你好 细胞 => "GMPs".
      注意：必须尽可能精确地圈定“CMPs”和“GMPs”。使用伪彩色密度图或等高线图有助于准确圈门。
   6. 创建点图 "CMPs"，显示 CD115（x 轴）和 Flt3（y 轴），并设门以选择：
      Flt3⁺ CD115^lo 细胞 => CMP-Flt3⁺ CD115^lo 细胞
      Flt3^- CD115^lo 细胞 => CMP-Flt3^- 细胞
      Flt3⁺ CD115^你好 细胞 => MDPs
   7. 创建点图 "GMPs"，显示 Ly6C（x 轴）和 FcγR（y 轴），并设门以选择 Ly6C^-细胞 => "GMP-Ly6C^- 细胞"，以及 Ly6C⁺ 细胞 => "GMP-Ly6C⁺ 细胞".
   8. 创建点状图 "GMP-Ly6C^- 细胞"，显示 CD115（x 轴）和 Flt3（y 轴），并设门以选择：
      Flt3^- CD115^lo 细胞 => GMPs
   9. 创建点图 "GMP-Ly6C⁺ 细胞"，显示 CD115（x 轴）和 Flt3（y 轴），并设门以选择：
      Flt3^- CD115^lo 细胞 => GPs,
      Flt3^- CD115^你好 细胞 => MPs+cMoPs

结果

采用上述方案，可从一只C57BL/6J小鼠（6至8周龄，雄性或雌性）的双侧股骨和胫骨（共两条腿）中获得约1亿个细胞（包括红细胞，或约5千万个有核细胞）。通过MACS法去除Lin⁺细胞，每只小鼠可分离得到100万至200万个Lin^-细胞。

6 种髓系前体细胞亚群各自约占 Lin^- 细胞的 1%–4%。谱系耗竭法在去除分化细胞并富集前体细胞方面效率较高，但 Lin^- 细胞群中除 c-Kit⁺ 前体细胞外，还含有大量 c-Kit^- 细胞（图 3A）。经 FACS 分选后获得的前体细胞产量可能因分选仪设置不同（例如，最大产量模式与最佳纯度模式）而有所差异，但通常每种亚群可获得 10,000–40,000 个细胞（...

讨论

韦斯曼小鼠髓系祖细胞鉴定的设门策略¹ 近20年来一直是免疫学家和血液学家的金标准，但现在显然 "CMP" 和 "GMP" 细胞群具有高度异质性，需要更精确的设门策略。本文所述方案可实现对C57BL/6J小鼠中具有寡能分化潜能及谱系定向的亚群进行鉴定，从而更精确地定量特定髓系前体细胞，描绘髓系生成途径，并探究髓系分化特定阶段所涉及的分子机制。如需进行分子分析，还可对这些前体细胞亚群进行分选。 体外 和 体内 分化评估 等等。

本方案使用年轻（6至8周龄）的C57BL/6J小鼠开发，适用于雄性和雌性小鼠。我们尚未对老年小鼠中的前体细胞亚群进行表征。我们不认为标志物会随年龄发生变化，但各亚群的相对比例可能有所不同。我们尚未在其他小鼠品系中评估前体细胞亚群。

我们改进的设门策略的首次应用是揭示转录因子干扰素调节因子8（IRF8）调控髓系细胞命运选择的机制²...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
小鼠：野生型 C57BL/6J (CD45.2)	杰克逊实验室	货号#JAX:000664
小鼠谱系细胞耗竭试剂盒	Miltenyi Biotec	货号#130-090-858
大鼠抗小鼠 CD34（克隆 RAM34）FITC	BD 生物科学	货号#553733
大鼠抗小鼠 CD16/CD32（FcγR；克隆93）APC-Cy7	BioLegend	货号#101327
大鼠抗小鼠 Ly6A/E（Sca-1；克隆 108113）PE-Cy7	BioLegend	货号#108114
大鼠抗小鼠 CD117（c-Kit；克隆 2B8）Pacific Blue	BioLegend	货号#105820
大鼠抗小鼠 Ly6C（克隆 HK1.4）PerCP-Cy5.5	BioLegend	货号#128012
大鼠抗小鼠 CD115（克隆 AFS98）PE	BioLegend	货号#135506
大鼠抗小鼠 CD135（Flt3；克隆 A2F10.1）APC	BD 生物科学	货号#560718
CountBright 绝对计数微球	赛默飞世尔科技	货号 C36950
AutoMACS 分离仪	Miltenyi Biotec	N/A	使用 "耗竭" 程序
BD LSRFortessa	BD 生物科学	N/A	5 激光器，15 种颜色
BD FACS Aria III 细胞分选仪	BD 生物科学	N/A	5 个激光器，13 种颜色
FlowJo	FlowJo, LLC	https://www.flowjo.com	用于对 .fcs 文件进行进一步分析