使用眼部钻头建立角膜上皮擦伤作为角膜伤口愈合模型

摘要

本方案描述了一种在小鼠眼部表面造成擦伤并随后观察其伤口愈合过程的方法。该方案利用眼部钻头，在麻醉小鼠状态下部分去除眼表上皮。

摘要

小鼠角膜是研究伤口愈合的优良模型。角膜是眼睛的最外层，因此是抵御损伤的第一道防线。事实上，临床上最常见的眼部损伤是角膜擦伤。在此，我们利用眼科钻头在麻醉小鼠体内诱导角膜上皮擦伤，从而去除角膜上皮in vivo。该方法可实现靶向且可重复的上皮破坏，同时保持其他区域完整。此外，我们描述了使用荧光素染色对受损上皮进行可视化，并提供了观察受损角膜的具体建议。随后，我们在擦伤后0、18和72小时追踪伤口愈合的时间进程，直至伤口完成再上皮化。角膜损伤的上皮擦伤模型非常适合研究角膜层上皮细胞的增殖、迁移及再上皮化过程。然而，该方法并不适用于研究伤口愈合过程中基质层的激活，因为眼科钻头不会穿透至基质细胞层。该方法也适用于临床应用，例如药物疗效的临床前测试。

引言

许多器官的上皮层都会受到损伤，但它们也具备通过伤口愈合来补偿组织缺损的能力。角膜是研究伤口愈合的极佳模型。它构成眼睛的外表面，为敏感的眼部结构提供保护层，因此角膜可作为抵御病原体和防止水分流失的物理屏障。角膜由三层结构组成：上皮层、基质层和内皮层。角膜上皮层构成角膜的最外层。上皮细胞通过紧密连接彼此牢固黏附，从而维持角膜的屏障功能^1,2,3。一层无细胞的角膜基底膜，即Bowman膜，将上皮层与含有大量角质细胞的基质层分隔开来。在基质层下方，内皮细胞负责向上层组织输送营养物质、水分和氧气。

角膜擦伤在临床上非常常见⁴。角膜损伤类型多样，但大多由微小颗粒（如灰尘或沙粒）、划伤或其他异物引起。本文所述方案旨在复制一种具有临床相关性的角膜上皮擦伤类型，为临床医生和角膜研究人员提供一种可控且具有重要意义的方法，可用于其自身研究中。我们通过使用钝化的 Algerbrush II 眼科钻头对小鼠角膜组织进行擦伤，实施了体内损伤修复检测。在此过程中，我们仅针对中央角膜上皮造成擦伤，而保留器官其他部分不受损伤。因此，该方案非常适合用于研究体内角膜上皮细胞动态或再上皮化过程中的基底膜变化、细胞迁移、增殖和分化

方案

所有实验均获得国家动物实验委员会的批准。

1. 准备工作

1. 除另有说明外，所有溶液均需提前配制并保持在室温下。按照废弃物处理规定处置使用过的材料和溶液。
2. 使用4至12周龄的NMRI或ICR远交系小鼠，性别不限。若使用C57BL/6品系，请遵循步骤1.3.2中的氯胺酮-美托咪定配制方法；其余步骤请遵循1.3.3–1.3.5中所述说明。
3. 在手术开始前及时新鲜配制兽用药品。卡洛芬将在后续使用，因此目前无需配制。
   1. 为制备用于麻醉的氯胺酮-美托咪定溶液，将0.375 mL（储存浓度50 mg/mL）氯胺酮（Ketaminol Vet）与0.25 mL（储存浓度1 mg/mL）美托咪定（Cepetor Vet）混合，并加入1.25 mL无菌0.9% NaCl。按每20 g小鼠体重给予0.15 mL（氯胺酮7.5 mg/kg，美托咪定1 mg/kg）。
   2. 为C57BL/6小鼠制备更稀释的氯胺酮-美托咪定麻醉溶液时，将0.375 mL（储存浓度50 mg/mL）氯胺酮与0.25 mL（储存浓度1 mg/mL）美托咪定混合，并加入2.5 mL无菌0.9% NaCl。按每20 g小鼠体重给予0.15 mL（氯胺酮3.75 mg/kg，美托咪定0.5 mg/kg）。
      注：此步骤仅适用于成年C57BL/6小鼠。
   3. 为制备用于镇痛的丁丙诺啡溶液，将0.1 mL（....

结果

本方案描述了一种对小鼠角膜造成擦伤损伤的模型，并介绍了如何追踪和观察擦伤后的愈合过程。近期，我们采用该方法研究了角膜上皮前体细胞在伤口愈合中的作用⁶。使用成熟工具是成功开展擦伤实验的关键。我们及其他研究者曾使用Algerbrush II角膜磨头（图1）进行擦伤操作^6,7,24。该工具的磨头尖端已钝化，尺寸为0.5 mm，其作用方式为刷除而非钻取或剪切角膜上皮。因此，该工具是实施角膜擦伤损伤的推荐选择。

该模型的一个核心特点是，可以在所需时间点轻松观察到受影响区域。在图3A中，我们展示了使用荧光素染色结合.......

讨论

损伤方法是研究角膜稳态和病理学不同方面的常用工具。擦伤模型为解决眼科学中的相关问题提供了一种控制良好的方法。然而，该实验方案中某些关键步骤值得强调。需要注意的是，文中所述有关兽医用药、伤口愈合时间线及结果的细节，均针对远交系NMRI和ICR品系小鼠进行了优化，但在不同小鼠品系之间可能会有所差异²⁶。根据本方案，实验动物将保持麻醉状态约20分钟，这为实施擦伤操作提供了短暂但充足的时间窗口。然而，在使用眼部钻头时，实际进行擦伤操作非常迅速，完全可在该时间范围内完成。

简便且易于实现的可视化是磨损模型的主要优势之一。结合分子生物学方法，这为深入研究上皮细胞提供了可能。磨损后的角膜可进行组织学或免疫学染色，也可进一步收集并检测其中的蛋白质或核酸。Pajoohesh-Ganji 等 研究表明，使用钝化刀片造成角膜损伤后，角膜上皮细胞中的基因表达模式会发生改变²⁷。为确保采样的可控性，我们建议在手术后立即拍摄损伤区域的图像，并严格按照预定时间点进行样本采集。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
NMRI 小鼠	Envigo	275
0.9% NaCl			使用无菌
美托咪啶	Vetmedic	Vnr087896	商品名：Cepetor Vet
氯胺酮	Intervet	Vnr511485	商品名：Ketaminol Vet
丁丙诺啡	Invidior	3015248	商品名：Temgesic
阿替美唑	Orion Pharma	Vnr471953	商品名：Antisedan Vet
卡洛芬	Norbrook	Vnr027579	商品名：Norocarp Vet
1% 夫西地酸眼膏	Dechra	Vnr080899	商品名：Isathal
荧光素钠盐	Sigma-Aldrich	F6377
磷酸盐缓冲液			PBS
Algerbrush II 眼科磨头（0.5 mm 尖端）	Algerbrush	6.39768E+11
钴蓝笔式灯	SP Services	DE/003
热板仪	Kunz Instruments	2007-0217
数码单反相机	Nikon	D80
可调式相机支架和夹具	Neewer	10086132	高度 28 cm
带柔性臂和夹具的台灯	Prisma
软质擦拭纸	KimtechScience	7552
CO2 麻醉舱
解剖工具组	Fine Science Tools
注射器	Beckton Dickinson	303172
26G 针头	Beckton Dickinson	303800
2 mL Eppendorf 管	Sarstedt	689
组织包埋盒	Sakura Finetech	4118F
组织处理机 ASP200S	Leica
二甲苯	VWR	UN1307
石蜡	Millipore	K95523361
组织包埋模具 32 × 25 × 6 mm	Sakura Finetech	4123
切片机	Microm	HM355
切片用水浴锅	Orthex	60591
切片用水浴锅	Leica	HI1210
切片机刀片	Feather	S35
载玻片	Th.Geyer GmbH & Co.	7,695,019
超纯水	Millipore	MPGP04001	MilliQ
多聚甲醛	Sigma-Aldrich	158127	PFA