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分光光度法测定蓝细菌集胞藻（Synechocystis）中藻胆蛋白含量

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DOI：

10.3791/58076

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2018年9月11日

 ,  ,  , 
1Department of Adaptive Biotechnologies, Global Change Research Institute, Czech Academy of Sciences, 2Department of Plant Physiology, Faculty of Science, Masaryk University, 3Laboratory of Intracellular Regulation, Institute of Plant Physiology, Russian Academy of Sciences

本文内容

摘要

本文介绍了一种利用分光光度法定量测定蓝细菌Synechocystis中藻胆蛋白含量的实验方案。该提取方法也已成功应用于其他蓝细菌和藻类菌株；但由于色素吸收光谱存在差异，需针对每种菌株单独验证分光光度法计算公式的适用性。

摘要

这是一种用于定量测定模式蓝藻中藻胆蛋白含量的简易方案 集胞藻属藻胆蛋白是藻胆体的最重要组分，而藻胆体是蓝细菌和某些藻类类群中的主要捕光天线系统。这些藻胆体的 集胞藻属 包含两种藻胆蛋白：藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白。本方案描述了一种针对该模式蓝细菌中藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白进行定量测定的简单、高效且可靠的方法。我们比较了多种藻胆蛋白的提取及分光光度法定量方法。本方案所述的提取程序也已成功应用于其他蓝细菌菌株，例如 Cyanothece sp. Synechococcus elongatus, 螺旋藻 sp., 螺旋藻 sp.，以及 鱼腥藻 sp. 以及红藻 紫球藻（Porphyridium cruentum）然而，来自不同分类群的特定藻胆蛋白的消光系数可能存在差异，因此建议对每种藻株 individually 验证分光光度法定量方法。该方案耗时较少，且仅需标准设备，可在任何标准生命科学实验室中进行。

引言

藻胆蛋白是一类水溶性色素-蛋白质复合物，是原核蓝细菌（Cyanophyta）以及若干真核生物类群（Glaucophyta、Rhodophyta 和 Cryptophyta）光合天线系统的主要组成成分1。它们通常以超分子复合物的形式存在，称为藻胆体，一般附着在光合膜基质侧的表面，但 Cryptophyta 除外，其藻胆蛋白定位于类囊体腔内2。迄今为止已鉴定出四种类型的藻胆蛋白：位于核心的别藻蓝蛋白，以及位于外围的藻蓝蛋白、藻红蛋白和藻紫红蛋白1。作为主要的光捕获复合物，藻胆体是藻类和蓝细菌大规模培养生产率的关键因素之一。研究表明，在强光条件下，缩短藻胆体可提高生物量积累3；而在中等或弱光照条件下，天线系统的缩短则导致生长速率和生物量积累下降3,4。藻胆蛋白在商业上被用作食品着色剂、药品和食品添加剂，在化妆品工业中也有应用，并可作为荧光探针用于流式细胞术、荧光免疫分析和荧光显微镜技术5。

本方案聚焦于模式蓝藻Synechocystis中藻胆蛋白的定量测定。蓝藻是最早出现的产氧光合自养生物，已在地球上形成生物圈超过24亿年6。它们在全球氮、碳、氧及其他元素的生物地球化学循环中发挥着关键作用。在众多蓝藻中，单细胞株系Synechocystis具有独特地位，它是首个完成全基因组测序的蓝藻7,8，能够自然转化外源DNA9，并表现出稳定且相对快速的生长特性10,11。在Synechocystis中，核心天线组分别藻蓝蛋白与内在膜蛋白结合，而连接的藻蓝蛋白则位于类囊体膜的周边区域。

本方案中比较了多种藻胆蛋白的提取与定量方法。最终的提取步骤已成功应用于 集胞藻属以及其他蓝藻菌株，包括 Cyanothece sp. Synechococcus elongatus, 螺旋藻 sp., 节旋藻 sp.，以及 鱼腥藻 sp.，且已成功应用于红藻 紫球藻（Porphyridium cruentum）因此，本方案中开发的方法可被视为一种通用的藻胆蛋白提取方法。尽管部分测试的提取方法获得了更高的总蛋白产量，但本方案所述的提取程序提供了最高的藻胆蛋白产量，同时叶绿素含量最低 a 藻胆蛋白提取物中的残留物。降低叶绿素含量 a 对于藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的分光光度法定量至关重要。

不同藻类和蓝细菌物种之间的藻胆蛋白吸收光谱可能存在显著差异12,13,14,15,16,17，甚至在同一蓝细菌属的不同菌株之间也存在差异18。因此，用于Synechocystis中藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白测定的特定波长及吸收系数通常不适用于其他菌株。此外，Synechocystis不含藻红蛋白和藻红蓝蛋白，而这些蛋白可在某些其他藻类和蓝细菌中找到。针对Synechocystis以外菌株的藻胆蛋白测定，建议对每种菌株分别评估其分光光度计算方程。

尽管该实验方案包含两个耗时较长的步骤（细胞沉淀物的过夜冷冻干燥和1小时的蛋白质提取），但藻胆蛋白定量的总操作时间不超过2小时。

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方案

1. 蓝细菌培养

  1. 培养 集胞藻属 锥形瓶或光生物反应器中的细胞10,19 在缓冲的 BG11 培养基中20 以维持 pH 值为 < 10 (例如，使用 17 mM HEPES10).
    注意：标准培养条件需要控制温度（通常， 30 °C，最适温度为 35 °C)21，照明（通常为强度高达白光） 800 µmol[光子]/[m2·s]21，以及一个CO2 供应（在400 mL平板式光生物反应器中，达到生长饱和的CO₂）2 浓度为 1,700 ppm21.
  2. 为确定培养物密度，需在730 nm波长下通过分光光度法测定培养物的光密度（OD730使用光程为1 cm的比色皿进行测定。或者，使用血细胞计数板或自动细胞计数仪在显微镜下进行细胞计数。

2. 样品制备

  1. 在低辐照条件下操作，以防止藻胆蛋白降解。
  2. 取3 × 1 mL培养液至带安全锁的离心管中。设置三个技术重复，以评估测量过程中的技术误差。若需在无菌条件下取样，应在超净工作台中收集细胞，并遵循正确的操作与安全规范。
  3. 在室温下以15,000 × g 离心5分钟。注意离心机转子需正确配平。离心后弃去上清液，注意不要扰动沉淀。
  4. 将样品放入冷冻保存。长期保存时，应置于-80 °C；此条件可有效防止藻胆蛋白降解。短期保存可置于-20 °C。
  5. 将样品冷冻干燥过夜。为确保冻干过程有效，冻干机冷凝器温度应保持在-60 °C以下，冻干室压力维持在约1 hPa。
  6. 完成冻干程序后，应尽快封闭离心管，防止样品从空气中重新吸收水分。

3. 细胞匀浆与色素提取

  1. 向每个样品管中加入四颗玻璃珠（直径为 2 mm），并盖紧管盖。
    注意：用于均质化的安全锁扣管若管盖过薄，则在均质过程中可能发生破裂；因此，本方案建议仅使用管盖坚固的安全锁扣管。
  2. 在室温下，使用均质仪将样品与玻璃珠均质处理 15 秒。
    注意：充分均质后的样品应均匀分布在安全锁扣管的整个内壁表面。
  3. 向样品中加入 1 mL 预冷至 4 °C 的 PBS 缓冲液（pH 7.4），以提取藻胆蛋白。
    注意：从本步骤开始，应将样品始终置于冰上，以防止提取的蛋白质发生降解。此步骤至关重要。
  4. 在室温下，使用均质仪将样品与 PBS 缓冲液混合 5 秒。
    注意：混合后，样品呈绿色。
  5. 混合后，将样品置于冰上静置 60 分钟。冰浴容器应加盖，以防止色素降解。
  6. 藻胆蛋白提取 60 分钟后，在 4 °C 条件下以 15,000 x g 离心 5 分钟。注意离心机转子需正确平衡。
    注意：离心后，上清液呈深蓝色。

4. 藻胆蛋白定量

  1. 分光光度测定前，使用 PBS 缓冲液作为空白对照，将分光光度计校准至基线。
  2. 分光光度计校准后，倒弃一个分光光度计比色皿中的 PBS 缓冲液，用移液器将含有提取的藻胆蛋白的上清液加入该比色皿，替代已弃去的缓冲液。
  3. 使用 0.5 nm 的狭缝宽度，通过分光光度法测定藻胆蛋白浓度。
    1. 分别测定藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白中藻蓝素在 615 nm（A615）和 652 nm（A652）处相对于 PBS 缓冲液空白的吸光度，并测定细胞碎片在 720 nm（A720）处的吸光度。
    2. 根据 Bennett 和 Bogorad12 提出的公式（1）和（2）计算藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的浓度：
      figure-protocol-1
      figure-protocol-2
      注：A615、A652 和 A720 应处于分光光度计的线性吸光度范围内。如有必要，用 PBS 缓冲液稀释样品。
  4. 重新计算原始样品中的色素浓度。当分析时使用 1 mL 培养物和 1 mL 提取缓冲液时，样品中的色素浓度可直接由公式（1）和（2）的结果得出。若使用不同体积的蓝细菌样品和/或 PBS 缓冲液，最终色素浓度应根据公式（3）进行计算：
    figure-protocol-3   (3)
    注：若需将藻胆蛋白含量标准化为细胞干重，最终色素浓度应根据公式（4）进行计算：figure-protocol-4  (4)

5. 细胞干重的测定（可选）

  1. 在分析天平上称量三个空的安全锁扣管。
    注意：安全锁扣管必须保持干燥。若将试管存放在潮湿环境中，称量前需在冷冻干燥机中干燥数小时。操作时应轻柔处理试管，且仅使用无粉手套接触，避免材料与研究人员手指直接接触。保持所有支架和离心机清洁，防止任何外来物质污染试管。
  2. 取 1 × 15 mL 培养悬浮液转移至 15 mL 锥形管中。
  3. 将培养悬浮液在 15 mL 锥形管中于室温下以 4,000 × g 离心 10 分钟。使用另外三个各装有 15 mL 水的 15 mL 锥形管平衡离心转子。离心后弃去 12 mL 上清液。
  4. 用移液器将沉淀重悬于残留的上清液中，并将 3 × 1 mL 混合液分别转移至三个 1.5 mL 安全锁扣管中。若仍有部分沉淀残留在 15 mL 锥形管中，向该管加入 1.5 mL 去离子水，涡旋或振荡以重悬残留沉淀，再用移液器将 3 × 0.5 mL 混合液转移至已含有 3 × 1 mL 沉淀的三个 1.5 mL 安全锁扣管中。
    注意：将沉淀分装至三个 1.5 mL 安全锁扣管中，有助于评估干重测量过程中的技术误差。
  5. 将细胞在 1.5 mL 安全锁扣管中于室温下以 15,000 × g 离心 5 分钟。使用一个装有 1 mL 水的额外 1.5 mL 安全锁扣管平衡离心转子。离心后弃去上清液。
  6. 将样品放入冷冻保存。长期储存时应置于 -80 °C；短期储存可置于 -20 °C。
  7. 将样品冷冻干燥过夜。为确保良好的冷冻干燥效果，冷冻干燥机冷凝器温度应保持在 -90 °C 以下，干燥室压力维持在约 1 hPa。
  8. 冷冻干燥完成后，盖紧管盖，并在分析天平上称量样品。
    注意：所得干重数值可用于标准化每细胞干重的藻胆蛋白含量。

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结果

在初始方法测试中，Synechocystis 在25 °C条件下，于含17 mM HEPES的BG11培养基20中，在锥形瓶内进行分批培养，培养环境提供50 µmol(光子)/(m2·s)强度的暖白光，并通入含1% CO2的气体。培养期间，取培养物样品至带安全锁的离心管中，离心（15,000 x g，室温，5分钟），弃去上清液，沉淀样品或于-80 °C保存并冻干，以备本实验方案各步骤使用，或于-20 °C或-80 °C保存，用于后续的比较性提取及定量分析。

测试的提取方法包括超声波破碎细胞、在PBS缓冲液中使用氧化锆珠均质化以及冻融处理。不同提取方法的结果总结于图1中。本方案所述方法在提取缓冲液中获得了最高的藻胆蛋白产量，同时叶绿素a的污染最低。当使...

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讨论

本方案描述了一种简单、快速且可重复的定量模式蓝藻Synechocystis中藻胆蛋白含量的方法。本文比较了多种细胞匀浆、蛋白质提取以及藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白定量的方法，最终方案整合了各单项操作中的最优步骤。作为代表性数据，本文测定了在光照强度递增条件下Synechocystis细胞中藻胆蛋白的含量。尽管该分析所需的时间和实验设备与此前报道的一些方法12,13,14,15,16相似，但本方案的优势在于提取过程中不会释放叶绿素a，因此可高精度地测定藻胆蛋白含量。

用于藻胆蛋白分析的细胞悬液用量可能因培养密度而异。1 mL 的样品体积适用于 OD730 为 1.5、细胞密度约为 2 × 10<...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本方案改编自先前发表的研究11。T. Z.、D. Ch. 和 J. Č. 获得了捷克共和国教育、青年和体育部国家可持续发展计划 I（NPU I）的资助（项目编号 LO1415）。J. Č. 还获得了捷克科学基金会（GA CR）的资助（项目编号 18-24397S）。仪器设备及其他设施的使用得到了捷克系统生物学研究基础设施 C4SYS（项目编号 LM2015055）的支持。M. A. S. 获得了俄罗斯科学基金会资助项目（编号 14-14-00904）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
集胞藻属 PCC 6803Institut Pasteur, Paris, France6803蓝细菌菌株
Roti-CELL PBSCarl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany9143.1磷酸盐缓冲液（PBS）溶液，pH 7.4
Eppendorf safe-lock 管 Eppendorf, Hamburk, Germany301200861.5 ml 安全锁扣管
VWR 80-位储存系统VWR International, Radnor, Pennsylvania, USA30128-282安全锁扣管架 
RAININ 100 µl -1000 µl Mettler-Toledo, Columbus, Ohio, USA17014382移液器
GP-LTS-A-1000µL-/F-768/8Mettler-Toledo, Columbus, Ohio, USA30389272移液器吸头
Rotina 420RHettich, Kirchlengern, Germany4701适用于 1.5 ml 安全锁扣管和 15 ml 锥形离心管的制冷离心机
LCexv 4010Liebherr, Bulle, Switzerland9005382197172冰箱和 -20 °C 冷冻柜
Revco ExF -86°C 立式超低温冷冻柜Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USAEXF24086V -80 °C 冷冻柜
CoolSafeLaboGene, Lillerød, Denmark7.001.000.615冷冻干燥机 
UV-2600Shimadzu, Kyoto, JapanUV-2600分光光度计 
Hellma 吸收池，半微量Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USAZ600288 VIS/UV-VIS 半微量比色皿，0.75–1.5 ml，光谱范围 200–2500 nm 
Silamat S6Ivoclar Vivadent, Schaan, Liechtenstein602286WU均质器 
实心玻璃珠Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USAZ273627直径为 2 mm 的玻璃珠
CPA225D-0CESartorius AG, Göttingen, GermanySECURA225D-1OBR分析天平
螺旋藻属 C-藻蓝蛋白 Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USAP2172藻蓝蛋白标准品
别藻蓝蛋白Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USAA7472别藻蓝蛋白标准品
双辛可宁酸试剂盒 Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USABCA1, B9643总蛋白测定用完整试剂盒
AlgaeTron Photon System Instruments Ltd., Drásov, Czech RepublicAG 130-ECO 带可控光照和气氛的 E 瓶培养室
光生物反应器Photon System Instruments Ltd., Drásov, Czech RepublicFMT-150具有完全可控环境的蓝细菌和藻类培养设备
Cellometer Nexcelom Bioscience, Lawrence, Massachusetts, USAAuto M10细胞计数仪
Corning 15 mL 离心管Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USACLS430791 用于干重取样的 15 ml 离心管
Herasafe KSThermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA51024579层流罩

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PBS 15000 G 615 652 720 nm Bennett Bogorad

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