分光光度法测定蓝细菌集胞藻（Synechocystis）中藻胆蛋白含量

摘要

本文介绍了一种利用分光光度法定量测定蓝细菌Synechocystis中藻胆蛋白含量的实验方案。该提取方法也已成功应用于其他蓝细菌和藻类菌株；但由于色素吸收光谱存在差异，需针对每种菌株单独验证分光光度法计算公式的适用性。

摘要

这是一种用于定量测定模式蓝藻中藻胆蛋白含量的简易方案 集胞藻属藻胆蛋白是藻胆体的最重要组分，而藻胆体是蓝细菌和某些藻类类群中的主要捕光天线系统。这些藻胆体的 集胞藻属 包含两种藻胆蛋白：藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白。本方案描述了一种针对该模式蓝细菌中藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白进行定量测定的简单、高效且可靠的方法。我们比较了多种藻胆蛋白的提取及分光光度法定量方法。本方案所述的提取程序也已成功应用于其他蓝细菌菌株，例如 Cyanothece sp. Synechococcus elongatus, 螺旋藻 sp., 螺旋藻 sp.，以及 鱼腥藻 sp. 以及红藻 紫球藻（Porphyridium cruentum）然而，来自不同分类群的特定藻胆蛋白的消光系数可能存在差异，因此建议对每种藻株 individually 验证分光光度法定量方法。该方案耗时较少，且仅需标准设备，可在任何标准生命科学实验室中进行。

引言

藻胆蛋白是一类水溶性色素-蛋白质复合物，是原核蓝细菌（Cyanophyta）以及若干真核生物类群（Glaucophyta、Rhodophyta 和 Cryptophyta）光合天线系统的主要组成成分¹。它们通常以超分子复合物的形式存在，称为藻胆体，一般附着在光合膜基质侧的表面，但 Cryptophyta 除外，其藻胆蛋白定位于类囊体腔内²。迄今为止已鉴定出四种类型的藻胆蛋白：位于核心的别藻蓝蛋白，以及位于外围的藻蓝蛋白、藻红蛋白和藻紫红蛋白¹。作为主要的光捕获复合物，藻胆体是藻类和蓝细菌大规模培养生产率的关键因素之一。研究表明，在强光条件下，缩短藻胆体可提高生物量积累³；而在中等或弱光照条件下，天线系统的缩短则导致生长速率和生物量积累下降^3,4。藻胆蛋白在商业上被用作食品着色剂、药品和食品添加剂，在化妆品工业中也有应用，并可作为荧光探针用于流式细胞术、荧光免疫分析和荧光显微镜技术⁵。

本方案聚焦于模式蓝藻Synechocysti....

方案

1. 蓝细菌培养

1. 培养 集胞藻属 细胞置于锥形瓶或光生物反应器中^10,19 在缓冲的 BG11 培养基中²⁰ 以维持 pH 值为 < 10 (例如，使用 17 mM HEPES¹⁰).
   注意：标准培养条件需要控制温度（通常， 30 °C，最适温度为 35 °C)²¹，照明（通常为强度高达白光的光照） 800 µmol[光子]/[m²·s])²¹，以及一个 CO₂ 供应（在400 mL平板式光生物反应器中，达到生长饱和的CO₂）₂ 浓度为 1,700 ppm²¹.
2. 为确定培养物密度，使用分光光度法在730 nm处测定培养物的光密度（OD₇₃₀使用光程为1 cm的比色皿进行测定。或者，在显微镜下使用血细胞计数板或自动细胞计数仪进行细胞计数。

2. 样品制备

1. 在低辐照条件下操作，以防止藻胆蛋白降解。

结果

在初始方法测试中，Synechocystis 在 Erlenmeyer 摇瓶中以分批培养方式于 BG11 培养基²⁰（添加 17 mM HEPES）中培养，培养条件为 25 °C，光照强度为 50 µmol(光子)/(m²·s) 的暖白光，以及培养气相中含 1% CO₂。培养过程中，取培养物样品至防漏管中，离心（15,000 × g，室温，5 分钟），弃去上清液，沉淀样品或于 -80 °C 保存并冻干，以备本方案各步骤使用，或于 -20 °C 或 -80 °C 保存，用于比较性提取与定量分析。

测试的提取方法包括超声波破碎细胞、在PBS缓冲液中使用氧化锆珠均质化以及冻融处理。不同提取方法的结果总结于图1中。本方案所述方法在提取缓冲液中获得了最高的藻胆蛋白产量，同时叶绿.......

讨论

本方案描述了一种简单、快速且可重复的定量模式蓝藻Synechocystis中藻胆蛋白含量的方法。本文比较了多种细胞匀浆、蛋白质提取以及藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白定量的方法，最终方案整合了各单项操作中的最优步骤。作为代表性数据，本文测定了在光照强度递增条件下Synechocystis细胞中藻胆蛋白的含量。尽管该分析所需的时间和实验设备与此前报道的一些方法^{12,13,14,15,16}相似，但本方案的优势在于提取过程中不会释放叶绿素a，因此可高精度地测定藻胆蛋白含量。

用于藻胆蛋白分析的细胞悬液用量可能因培养密度而异。1 mL 的样品体积适用于 OD₇₃₀ 为 1.5、细胞密度约为 2 × 10<.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
集胞藻属 PCC 6803	Institut Pasteur, Paris, France	6803	蓝细菌菌株
Roti-CELL PBS	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany	9143.1	磷酸盐缓冲液（PBS）溶液，pH 7.4
Eppendorf safe-lock 管	Eppendorf, Hamburk, Germany	30120086	1.5 ml 安全锁扣管
VWR 80-位储存系统	VWR International, Radnor, Pennsylvania, USA	30128-282	安全锁扣管架
RAININ 100 µl -1000 µl	Mettler-Toledo, Columbus, Ohio, USA	17014382	移液器
GP-LTS-A-1000µL-/F-768/8	Mettler-Toledo, Columbus, Ohio, USA	30389272	移液器吸头
Rotina 420R	Hettich, Kirchlengern, Germany	4701	适用于 1.5 ml 安全锁扣管和 15 ml 锥形离心管的制冷离心机
LCexv 4010	Liebherr, Bulle, Switzerland	9005382197172	冰箱和 -20 °C 冷冻柜
Revco ExF -86°C 立式超低温冷冻柜	Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	EXF24086V	-80 °C 冷冻柜
CoolSafe	LaboGene, Lillerød, Denmark	7.001.000.615	冷冻干燥机
UV-2600	Shimadzu, Kyoto, Japan	UV-2600	分光光度计
Hellma 吸收池，半微量	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	Z600288	VIS/UV-VIS 半微量比色皿，0.75–1.5 ml，光谱范围 200–2500 nm
Silamat S6	Ivoclar Vivadent, Schaan, Liechtenstein	602286WU	均质器
实心玻璃珠	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	Z273627	直径为 2 mm 的玻璃珠
CPA225D-0CE	Sartorius AG, Göttingen, Germany	SECURA225D-1OBR	分析天平
螺旋藻属 C-藻蓝蛋白	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	P2172	藻蓝蛋白标准品
别藻蓝蛋白	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	A7472	别藻蓝蛋白标准品
双辛可宁酸试剂盒	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	BCA1, B9643	总蛋白测定用完整试剂盒
AlgaeTron	Photon System Instruments Ltd., Drásov, Czech Republic	AG 130-ECO	带可控光照和气氛的 E 瓶培养室
光生物反应器	Photon System Instruments Ltd., Drásov, Czech Republic	FMT-150	具有完全可控环境的蓝细菌和藻类培养设备
Cellometer	Nexcelom Bioscience, Lawrence, Massachusetts, USA	Auto M10	细胞计数仪
Corning 15 mL 离心管	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	CLS430791	用于干重取样的 15 ml 离心管
Herasafe KS	Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	51024579	层流罩