用于修复大段骨缺损的新型生物材料数量正在持续增加，旨在促进骨愈合并克服与骨移植相关的并发症。本文介绍了一种用于骨修复生物材料临床前生物相容性测试的多学科策略。
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本文内容
摘要
摘要
大段骨不连骨折是骨科手术中的重大挑战。尽管自体和同种异体骨移植在愈合此类病变方面效果良好，但其应用仍存在潜在并发症。因此，材料科学家正在开发合成的、生物相容性的生物材料以克服这些问题。在本研究中，我们提出了一种用于评估骨修复生物材料的多学科平台。我们整合了骨生物学与免疫学的专业知识，建立了一个包含体外成骨细胞（OB）和破骨细胞（OC）实验以及体内小鼠骨修复、免疫原性和致敏性模型的综合平台。 体外 破骨细胞（OC）和成骨细胞（OB）检测 体内 骨修复、免疫原性和致敏性的小鼠模型。我们展示了如何开展这些实验，总结了实验结果，并报告了生物材料的生物相容性。具体而言，我们在β-磷酸三钙（β-TCP）圆片的条件下检测了成骨细胞的活力、分化和矿化能力，以及破骨细胞的活力和分化能力 β磷酸三钙 (ββ-TCP圆盘。我们还测试了一种β-TCP/胶原（β-TCP/C）泡沫 ββ-TCP/胶原蛋白（β-TCP/C）ββ-TCP/C泡沫是一种临床用于骨修复的市售材料，本研究在临界尺寸颅骨骨缺损小鼠模型中评估其对骨愈合早期阶段的影响。在平行实验中，我们评估了小鼠的免疫和过敏反应。本方法通过一系列参数生成骨生物材料的生物学相容性谱型，这些参数对于预测用于患者骨愈合与修复的生物材料的生物相容性至关重要。
引言
骨修复是一个复杂的过程，始于血肿形成、炎症、骨痂形成，随后是重塑阶段。1,2然而，骨再生能力受限于骨折的大小1,3例如，由创伤、癌症或骨质疏松引起的大型骨骨折可能无法愈合，被称为骨不连骨折。这些骨病变通常需要治疗以促进正常的生理性骨修复与再生。目前，自体骨移植和同种异体骨移植是首选的治疗方法4 每年进行约220万例骨替代手术5尽管这些手术的成功率较高，但仍可能存在一些并发症，例如骨源有限、感染、供体部位并发症以及排斥反应4为应对这些挑战，人们正在寻求骨组织工程的新替代方案。
基于天然或合成聚合物、生物陶瓷或金属，并结合细胞和生物活性分子的生物材料设计正在迅速发展6。目前对生理性骨愈合以及在生物材料作用下的骨愈合过程的理解，依赖于多种因素，包括材料的机械性能，以及来自循环系统和骨折部位的多种局部和全身性因素7,8,
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方案
实验操作均采用 BALB/c 小鼠进行，遵循奥地利教育、科学和研究部关于《实验动物护理和使用指南》的所有规定，并经奥地利教育、科学和研究部伦理委员会批准。
1. 小鼠原代成骨细胞培养
- 通过酶消化法从新生小鼠颅骨中分离成骨细胞
- 通过断头法处死1–2日龄的新生小鼠（共60只），并将头部置于含有无菌1×磷酸盐缓冲液（PBS）的培养皿中。
- 用镊子夹住小鼠头部后颈部位，使用无菌剪刀剪开皮肤。用剪刀刺穿颅骨（深度约0.1–0.3 mm），然后将剪刀插入颅骨下方、颅底后部，沿耳上方的颅骨边缘从前向后剪开，再沿鼻梁上方剪开（图1）。
- 将分离的颅骨组织放入含有8 mL滤膜除菌消化液（含300单位/mL IV型胶原酶和2.14单位/mL dispase II，溶于α-最低必需培养基（α-MEM））的50 mL锥形管中，在37 °C、200次/分钟振荡培养箱中孵育10分钟。
- 弃去第一次上清液，用8 mL消化液重复消化三次。每次消化后收集含细胞的上清液，并转移至50 mL锥形管中。将装有细胞的锥形管置于冰水浴中保存，直至完成整个消化过程（约40分钟）。
- 在4 °C条件下以300 × g离心5分钟，吸除上清液（使用连接真空泵的巴斯德吸管），用40 mL成骨细胞生长培养基（BGM）重悬....
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结果
为了评估β-TCP作为骨修复生物材料的有效性，我们采用了 体外 和 体内 筛选方法。首先，我们检测了OB对β-TCP圆片的反应，并与仅含基础培养基的对照组进行比较。 图2 展示了成骨细胞（OB）在培养第7天和第14天对β-TCP圆片的存活情况。通过测定培养孔中代谢活跃细胞的活性，发现含β-TCP圆片的成骨细胞与仅含组织培养塑料中培养基的成骨细胞的细胞活力相当，表明该生物材料既不促进也不抑制成骨细胞的增殖。
为了进一步评估成骨细胞（OBs），我们采用定性和定量方法检测碱性磷酸酶（ALP）活性，作为细胞分化的标志。图2展示了培养7天后各培养孔中ALP酶的活性。仅含基础培养基的孔中OBs的ALP活性处于基线水平，而在最佳矿化培养基（MM）中，OBs表现出强烈的ALP染色，反映出高水平的成骨细胞分化。相比之.......
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讨论
在此，我们展示了一种多学科方法，用于对代表性骨再生与修复生物材料进行临床前生物相容性评估。我们检测了成骨细胞（OB）、破骨细胞（OC）以及免疫系统对这些材料的反应。 体内 在小鼠关键骨缺损模型中的愈合反应以及 体外 和 体内 免疫反应。本文旨在展示这些检测方法的操作流程，并总结从生物材料检测中获得的数据与结论。结果表明，本研究策略能够生成有价值的骨生物材料生物相容性谱型。
采用原代细胞实验评估成骨细胞（OB）和破骨细胞（OC）功能。OB 负责骨形成及生理性修复，必须保持活性，并能够分化和诱导矿化。本研究展示了如何开展细胞活力、碱性磷酸酶（ALP）和茜素红 S（ARS）染色实验，以检测具有矿化能力的生理性分化细胞。实验设置两种对照：仅含培养基的对照组用于提供基线值，成骨矿化培养基（MM）对照组则用于在塑料培养表面优化 OB 的分化与矿化，后者作为生物材料的参照标准。对于 OC 的评估，我们共培养 OB 与骨髓来源的 OC 前体细胞，诱导前体细胞分化为多核细胞，并使用抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色，该酶是广泛用于鉴定 OC 的破.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究项目获得了欧盟第七个框架计划（FP7/2007-2013）资助，资助协议编号为263363。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 生物材料 | |||
| β-磷酸三钙圆盘（ββ-TCP，14 mm | 将圆盘置于马弗炉中，在特定温度下进行烧结 1150 °C详细的制备方法可参见 Zimmer 等人（doi: 10.1002/jbm.a.34639）。样品在用于细胞培养前需经紫外线照射（每侧 15 分钟）。 | ||
| Orthovita Vitoss 泡沫ββ-TCP/C 泡沫 | Orthovita | 2102-1405 | |
| 小鼠成骨细胞培养 | |||
| 茜素红 S | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| ALP 检测缓冲液（2x），pH 10.4 | 将200 mM甘氨酸、2 mM氯化镁、2 mM氯化锌溶解于超纯水中，并调节pH至10。 | ||
| 骨生长培养基 (BGM) | α- MEM + 10% 热灭活 FBS + 1% 青霉素/链霉素 | ||
| 细胞裂解缓冲液：CyQuant 细胞裂解缓冲液 20x 浓缩液 | Thermo Scientific | C7027 | 将浓缩的细胞裂解缓冲液原液用超纯水稀释20倍。 |
| 细胞活力试剂：Presto Blue 细胞活力试剂 | Invitrogen，Thermo Fisher Scientific | A13261 | |
| 产气荚膜梭菌来源的 IV 型胶原酶 | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| DC 蛋白检测试剂盒 II | Bio Rad | 5000112 | DC 蛋白检测试剂盒包含试剂 A、试剂 B、试剂 S 以及用于参考标准的 BSA。对于试剂 A'，添加 20 µL 试剂S至 1000 µL 试剂A |
| 二甲基亚砜（DMSO） | Sigma-Aldrich | D8418 | 使用前对DMSO进行除菌过滤。 |
| Dispase II（中性蛋白酶，II 型） | 罗氏 | 4942078001 | |
| EnzCheck 碱性磷酸酶活性检测试剂盒 | Invitrogen，Thermo Fisher Scientific | E12020 | EnzCheck 磷酸酶检测试剂盒包含 6,8-二氟-4-甲基伞形基磷酸盐（DiFMUP）、N,N-二甲基甲酰胺和 6,8-二氟-7-羟基-4-甲基香豆素（DiFMU）。 |
| 胎牛血清（FBS） | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| 10% 中性缓冲福尔马林溶液 | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| 甘氨酸 | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| 十六烷基吡啶氯化物（西曲氯铵）一水合物 | Sigma-Aldrich | C9002 | |
| L-抗坏血酸-2-磷酸三镁盐水合物 | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| 六水合氯化镁 | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| MEM α 培养基（α-MEM | Gibco Life Technologies | 11900-073 | |
| 成骨矿化培养基（MM） | α-MEM + 10% 热灭活 FBS + 1% 青霉素-链霉素 + 50 µg/mL 抗坏血酸 + 5 mM β-甘油磷酸盐 | ||
| 青霉素-链霉素 | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| 磷酸盐缓冲液 1x (PBS) pH 7.4 | Gibco，赛默飞世尔科技 | 10010023 | |
| Sigmafast BCIP/NBT | Sigma-Aldrich | B5655 | |
| 胰蛋白酶-EDTA（0.5%），无酚红（10倍浓缩液） | Gibco，Thermo Fisher Scientific | 15400054 | 将浓缩的储备液用1×PBS稀释10倍。 |
| Tween20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| 超纯水：无热原细胞培养用水 | VWR | L0970-500 | |
| 洗涤缓冲液 | 添加 0.05% Tween20 加至 1x PBS | ||
| 氯化锌 | Sigma-Aldrich | 1.08816 | |
| β二水合β-甘油磷酸二钠盐 | Sigma-Aldrich | G5422 | |
| 24孔悬浮培养板 | Greiner bio-one | 662102 | |
| 24孔细胞培养板 | Greiner bio-one | 662160 | |
| 50 mL 三角锥形管 | Greiner bio-one | 227261 | |
| 96孔黑色板 | Greiner bio-one | 655076 | |
| 96孔透明板 | Greiner bio-one | 655001 | |
| 离心机：VWR Mega Star 600R | VWR | ||
| CO2培养箱：HeraCell 240 | Thermo Scientific | ||
| 2 mL 冻存管 | Greiner bio-one | 122263 | |
| 一次性滤器单元 FP30/0.2 CA-S | GE Healthcare Life Sciences Whatman | 10462200 | 用于酶溶液的无菌过滤。 |
| 平板扫描仪：Epson Perfection 1200 Photo | Epson | ||
| Infinite M200 Pro 微孔板读板仪 | Tecan | ||
| 微量离心管：Eppendorf管，安全锁扣，0.5 mL | VWR | 20901-505 | |
| 微量离心管：Eppendorf管安全锁 1.5 mL | VWR | 21008-959 | |
| Shaker Swip（轨道式和水平式） | Edmund Buehler | ||
| GFL3032 摇床培养箱 | GFL | 3032 | |
| 一次性移液管：血清移液管 | Greiner bio-one | 612301 | |
| 无菌器械（剪刀、镊子、弯头止血钳） | |||
| 组织培养板（10 cm） | Greiner bio-one | 664960 | |
| 小鼠成骨细胞-破骨细胞共培养 | |||
| 1α1,25-二羟基维生素D3 | Sigma-Aldrich | 17936 | 1000倍浓缩储备液（10 µM 在100%乙醇中 |
| 丙酮 | VWR Chemicals | 22065.327 | |
| 骨生长培养基（BGM） | α- MEM + 10% 热灭活 FBS + 1% 青霉素-链霉素 | ||
| 蒸馏水 | Carl Roth | 3478.4 | |
| 乙醇（100% vol/vol） | VWR Chemicals | 20821.365 | |
| 乙醇（70% vol/vol） | VWR Chemicals | 93003.1006 | |
| 快红紫 LB 盐 | Sigma-Aldrich | F3381 | |
| 胎牛血清（FBS） | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| 10% 中性缓冲福尔马林溶液 | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| MEM α 培养基（α-MEM | Gibco Life Technologies | 11900-073 | |
| N,N-二甲基甲酰胺 | Sigma-Aldrich | D4551 | |
| 萘酚AS-MX磷酸盐 | Sigma-Aldrich | N4875 | |
| 破骨细胞分化培养基（DM） | α- MEM + 10% 热灭活 FBS + 1% 青霉素-链霉素 + 1 nM 1,25-(OH)2-维生素D3 + 1 µM 前列腺素 E2 | ||
| 青霉素-链霉素 | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| 磷酸盐缓冲液 1x (PBS) pH 7.4 | Gibco，Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| 前列腺素 E2 (PGE2) | Cayman Chemical Company | 9003016 | 1000倍浓缩储备液（1 mM，溶于100%乙醇） |
| 三水合醋酸钠 | Sigma-Aldrich | S7670 | |
| 酒石酸钠二水合物 | Sigma-Aldrich | S8640 | |
| 无菌器械（剪刀、镊子、手术刀） | |||
| TRAP 缓冲液 pH 5.0 | 将40 mM醋酸钠、10 mM酒石酸钠溶于超纯水中，并调节pH至5。 | ||
| 超纯水：无热原细胞培养用水 | VWR | L0970-500 | |
| 24孔悬浮培养板 | Greiner bio-one | 662102 | |
| 24孔细胞培养板 | Greiner bio-one | 662160 | |
| 50 mL 离心管 | Greiner bio-one | 227261 | |
| 离心机：VWR Mega Star 600R | VWR | ||
| CO2培养箱：HeraCell 240 | Thermo Scientific | ||
| 金刚石切片刀（10.2 cm × 0.3 cm） | Buehler | ||
| Isomet低速锯 | Buehler | ||
| 培养皿（6 cm） | Greiner bio-one | 628,161 | |
| 20 mL 螺口玻璃瓶 | Carl Roth | EXY4.1 | |
| 一次性无菌注射器 1 mL | Henry Schein Animal Health | 9003016 | |
| 一次性移液管：血清移液管 | Greiner bio-one | 612301 | |
| 无菌针头：27号G规格×3/4英寸一次性注射针 | Henry Schein 动物保健 | 9003340 | |
| 小鼠颅骨缺损模型 | |||
| 镇痛：布托啡诺（Bupaq） | Richter Pharma AG | ||
| 麻醉：氯胺酮（Ketamidor），赛拉嗪（Rompun） | Richter Pharma AG/Bayer HealthCare | ||
| 冷灭菌剂：SafeSept Max | Henry Schein Animal Health | 9882765 | |
| 乙醇（70% vol/vol） | VWR Chemicals | 93003.1006 | |
| 眼膏：VitA POS 5 g | Ursapharm | ||
| 生理盐水溶液（0.9%氯化钠溶液） | Fresenius Kabi | ||
| 磷酸盐缓冲液 1x (PBS) pH 7.4 | Gibco，赛默飞世尔科技 | 10010023 | |
| 聚维酮碘溶液：Braunol 1000 mL | B. Braun | 3864154 | |
| Roti-Histofix 4.5% 缓冲甲醛 | Carl Roth | 2213.6 | |
| 组织粘合剂：Histoacryl 5 × 0.5 mL | B. Braun Surgical | 1050060 | |
| 个人防护装备：外科手套、帽子和口罩、防护服 | Henry Schein Animal Health | 1045073, 1026614, 9009062, 370406 | |
| 无菌器械（手术刀、剪刀、镊子、持针器） | |||
| 无菌针头：27 号 3/4 英寸和 30 号 1/2 英寸皮下注射针头 | Henry Schein Animal Health | 9003340, 9003630 | |
| 一次性无菌注射器 1 mL | Henry Schein Animal Health | 9003016 | |
| 加热板：Physitemp | Rothacher Medical | TCAT-2LV | |
| 无菌纱布拭子 | Henry Schein Animal Health | 220192 | |
| 无菌一次性手术刀（图20） | Henry Schein Animal Health | 9008957 | |
| 外科/牙科钻机：Implantmed SI-923 | W&H Dentalwerk Bürmoos GmbH | 16929000 | |
| S-II型手柄 | W&H Dentalwerk Bürmoos GmbH | 30056000 | |
| 直径4 mm的环钻 | Hager&Meisinger GmbH | 229040 | |
| 灌注管路套装 2.2 m | W&H Dentalwerk Bürmoos GmbH | 4363600 | |
| 骨膜剥离器 2 mm / 3 mm | Henry Schein 动物健康 | 472683 | |
| 不可吸收缝线：聚酯绿线，DS19，针长 1.5，USP 4/0，75 cm | Henry Schein Animal Health | 300715 | |
| 体外 免疫反应 | |||
| 安乐死麻醉剂：氯胺酮（Ketamidor）、赛拉嗪（Rompun） | Richter Pharma AG/Bayer HealthCare | ||
| 细胞增殖ELISA，BrdU（比色法）检测试剂盒 | Sigma-Aldrich | 11647229001 | 试剂盒包含 BrdU 标记液、固定液（FixDenat）、抗 BrdU 抗体溶液、洗涤缓冲液和底物溶液。 |
| 刀豆蛋白A（ConA） | MP Biomedicals | 150710 | |
| 培养基 脾细胞 | RPMI 培养基 + 10% 热灭活 FBS + 1% 青霉素-链霉素溶液 + 0.1% 庆大霉素 + 0.2% ß-巯基乙醇 + 1% 非必需氨基酸 | ||
| 乙醇（70% vol/vol） | VWR Chemicals | 93003.1006 | |
| 胎牛血清（FBS） | Gibco，Thermo Fisher Scientific | 10500064 | |
| 庆大霉素 | Gibco，Thermo Fisher Scientific | 15750037 | |
| 小鼠 IL-1β ELISA Ready-SET-Go! | Invitrogen，Thermo Fisher Scientific | 88-7013-88 | |
| 小鼠 IL-2 ELISA MAX 标准品 | BioLegend | 431001 | |
| 小鼠 IL-4 ELISA MAX 标准品 | BioLegend | 431101 | |
| 小鼠 INF-γ ELISA MAX 标准品 | BioLegend | 430801 | |
| 非必需氨基酸溶液 | Gibco，Thermo Fisher Scientific | 11140050 | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco，赛默飞世尔科技 | 15140122 | |
| 磷酸盐缓冲液 1x (PBS) pH 7.4 | Gibco，Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| 红细胞（RBC）裂解缓冲液：BD Pharm Lyse | BD Bioscience | 555899 | |
| RPMI 1640 培养基，HEPES | Gibco，赛默飞世尔科技 | 52400025 | |
| β-巯基乙醇 | Gibco，赛默飞世尔科技 | 31350010 | |
| 50 mL 锥形管 | Greiner bio-one | 227261 | |
| 96孔组织培养板 | Greiner bio-one | 655180 | |
| 离心机：VWR Mega Star 600R | VWR | ||
| 细胞筛 40 µm | BD Bioscience | 352340 | |
| Infinite M200 Pro 微孔板读板机 | Tecan | ||
| 一次性无菌注射器 1 mL | Henry Schein 动物健康 | 9003016 | |
| 无菌手术器械（镊子、载玻片） | |||
| 高通量腹腔注射模型 | |||
| 麻醉：氯胺酮（Ketamidor），赛拉嗪（Rompun） | Richter Pharma AG/Bayer HealthCare | ||
| 冷灭菌剂：SafeSept Max | Henry Schein Animal Health | 9882765 | |
| 乙醇（70% vol/vol） | VWR Chemicals | 93003.1006 | |
| 眼膏：VitA POS 5 g | Ursapharm | ||
| 小鼠 IL-1β ELISA Ready-SET-Go! | Invitrogen，Thermo Fisher Scientific | 88-7013-88 | |
| 小鼠 IL-2 ELISA MAX 标准品 | BioLegend | 431001 | |
| 小鼠 IL-4 ELISA MAX 标准品 | BioLegend | 431101 | |
| 磷酸盐缓冲液 1x (PBS) pH 7.4 | Gibco，Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| 聚维酮碘溶液：Braunol 1000 mL | B. Braun | 3864154 | |
| Shandon Rapid-Chrome Kwik-Diff 染色试剂盒 | 赛默飞世尔科技 | 9990700 | 用于细胞分类计数。 |
| 加热板：Physitemp | Rothacher Medical | TCAT-2LV | |
| 血细胞计数板：Neubauer 计数室 | Carl Roth | PC72.1 | |
| 不可吸收缝合线：Ethibond Excel 4-0 | Ethicon | 6683H | |
| 可吸收缝合线：Polysorb | Covidien | SL-5628 | |
| Shandon 离心机用于细胞涂片 | Thermo Scientific | ||
| 一次性无菌注射器 1 mL | Henry Schein Animal Health | 9003016 | |
| 无菌纱布拭子 | Henry Schein 动物健康 | 220192 | |
| 无菌针头：27 号 RW 27 G × 3/4″ 和 25 G 皮下注射针头 | Henry Schein 动物健康 | 9003340, 420939 | |
| 无菌手术器械（手术刀、剪刀、镊子、持针器） | |||
| 0.4% 台盼蓝溶液 | Gibco，赛默飞世尔科技 | 15250061 | |
| 亚慢性皮下模型 | |||
| 麻醉剂：氯胺酮（Ketamidor），赛拉嗪（Rompun） | Richter Pharma AG/Bayer HealthCare | ||
| 冷灭菌剂：SafeSept Max | Henry Schein Animal Health | 9882765 | |
| 乙醇（70% vol/vol） | VWR Chemicals | 93003.1006 | |
| 眼膏：VitA POS 5 g | Ursapharm | ||
| 磷酸盐缓冲液 1x (PBS) pH 7.4 | Gibco，Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| 聚维酮碘溶液：Braunol 1000 mL | B. Braun | 3864154 | |
| Roti-Histofix 4.5% 缓冲甲醛 | Carl Roth | 2213.6 | |
| 加热板：Physitemp | Rothacher Medical | TCAT-2LV | |
| 不可吸收缝合线：Ethibond Excel 4-0 | Ethicon | 6683H | |
| 个人防护装备：外科手套、帽子和口罩、防护服 | Henry Schein Animal Health | 1045073, 1026614, 9009062, 370406 | |
| 一次性无菌注射器 1 mL | Henry Schein Animal Health | 9003016 | |
| 无菌纱布拭子 | Henry Schein Animal Health | 220192 | |
| 无菌器械（手术刀、剪刀、镊子、持针器） | |||
| 无菌针头：27 号 3/4 英寸一次性使用注射针 | Henry Schein Animal Health | 9003340, 420939 |
参考文献
- Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. Fracture healing: mechanisms and interventions. Nature Reviews Rheumatology. 11 (1), 45-54 (2015).
- Marsell, R., Einhorn, T. A. The biology of fracture healing. Injury. 42 (6), 551-555 (2011).
- Cooper, G. M., et al.
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