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方法文章

骨再生用生物材料的生物学相容性评价

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DOI：

10.3791/58077

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2018年11月16日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacology and Toxicology, University of Vienna, 2Laboratory of Experimental Allergy, Division of Immunology, Allergy and Infectious Diseases, Department of Dermatology, Medical University of Vienna

本文内容

摘要

用于修复大段骨缺损的新型生物材料数量正在持续增加，旨在促进骨愈合并克服与骨移植相关的并发症。本文介绍了一种用于骨修复生物材料临床前生物相容性测试的多学科策略。

摘要

大段骨不连骨折是骨科手术中的重大挑战。尽管自体和同种异体骨移植在愈合此类病变方面效果良好，但其应用仍存在潜在并发症。因此，材料科学家正在开发合成的、生物相容性的生物材料以克服这些问题。在本研究中，我们提出了一种用于评估骨修复生物材料的多学科平台。我们整合了骨生物学与免疫学的专业知识，建立了一个包含体外成骨细胞（OB）和破骨细胞（OC）实验以及体内小鼠骨修复、免疫原性和致敏性模型的综合平台。 体外 破骨细胞（OC）和成骨细胞（OB）检测 体内 骨修复、免疫原性和致敏性的小鼠模型。我们展示了如何开展这些实验，总结了实验结果，并报告了生物材料的生物相容性。具体而言，我们在β-磷酸三钙（β-TCP）圆片的条件下检测了成骨细胞的活力、分化和矿化能力，以及破骨细胞的活力和分化能力 β磷酸三钙 (ββ-TCP圆盘。我们还测试了一种β-TCP/胶原（β-TCP/C）泡沫 ββ-TCP/胶原蛋白（β-TCP/C）ββ-TCP/C泡沫是一种临床用于骨修复的市售材料，本研究在临界尺寸颅骨骨缺损小鼠模型中评估其对骨愈合早期阶段的影响。在平行实验中，我们评估了小鼠的免疫和过敏反应。本方法通过一系列参数生成骨生物材料的生物学相容性谱型，这些参数对于预测用于患者骨愈合与修复的生物材料的生物相容性至关重要。

引言

骨修复是一个复杂的过程，始于血肿形成、炎症、骨痂形成，随后是重塑阶段。1,2然而，骨再生能力受限于骨折的大小1,3例如，由创伤、癌症或骨质疏松引起的大型骨骨折可能无法愈合，被称为骨不连骨折。这些骨病变通常需要治疗以促进正常的生理性骨修复与再生。目前，自体骨移植和同种异体骨移植是首选的治疗方法4 每年进行约220万例骨替代手术5尽管这些手术的成功率较高，但仍可能存在一些并发症，例如骨源有限、感染、供体部位并发症以及排斥反应4为应对这些挑战，人们正在寻求骨组织工程的新替代方案。

基于天然或合成聚合物、生物陶瓷或金属，并结合细胞和生物活性分子的生物材料设计正在迅速发展6。目前对生理性骨愈合以及在生物材料作用下的骨愈合过程的理解，依赖于多种因素，包括材料的机械性能，以及来自循环系统和骨折部位的多种局部和全身性因素7,8,9。用于骨再生的生物材料旨在促进成骨性和骨整合10，理想情况下应具备生物相容性、可生物降解性，并具有多孔结构（以促进细胞迁移、氧气和营养物质的输送）。此外，这些材料还需具备足够的强度以支撑骨折部位，缓解疼痛。同时，需要适当的炎症因子来启动愈合过程。然而，如果生物材料引发过度的炎症反应或过敏反应，则可能限制甚至抑制骨愈合11,12。因此，有必要采用跨学科方法来评估用于骨修复的生物材料。

本研究中，我们对代表性材料进行临床前评估：1）Orthovita Vitoss 泡沫，一种市售的松质骨替代材料，由纳米级纯β-磷酸三钙（β-TCP）构成 β磷酸三钙 (β-磷酸三钙（β-TCP）颗粒和I型牛胶原（C）（ββ-TCP/C 泡沫）和 2） ββ-TCP圆盘。在此，我们通过原代成骨细胞（OB）和破骨细胞（OC）实验，说明这些生物材料的生物相容性测试，以及一种 在体内 骨修复模型，以及包含免疫学评估的综合性分析 体外 T淋巴细胞增殖和细胞因子产生，以及 在体内 免疫原性和致敏性，如先前报道的那样13.

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方案

实验操作均采用 BALB/c 小鼠进行，遵循奥地利教育、科学和研究部关于《实验动物护理和使用指南》的所有规定，并经奥地利教育、科学和研究部伦理委员会批准。

1. 小鼠原代成骨细胞培养

  1. 通过酶消化法从新生小鼠颅骨中分离成骨细胞
    1. 通过断头法处死1–2日龄的新生小鼠（共60只），并将头部置于含有无菌1×磷酸盐缓冲液（PBS）的培养皿中。
    2. 用镊子夹住小鼠头部后颈部位，使用无菌剪刀剪开皮肤。用剪刀刺穿颅骨（深度约0.1–0.3 mm），然后将剪刀插入颅骨下方、颅底后部，沿耳上方的颅骨边缘从前向后剪开，再沿鼻梁上方剪开（图1）。
    3. 将分离的颅骨组织放入含有8 mL滤膜除菌消化液（含300单位/mL IV型胶原酶和2.14单位/mL dispase II，溶于α-最低必需培养基（α-MEM））的50 mL锥形管中，在37 °C、200次/分钟振荡培养箱中孵育10分钟。
    4. 弃去第一次上清液，用8 mL消化液重复消化三次。每次消化后收集含细胞的上清液，并转移至50 mL锥形管中。将装有细胞的锥形管置于冰水浴中保存，直至完成整个消化过程（约40分钟）。
    5. 在4 °C条件下以300 × g离心5分钟，吸除上清液（使用连接真空泵的巴斯德吸管），用40 mL成骨细胞生长培养基（BGM）重悬细胞，该培养基含α-MEM、10%热灭活胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素溶液。然后将10 mL细胞悬液分别加入4个组织培养板（10 cm直径）中。
    6. 在37 °C、5% CO2条件下培养细胞至融合（2–3天）。
    7. 细胞融合后，吸除旧培养基，用1× PBS（37 °C）洗涤培养板一次，再吸除PBS，并向每个10 cm培养板中加入2 mL含0.5%乙二胺四乙酸（EDTA）的1×胰蛋白酶溶液。
    8. 将4个培养板在37 °C、5% CO2条件下孵育5分钟，随后在倒置显微镜下观察，确认细胞已从塑料表面脱落。将所有细胞悬液（共8 mL）转移至含有10 mL新鲜BGM的50 mL锥形管中。用5 mL新鲜BGM洗涤每块培养板，并将洗液也转移至同一50 mL锥形管中。
    9. 在4 °C条件下以300 × g离心5分钟，吸除上清液，用16 mL新鲜BGM重悬细胞。准备16个新的10 cm组织培养板（按1:4比例传代），每板加入9 mL BGM，再向每板加入1 mL细胞悬液。
    10. 重复步骤1.1.6至1.1.8。
    11. 在4 °C条件下以300 × g离心5分钟，吸除上清液，用10 mL新鲜BGM重悬细胞。计数细胞并计算细胞浓度。
      注：该程序每只小鼠可获得约7.5–8.3 × 105个细胞。
    12. 在4 °C条件下以300 × g离心5分钟，吸除上清液，用冷冻保存液（含10%二甲基亚砜（DMSO）、40% α-MEM和50% FBS）重悬细胞。将1.5 mL细胞悬液分装至2 mL冻存管中，每管含2 × 106个细胞。
    13. 将冻存管在液氮中快速冷冻，长期保存于液氮罐中。建议在一年内使用，以确保细胞功能完整。这些原代成骨细胞可用于评估材料存在下的细胞增殖（步骤1.2）、分化（碱性磷酸酶检测：步骤1.4、1.5）和矿化（步骤1.6）。也可用于共培养体系中诱导骨髓来源破骨细胞前体的成熟（步骤2.3）。
  2. 成骨细胞增殖检测
    1. 在加入原代成骨细胞前，将直径14 mm的β-磷酸三钙（β-TCP）圆片预先置于24孔悬浮培养板中，每孔加入1 mL BGM，在37 °C、5% CO2条件下预孵育24小时。对照组使用标准组织培养板，实验组使用悬浮培养板，以避免细胞直接贴附于塑料表面。
    2. 吸除预孵育培养基，将原代小鼠成骨细胞用BGM重悬，按4.4 × 104个细胞/cm2的密度接种于预孵育后的β-TCP圆片上（置于24孔悬浮培养板中），对照组则接种于24孔组织培养板中（每孔1 mL）。成骨细胞将贴附于培养板或生物材料表面。
    3. 在37 °C、5% CO2条件下孵育14天。孵育期间每隔2–3天更换一次培养基，每孔加入1 mL新鲜BGM。
    4. 为评估成骨细胞增殖情况，在第7天和第14天将β-TCP圆片转移至新孔中，以排除悬浮培养板上生长细胞的信号干扰。
    5. 吸除旧培养基，每孔加入0.5 mL BGM（37 °C），在37 °C、5% CO2条件下孵育30分钟。然后直接向每孔加入55 µL 10倍浓缩的细胞增殖试剂（1:10稀释）。设空白对照组：准备三孔，每孔含0.5 mL BGM和55 µL 10倍浓缩的细胞增殖试剂。所有孔在37 °C、5% CO2条件下继续孵育30分钟。
    6. 从每孔吸取150 µL上清液转移至96孔黑色板中，在激发波长560 nm、发射波长590 nm条件下读取荧光值。从样品读数中扣除空白对照读数。
  3. 成骨细胞分化与矿化检测
    1. 在加入成骨细胞前，将直径14 mm的β-TCP圆片预先置于24孔悬浮培养板中，每孔加入1 mL BGM，在37 °C、5% CO2条件下预孵育24小时。对照组使用标准组织培养板，实验组使用悬浮培养板，以避免细胞贴附于塑料表面。
    2. 吸除预孵育培养基，将原代小鼠成骨细胞用BGM重悬，按8.8 × 104个细胞/cm2的密度接种于预孵育后的β-TCP圆片上（置于24孔悬浮培养板中），对照组接种于24孔组织培养板中（每孔1 mL）。成骨细胞将贴附于培养板或生物材料样品表面。
    3. 在接种成骨细胞24小时后，将BGM更换为1 mL成骨诱导矿化培养基（MM），该培养基含BGM、50 µg/mL抗坏血酸和5 mM β-甘油磷酸钠，在37 °C、5% CO2条件下孵育14天。每隔2–3天更换一次培养基，每孔加入1 mL新鲜配制的MM。
  4. 通过细胞裂解液检测碱性磷酸酶（ALP）活性评估成骨细胞分化 
    1. 在加入矿化培养基（MM）后第7天检测ALP活性：吸除孔中培养基，用1 mL无菌1× PBS（37 °C）洗涤一次。小心吸除PBS，确保贴壁细胞保留在组织培养板或生物材料表面，随后将培养板在-80 °C冷冻保存。
    2. 24小时后（或最长两周内），将对照组组织培养板和生物材料悬浮培养板在室温（RT）下解冻，准备进行成骨细胞裂解。对于生物材料样品，将β-TCP圆片转移至新的悬浮培养板中，以排除贴附于培养板上的细胞。向两块板的每孔加入75 µL 1×细胞裂解缓冲液，在400次/分钟振荡器上振荡5分钟。
    3. 将细胞裂解液转移至0.5 mL微量离心管中，在室温下以300 × g离心6分钟以去除碎片。取50 µL样品裂解液上清液加入96孔黑色板中，再向每孔加入50 µL含有200 µM 6,8-二氟-4-甲基伞形酮磷酸酯（DiFMUP）荧光底物的溶液（溶于2× ALP缓冲液，pH 10）。设置两个空白孔，每孔加入100 µL由1×细胞裂解缓冲液和2× ALP缓冲液按1:1配制的溶液。
    4. 配制8个参考标准品，每孔100 μL，使用6,8-二氟-7-羟基-4-甲基香豆素（DiFMU）溶液，浓度范围为0.5至200 μM，溶于1:1的1×细胞裂解缓冲液和2× ALP缓冲液混合液中，用于生成标准曲线。
    5. 将黑色板在37 °C孵育15分钟，随后在激发波长358 nm、发射波长455 nm条件下读取荧光值。从参考标准品和样品读数中扣除空白对照读数。
    6. 使用比色法测定蛋白浓度，将细胞裂解液中的ALP酶活性归一化为总蛋白含量。使用1×细胞裂解缓冲液配制牛血清白蛋白（BSA）蛋白标准品，浓度范围为0.05–2.5 µg/µL，用于生成标准曲线。
    7. 将样品细胞裂解液和BSA蛋白标准品设为复孔。向96孔板中每孔加入5 µL样品裂解液或5 µL BSA蛋白标准品，再加入25 µL试剂A’和200 µL试剂B。设置两个空白孔，每孔加入5 µL 1×细胞裂解缓冲液。室温孵育15分钟后，在690 nm波长下读取吸光度。从参考标准品和样品读数中扣除空白对照读数。
  5. 通过细胞培养染色法检测碱性磷酸酶（ALP）评估成骨细胞分化
    1. 在加入矿化培养基（MM）后第7天，对对照组组织培养板和悬浮培养板中的生物材料样品进行ALP染色 。
    2. 吸除孔中培养基，每孔加入0.5 mL 1× PBS（37 °C），随后吸除PBS，并在室温下用0.5 mL 10%缓冲福尔马林固定细胞1分钟。
    3. 用一次性移液管吸除10%缓冲福尔马林，每孔加入0.5 mL洗涤缓冲液（含0.05% Tween20的1× PBS）。
    4. 将一片5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐/硝基蓝四氮唑（BCIP/NBT）底物片剂溶于10 mL超纯水中，涡旋至完全溶解。溶液需避光保存，并在2小时内使用。
    5. 吸除洗涤缓冲液，每孔加入0.5 mL BCIP/NBT底物溶液，在室温避光条件下孵育10分钟。吸除染色液，每孔加入0.5 mL洗涤缓冲液。
    6. 将染色后的β-TCP圆片转移至新孔中，使用常规平板扫描仪扫描ALP染色结果，记录图像。
  6. 通过茜素红S（ARS）染色评估成骨细胞矿化
    1. 在加入矿化培养基（MM）14天后，吸除含原代成骨细胞的孔中培养基，用0.5 mL 1× PBS在室温下冲洗两次。吸除PBS，每孔加入0.5 mL 10%缓冲福尔马林溶液，在室温下固定10分钟。
    2. 用一次性移液管吸除10%缓冲福尔马林，用0.5 mL超纯水洗涤两次。
    3. 向固定的成骨细胞中每孔加入0.25 mL 40 mM茜素红S染色液（pH 4.2，溶于超纯水），在室温、100次/分钟振荡条件下孵育10分钟。
    4. 用一次性移液管吸除染色液，每孔用1 mL超纯水冲洗。重复此步骤5–10次，以去除非特异性染色。
      注：冲洗液应无颜色。
    5. 吸除超纯水，每孔加入1 mL冷PBS，在室温、100次/分钟振荡条件下孵育10分钟。
    6. 吸除PBS，将染色后的β-TCP圆片转移至新孔中，使用平板扫描仪扫描记录矿化情况。
    7. 每孔加入0.25 mL 10%十六烷基吡啶氯化物溶液，在室温、100次/分钟振荡条件下孵育15分钟，以提取ARS染料。
    8. 将上清液转移至1.5 mL离心管中，在室温下以17,000 × g离心5分钟。
    9. 用10%十六烷基吡啶氯化物溶液将提取物按1:10–1:20比例稀释，取300 µL样品加入96孔板中，设两个空白孔，仅含10%十六烷基吡啶氯化物溶液 。
    10. 通过将40 mM ARS染色液（pH 4.2）用10%十六烷基吡啶氯化物溶液稀释，配制7个ARS参考标准品，浓度范围为4至400 µM，用于生成标准曲线。
    11. 将参考标准品设为复孔，每孔加入300 µL。
    12. 在520 nm波长下读取样品、空白对照和参考标准品的吸光度。
    13. 从参考标准品和样品读数中扣除空白对照读数。

2. 小鼠成骨细胞-破骨细胞共培养以获得成熟破骨细胞

  1. 牛皮质骨片的制备与灭菌
    1. 清除骨段周围的组织，并去除松质骨和骨髓。
    2. 在50 °C下将骨干燥24小时。
    3. 将骨切成较小块状，使用带金刚石刀片的低速锯将其切割成约300–350 µm厚的薄片。
    4. 将300–350 µm厚的骨片切割成方形圆盘（1 cm2）。
    5. 为清洗骨圆盘（1 cm2），将其放入可密封的玻璃瓶中，并加入蒸馏水。将装有骨片的玻璃瓶置于超声波清洗仪中，超声处理5分钟。重复此步骤三次。
    6. 倒去蒸馏水，加入70%乙醇，超声处理5分钟。
    7. 倒去70%乙醇，更换为100%乙醇。
      注：骨片可在100%乙醇中4 °C保存最多4周。
    8. 在无菌条件下，用紫外光对骨片两面各照射15分钟。将灭菌后的骨片存放于无菌培养板中，室温保存，待后续使用。
  2. 骨髓破骨细胞前体的分离
    1. 通过腹腔（i.p.）注射200 mg/kg氯胺酮和24 mg/kg赛拉嗪的混合溶液，处死8–12周龄的未处理BALB/c小鼠。
    2. 从小鼠股骨和胫骨中分离骨髓破骨细胞前体。
    3. 使用无菌剪刀从髋关节最靠近身体的位置剪下后肢，于膝关节和踝关节处切断，并用无菌手术刀和镊子去除软组织。切除骨骺端。使用连接27G针头的1 mL注射器，以1 mL BGM冲洗并悬浮骨髓，将其收集至6 cm无菌培养皿中，以获得细胞悬液。
    4. 将细胞悬液转移至50 mL锥形管中，用5 mL BGM冲洗6 cm培养皿，并将冲洗液也转移至同一50 mL锥形管中。在4 °C下以350 x g离心5分钟。将细胞重悬于含BGM、1 nM 1,25-(OH)2-维生素D3和1 µM前列腺素E2的破骨细胞分化培养基（DM）中（1 mL/孔）。
      注：一只BALB/c小鼠提供的破骨细胞前体细胞数量足以用于一块24孔 培养板。
  3. 含生物材料的小鼠成骨细胞-破骨细胞共培养体系的建立
    1. 在加入细胞前，将直径14 mm的β-磷酸三钙（β-TCP）圆盘或牛骨片（1 cm2）置于24孔悬浮培养板中，加入1 mL BGM，在37 °C、5% CO2条件下预孵育24小时。
      注：牛骨片作为生理基质 对照组，用于研究生物材料存在下破骨细胞的分化情况。
    2. 将悬浮于BGM中的原代成骨细胞以8.8 x 104 细胞/cm2的密度接种至24孔悬浮培养板中的生物材料或对照骨片上，或接种至24孔组织培养板中。在37 °C、5% CO2条件下孵育24小时。
      注：成骨细胞会附着于塑料表面、生物材料或牛骨上。
    3. 将新鲜分离的骨髓破骨细胞前体加入已培养24小时的原代成骨细胞中，在37 °C、5% CO2条件下继续培养5天。每隔一天更换一次新配制的破骨细胞分化培养基（DM）。随后对破骨细胞进行抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色，以评估其分化情况。
  4. 通过TRAP染色评估破骨细胞分化
    1. 为鉴定来自步骤2.3.3的成熟多核破骨细胞，吸除对照组织培养板和生物材料悬浮培养板中的培养基，加入1 mL 1x PBS（37 °C）。吸除PBS后，在室温下用1 mL 10%缓冲福尔马林溶液固定细胞10分钟。
    2. 使用一次性移液器吸除10%缓冲福尔马林溶液，加入1 mL 1x PBS（室温）。重复此步骤三次，然后吸除PBS，替换为1 mL TRAP缓冲液（pH 5），并将培养板在37 °C孵育30分钟。
    3. 吸除TRAP缓冲液，加入1 mL丙酮与100%乙醇的1:1混合液。在室温下孵育30秒。迅速使用一次性移液器吸除丙酮-乙醇混合液，并在室温下将培养板完全干燥。
    4. 配制TRAP染色液：将萘酚-AS-MX磷酸盐配制成10 mg/mL的N,N-二甲基甲酰胺储备液；将快红紫盐溶解于TRAP缓冲液中至终浓度0.6 mg/mL；取0.1 mL萘酚-AS-MX磷酸盐储备液加入10 mL含快红紫盐的TRAP缓冲液中。
    5. 每孔加入1 mL TRAP染色液，在37 °C孵育10分钟，随后吸除染色液，加入1 mL超纯水以终止反应。
    6. 染色后，将β-TCP圆盘和牛骨片转移至新孔中，使用光学显微镜（放大倍数：10X）观察红色染色的破骨细胞，并计数含有三个或更多细胞核的TRAP阳性成熟破骨细胞。

3. 小鼠颅骨临界尺寸缺损模型

  1. 皮下注射（s.c.）0.1 mg/kg 布托啡诺至8周龄 BALB/c 小鼠以进行镇痛。
  2. 用腹腔注射 100 mg/kg 氯胺酮和 5 mg/kg 噻拉嗪的混合物麻醉小鼠，将凝胶或软膏涂抹于眼睛以保持湿润，并将小鼠置于加热板上 37 °C 在整个手术过程中注意保温以防止低体温。通过脚趾和尾部夹捏评估麻醉深度。
  3. 在耳朵之间的头顶部位剃毛，并用7.5%聚维酮碘溶液和70%乙醇清洁表面。
  4. 用无菌手术刀在两耳之间沿颅顶正中矢状方向做一切口，暴露颅骨，并用手术刀刮除右顶骨上方的颅骨骨膜结缔组织。
  5. 使用无菌牙科环钻（直径 4 mm，2000 rpm）在右顶骨上制造一个临界尺寸缺损，操作过程中持续用生理盐水冲洗，以切 notch 右顶骨并穿透外板及部分内板。
  6. 为防止损伤硬脑膜，使用小型骨膜剥离器穿透残留的内层骨皮质，小心抬起颅骨并用镊子将其移除。所形成的缺损应呈圆形，直径约为3.5 mm。
  7. 用预湿（室温下无菌 1x PBS）的材料填充颅骨缺损 β使用镊子夹取β-TCP/C泡沫。
  8. 准备适当数量的年龄匹配的假手术阴性对照组，设置空缺损。
  9. 为了固定生物材料，放置 0.5 µL 在缺损边缘的两个对侧点处涂抹组织粘合剂。
  10. 使用不可吸收缝线缝合皮肤。
  11. 用冷灭菌剂清洁所有手术器械 在对麻醉小鼠进行下一台手术前，需保持无菌条件。
  12. 术后处理时，将动物置于干燥、清洁的加热板上 37 °C 在手术区域进行适当监测，直至恢复期结束。每10分钟监测一次呼吸频率、体温以及黏膜和眼睛的颜色，直至动物苏醒。
  13. 将术后清醒的小鼠转移至单独的笼子中，提供食物和水，并与其它动物隔离，直至完全恢复。术后72小时内，每天两次皮下注射0.1 mg/kg的丁丙诺啡进行镇痛治疗。待小鼠完全恢复后，将其放回原笼。
  14. 为评估生物材料的有效性，通过腹腔注射200 mg/kg氯胺酮和24 mg/kg赛拉嗪溶液处死小鼠。
  15. 在植入后8–12周，使用锋利的剪刀将安乐死的小鼠断头。
  16. 将小鼠头部放入30 mL 4.5%缓冲甲醛溶液中固定1-2周，以确保固定液充分渗透至组织内部。
  17. 将头部转移至70%乙醇中，用于长期保存 4 °C 长达一年。
  18. 使用微型计算机断层扫描（microCT）或标准化的未脱钙组织学技术评估骨再生。可在死后样本上以高分辨率（90 kV，4 分钟）进行 microCT 扫描，获取二维和三维的矢状面与冠状面图像。
  19. 对于非脱钙组织学，将头部组织用梯度乙醇脱水，并包埋于甲基丙烯酸甲酯-乙二醇二甲基丙烯酸酯中。
  20. 用金刚石锯切割甲基丙烯酸甲酯包埋的组织块，并将切片研磨至厚度约为80–100 µm.
  21. 评估经Levai Laczko染色的骨组织切片以鉴定新骨形成14.

4. 体外实验 免疫反应

  1. 腹腔注射200 mg/kg氯胺酮和24 mg/kg赛拉嗪，处死8周龄未处理的BALB/c小鼠。
  2. 将小鼠置于右侧卧位，剃除左侧体表的毛发，并用70%乙醇清洁腹部左侧的皮肤。
  3. 使用无菌剪刀沿左侧腹部后方肋骨走向，在小鼠皮肤上做一个10 mm长、1 mm深的切口。
  4. 切开皮肤，暴露腹膜。使用器械在腹膜上做一个长约10 mm、深度小于1 mm的切口。 在无菌条件下使用剪刀。
  5. 将胃向上推移以暴露脾脏。
  6. 用无菌镊子轻轻夹住脾脏，并剪断其下方附着的组织和血管以切除脾脏。
  7. 将完整的脾脏放入含有10 mL冷的1x无菌PBS的50 mL离心管中。
  8. 使用两把无菌镊子或两片无菌载玻片剪碎脾脏，制备单细胞悬液。
  9. 用无菌滤器去除碎片 40 µm 使用1 mL注射器的推杆，用冷的1×PBS冲洗细胞筛。
  10. 将单细胞悬液以 300 x g 10 分钟 4 °C 在50 mL锥形管中，吸去并弃去上清液。然后用5 mL红细胞（RBC）裂解缓冲液重悬细胞沉淀。
  11. 将细胞悬液在室温下孵育14分钟，并加入45 mL Roswell Park Memorial Institute（RPMI）培养基以终止反应。
  12. 细胞裂解后，以 300 x g 10 分钟 4 °C 然后弃去上清液。
  13. 将脾细胞重悬于RPMI中 含10%热灭活胎牛血清、1%青霉素-链霉素溶液、0.1%庆大霉素、0.2% β-巯基乙醇和1%非必需氨基酸的培养基
  14. 预孵育 β-在含有RPMI培养基的96孔无菌培养板中孵育β-TCP/C泡沫材料24小时 37 °C 和 5% CO₂2 细胞接种前
  15. 以滴定数量加入脾细胞， 例如，1.25 × 105，2.5 × 105 和 5 × 105/孔至含RPMI培养基及添加剂的96孔组织培养板中的各孔，可选择是否加入预孵育 ββ-TCP/C 泡沫
  16. 添加 10 µg/mL 刀豆球蛋白A（Con A）溶于培养基中，总体积为 100 µL/well 加入适量孔中，然后在 37 °C 和 5% CO2 72 小时
  17. 使用溴脱氧尿苷（BrdU）检测法测定细胞增殖。加入 10 µL/well 在细胞培养48小时时加入BrdU标记溶液，然后将培养板继续孵育24小时。
  18. 72 小时后，收集上清液并保存于 -20 °C 直至进一步使用。
  19. 添加 200 µL/well 向每孔加入固定液，然后在室温下孵育30分钟。吸除固定液。加入 100 µL/well 加入抗BrdU抗体工作液，孵育90分钟。
  20. 吸弃抗体溶液，用200–300 µL/well 洗液的用量及去除洗液。
  21. 添加 100 µL 加入底物溶液，在室温下孵育3–10分钟，然后在450 nm处测定吸光度。
  22. 测量白细胞介素-1β (IL-1β）、白细胞介素-2（IL-2）、白细胞介素-4（IL-4）和干扰素-γ (IFN-γ使用标准ELISA法检测收集的上清液中的目标分子。

5. 高通量腹腔注射模型

  1. 用腹腔注射 100 mg/kg 氯胺酮和 5 mg/kg 赛拉嗪的混合物麻醉 6-8 周龄雌性 BALB/c 小鼠，并在小鼠眼睛上涂抹凝胶或软膏以保持湿润，然后将小鼠置于加热板上 37 °C 在整个手术过程中注意保温以防止低体温。通过脚趾和尾部夹捏评估麻醉深度。
  2. 剃除腹部毛发，并用7.5%聚维酮碘溶液和70%乙醇清洁。
  3. 沿腹白线做一条8 mm长的正中切口穿过皮肤。使用手术刀对腹膜做一小切口。
  4. 将无菌 PBS 浸润的 ββ-TCP/C 泡沫移植物（2×2×2 mm）3) 注射至腹膜腔，或对同龄假手术对照小鼠不添加任何材料。
  5. 分别使用可吸收和不可吸收缝线缝合腹膜和皮肤。
  6. 用肥皂水彻底清洗所有外科手术器械，并用清水冲洗干净。 冷灭菌剂 在对麻醉小鼠进行下一台手术前，需保持无菌条件。
  7. 术后处理时，将动物置于干燥、清洁的加热板上 37 °C 在手术区域进行适当监测，直至恢复期结束。每10分钟监测一次呼吸频率、体温以及黏膜和眼睛的颜色，直至动物苏醒。
  8. 将术后清醒的小鼠转移至单独的笼子中，提供食物和水，并与其它动物隔离饲养，直至完全恢复。待小鼠完全恢复后，将其放回原有笼具。
    注意：该操作仅引起轻微疼痛。术后镇痛治疗通常无需进行。若手术动物出现疼痛症状，可皮下注射0.1 mg/kg布托啡诺（buprenorphine）或其他适当的镇痛药物以缓解疼痛。
  9. 在植入后第7天，通过腹腔注射200 mg/kg氯胺酮和24 mg/kg赛拉嗪溶液处死小鼠。
  10. 在植入后第7天，使用带25G针头的1 mL注射器冲洗腹腔 通过将小鼠头部朝下，并将针头插入左下腹象限并朝近端方向推进，注入总共 3 mL 的冷 PBS。
    注意：腹膜液应无红细胞。
  11. 以 300 x g 离心腹腔灌洗液 g 5分钟 4 °C 并收集腹腔液，于 -20 °C 用于IL-1的ELISA检测βIL-2 和 IL-4 细胞因子
  12. 吸弃上清液，用1 mL PBS重悬细胞沉淀，并使用血细胞计数板结合台盼蓝对腹腔细胞进行计数。
  13. 以细胞悬液在 5 x 105 将细胞接种至玻片上，待玻片干燥后进行差异细胞计数染色。
  14. 使用光学显微镜，总计数不少于300个细胞，并区分巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和淋巴细胞。

6. 亚慢性皮下模型

  1. 使用100 mg/kg氯胺酮和5 mg/kg甲苯噻嗪腹腔注射麻醉6–8周龄雌性BALB/c小鼠，在眼睛上涂抹凝胶或软膏以保持湿润，并在整个手术过程中将小鼠置于37 °C加热板上以防止低体温。通过夹捏脚趾和尾巴评估麻醉深度。
  2. 将小鼠仰卧放置，剃除腹部毛发，并用7.5%聚维酮碘溶液和70%乙醇清洁剃毛区域。
  3. 使用手术刀沿腹部白线做一条8 mm长的正中切口，然后将PBS浸泡过的生物材料（2×2×2 mm3）植入皮下，或对年龄匹配的假手术对照组小鼠不植入任何材料。
  4. 使用不可吸收缝线缝合皮肤。
  5. 在对下一只麻醉小鼠进行手术前，用冷灭菌剂清洁所有手术器械 以维持无菌条件。
  6. 术后处理时，将动物置于手术区域中37 °C干燥洁净的加热板上，以便在恢复期间进行适当监测。每10分钟监测一次呼吸频率、体温以及黏膜和眼睛的颜色，直至其苏醒。
  7. 将术后恢复意识的小鼠转移到单独的笼子中，提供食物和水，并与其他动物隔离，直至完全恢复。待小鼠完全恢复后，将其放回原笼具。
    注意：该操作引起的疼痛极小，通常无需术后镇痛治疗。若动物出现疼痛迹象，可皮下注射0.1 mg/kg丁丙诺啡或其他适当的镇痛药。
  8. 当准备检查植入部位时，使用200 mg/kg氯胺酮和24 mg/kg甲苯噻嗪腹腔注射处死小鼠。
  9. 植入后八周，连同周围组织（1 cm2）一并切除植入部位。
  10. 将组织在4.5%缓冲福尔马林溶液中固定过夜，包埋于石蜡中，并切成4 µm厚的切片。
  11. 使用苏木精和伊红（H&E）染色4 µm石蜡包埋组织切片以评估炎症，或使用Masson三色染色法检测胶原沉积和纤维化。

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结果

为了评估β-TCP作为骨修复生物材料的有效性，我们采用了 体外 和 体内 筛选方法。首先，我们检测了OB对β-TCP圆片的反应，并与仅含基础培养基的对照组进行比较。 图2 展示了成骨细胞（OB）在培养第7天和第14天对β-TCP圆片的存活情况。通过测定培养孔中代谢活跃细胞的活性，发现含β-TCP圆片的成骨细胞与仅含组织培养塑料中培养基的成骨细胞的细胞活力相当，表明该生物材料既不促进也不抑制成骨细胞的增殖。

为了进一步评估成骨细胞（OBs），我们采用定性和定量方法检测碱性磷酸酶（ALP）活性，作为细胞分化的标志。图2展示了培养7天后各培养孔中ALP酶的活性。仅含基础培养基的孔中OBs的ALP活性处于基线水平，而在最佳矿化培养基（MM）中，OBs表现出强烈的ALP染色，反映出高水平的成骨细胞分化。相比之...

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讨论

在此，我们展示了一种多学科方法，用于对代表性骨再生与修复生物材料进行临床前生物相容性评估。我们检测了成骨细胞（OB）、破骨细胞（OC）以及免疫系统对这些材料的反应。 体内 在小鼠关键骨缺损模型中的愈合反应以及 体外 和 体内 免疫反应。本文旨在展示这些检测方法的操作流程，并总结从生物材料检测中获得的数据与结论。结果表明，本研究策略能够生成有价值的骨生物材料生物相容性谱型。

采用原代细胞实验评估成骨细胞（OB）和破骨细胞（OC）功能。OB 负责骨形成及生理性修复，必须保持活性，并能够分化和诱导矿化。本研究展示了如何开展细胞活力、碱性磷酸酶（ALP）和茜素红 S（ARS）染色实验，以检测具有矿化能力的生理性分化细胞。实验设置两种对照：仅含培养基的对照组用于提供基线值，成骨矿化培养基（MM）对照组则用于在塑料培养表面优化 OB 的分化与矿化，后者作为生物材料的参照标准。对于 OC 的评估，我们共培养 OB 与骨髓来源的 OC 前体细胞，诱导前体细胞分化为多核细胞，并使用抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色，该酶是广泛用于鉴定 OC 的破...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究项目获得了欧盟第七个框架计划（FP7/2007-2013）资助，资助协议编号为263363。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
生物材料
β-磷酸三钙圆盘（ββ-TCP，14 mm将圆盘置于马弗炉中，在特定温度下进行烧结 1150 °C详细的制备方法可参见 Zimmer 等人（doi: 10.1002/jbm.a.34639）。样品在用于细胞培养前需经紫外线照射（每侧 15 分钟）。
Orthovita Vitoss 泡沫ββ-TCP/C 泡沫Orthovita2102-1405
小鼠成骨细胞培养
茜素红 SSigma-AldrichA5533
ALP 检测缓冲液（2x），pH 10.4将200 mM甘氨酸、2 mM氯化镁、2 mM氯化锌溶解于超纯水中，并调节pH至10。
骨生长培养基 (BGM)α- MEM + 10% 热灭活 FBS + 1% 青霉素/链霉素
细胞裂解缓冲液：CyQuant 细胞裂解缓冲液 20x 浓缩液Thermo ScientificC7027将浓缩的细胞裂解缓冲液原液用超纯水稀释20倍。 
细胞活力试剂：Presto Blue 细胞活力试剂Invitrogen，Thermo Fisher ScientificA13261
产气荚膜梭菌来源的 IV 型胶原酶Sigma-AldrichC5138
DC 蛋白检测试剂盒 IIBio Rad5000112DC 蛋白检测试剂盒包含试剂 A、试剂 B、试剂 S 以及用于参考标准的 BSA。对于试剂 A'，添加 20 µL 试剂S至 1000 µL 试剂A 
二甲基亚砜（DMSO）Sigma-AldrichD8418使用前对DMSO进行除菌过滤。 
Dispase II（中性蛋白酶，II 型）罗氏4942078001
EnzCheck 碱性磷酸酶活性检测试剂盒 Invitrogen，Thermo Fisher ScientificE12020EnzCheck 磷酸酶检测试剂盒包含 6,8-二氟-4-甲基伞形基磷酸盐（DiFMUP）、N,N-二甲基甲酰胺和 6,8-二氟-7-羟基-4-甲基香豆素（DiFMU）。 
胎牛血清（FBS）Sigma-AldrichF7524
10% 中性缓冲福尔马林溶液Sigma-AldrichHT501128
甘氨酸Sigma-AldrichG8898
十六烷基吡啶氯化物（西曲氯铵）一水合物Sigma-AldrichC9002
L-抗坏血酸-2-磷酸三镁盐水合物Sigma-AldrichA8960
六水合氯化镁Sigma-AldrichM2670
MEM α 培养基（α-MEMGibco Life Technologies 11900-073
成骨矿化培养基（MM）α-MEM + 10% 热灭活 FBS + 1% 青霉素-链霉素 + 50 µg/mL 抗坏血酸 + 5 mM β-甘油磷酸盐
青霉素-链霉素  Sigma-AldrichP4333
磷酸盐缓冲液 1x (PBS) pH 7.4Gibco，赛默飞世尔科技 10010023
Sigmafast BCIP/NBTSigma-AldrichB5655
胰蛋白酶-EDTA（0.5%），无酚红（10倍浓缩液）Gibco，Thermo Fisher Scientific 15400054将浓缩的储备液用1×PBS稀释10倍。 
Tween20Sigma-AldrichP1379
超纯水：无热原细胞培养用水VWRL0970-500
洗涤缓冲液添加  0.05% Tween20 加至 1x PBS
氯化锌Sigma-Aldrich1.08816
β二水合β-甘油磷酸二钠盐Sigma-AldrichG5422
24孔悬浮培养板Greiner bio-one662102
24孔细胞培养板Greiner bio-one662160
50 mL 三角锥形管Greiner bio-one227261
96孔黑色板Greiner bio-one655076
96孔透明板Greiner bio-one655001
离心机：VWR Mega Star 600RVWR
CO2培养箱：HeraCell 240Thermo Scientific
2 mL 冻存管Greiner bio-one122263
一次性滤器单元 FP30/0.2 CA-SGE Healthcare Life Sciences Whatman10462200用于酶溶液的无菌过滤。
平板扫描仪：Epson Perfection 1200 PhotoEpson
Infinite M200 Pro 微孔板读板仪Tecan
微量离心管：Eppendorf管，安全锁扣，0.5 mLVWR20901-505
微量离心管：Eppendorf管安全锁 1.5 mLVWR21008-959
Shaker Swip（轨道式和水平式） Edmund Buehler 
GFL3032 摇床培养箱GFL 3032
一次性移液管：血清移液管Greiner bio-one612301
无菌器械（剪刀、镊子、弯头止血钳）
组织培养板（10 cm）Greiner bio-one664960
小鼠成骨细胞-破骨细胞共培养
1α1,25-二羟基维生素D3Sigma-Aldrich179361000倍浓缩储备液（10 µM 在100%乙醇中
丙酮VWR Chemicals22065.327
骨生长培养基（BGM）α- MEM + 10% 热灭活 FBS + 1% 青霉素-链霉素
蒸馏水Carl Roth3478.4
乙醇（100% vol/vol）VWR Chemicals20821.365
乙醇（70% vol/vol）VWR Chemicals93003.1006
快红紫 LB 盐Sigma-AldrichF3381
胎牛血清（FBS）Sigma-AldrichF7524
10% 中性缓冲福尔马林溶液Sigma-AldrichHT501128
MEM α 培养基（α-MEMGibco Life Technologies 11900-073
N,N-二甲基甲酰胺Sigma-AldrichD4551
萘酚AS-MX磷酸盐Sigma-AldrichN4875
破骨细胞分化培养基（DM）α- MEM + 10% 热灭活 FBS + 1% 青霉素-链霉素 + 1 nM 1,25-(OH)2-维生素D3 + 1 µM 前列腺素 E2 
青霉素-链霉素 Sigma-AldrichP4333
磷酸盐缓冲液 1x (PBS) pH 7.4Gibco，Thermo Fisher Scientific 10010023
前列腺素 E2 (PGE2)Cayman Chemical Company90030161000倍浓缩储备液（1 mM，溶于100%乙醇）
三水合醋酸钠Sigma-AldrichS7670
酒石酸钠二水合物Sigma-AldrichS8640
无菌器械（剪刀、镊子、手术刀）
TRAP 缓冲液 pH 5.0将40 mM醋酸钠、10 mM酒石酸钠溶于超纯水中，并调节pH至5。
超纯水：无热原细胞培养用水VWRL0970-500
24孔悬浮培养板Greiner bio-one662102
24孔细胞培养板Greiner bio-one662160
50 mL 离心管Greiner bio-one227261
离心机：VWR Mega Star 600RVWR
CO2培养箱：HeraCell 240Thermo Scientific
金刚石切片刀（10.2 cm × 0.3 cm）Buehler
Isomet低速锯Buehler
培养皿（6 cm）Greiner bio-one628,161
20 mL 螺口玻璃瓶Carl RothEXY4.1
一次性无菌注射器 1 mLHenry Schein Animal Health9003016
一次性移液管：血清移液管Greiner bio-one612301
无菌针头：27号G规格×3/4英寸一次性注射针Henry Schein 动物保健9003340
小鼠颅骨缺损模型
镇痛：布托啡诺（Bupaq）Richter Pharma AG
麻醉：氯胺酮（Ketamidor），赛拉嗪（Rompun）Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
冷灭菌剂：SafeSept MaxHenry Schein Animal Health9882765
乙醇（70% vol/vol）VWR Chemicals93003.1006
眼膏：VitA POS 5 gUrsapharm
生理盐水溶液（0.9%氯化钠溶液）Fresenius Kabi
磷酸盐缓冲液 1x (PBS) pH 7.4Gibco，赛默飞世尔科技 10010023
聚维酮碘溶液：Braunol 1000 mLB. Braun3864154
Roti-Histofix 4.5% 缓冲甲醛Carl Roth2213.6
组织粘合剂：Histoacryl 5 × 0.5 mL B. Braun Surgical1050060
个人防护装备：外科手套、帽子和口罩、防护服Henry Schein Animal Health1045073, 1026614, 9009062, 370406
无菌器械（手术刀、剪刀、镊子、持针器）
无菌针头：27 号 3/4 英寸和 30 号 1/2 英寸皮下注射针头 Henry Schein Animal Health9003340, 9003630
一次性无菌注射器 1 mLHenry Schein Animal Health9003016
加热板：PhysitempRothacher MedicalTCAT-2LV
无菌纱布拭子Henry Schein Animal Health220192
无菌一次性手术刀（图20）Henry Schein Animal Health9008957
外科/牙科钻机：Implantmed SI-923W&H Dentalwerk Bürmoos GmbH16929000
S-II型手柄W&H Dentalwerk Bürmoos GmbH30056000
直径4 mm的环钻Hager&Meisinger GmbH229040
灌注管路套装 2.2 mW&H Dentalwerk Bürmoos GmbH4363600
骨膜剥离器 2 mm / 3 mmHenry Schein 动物健康472683
不可吸收缝线：聚酯绿线，DS19，针长 1.5，USP 4/0，75 cmHenry Schein Animal Health300715
体外 免疫反应
安乐死麻醉剂：氯胺酮（Ketamidor）、赛拉嗪（Rompun）Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
细胞增殖ELISA，BrdU（比色法）检测试剂盒Sigma-Aldrich11647229001试剂盒包含 BrdU 标记液、固定液（FixDenat）、抗 BrdU 抗体溶液、洗涤缓冲液和底物溶液。 
刀豆蛋白A（ConA）MP Biomedicals150710
培养基 脾细胞RPMI 培养基 + 10% 热灭活 FBS + 1% 青霉素-链霉素溶液 + 0.1% 庆大霉素 + 0.2% ß-巯基乙醇 + 1% 非必需氨基酸
乙醇（70% vol/vol）VWR Chemicals93003.1006
胎牛血清（FBS）Gibco，Thermo Fisher Scientific 10500064
庆大霉素Gibco，Thermo Fisher Scientific 15750037
小鼠 IL-1β ELISA Ready-SET-Go!Invitrogen，Thermo Fisher Scientific88-7013-88
小鼠 IL-2 ELISA MAX 标准品BioLegend431001
小鼠 IL-4 ELISA MAX 标准品BioLegend431101
小鼠 INF-γ ELISA MAX 标准品BioLegend430801
非必需氨基酸溶液Gibco，Thermo Fisher Scientific 11140050
青霉素-链霉素 Gibco，赛默飞世尔科技 15140122
磷酸盐缓冲液 1x (PBS) pH 7.4Gibco，Thermo Fisher Scientific 10010023
红细胞（RBC）裂解缓冲液：BD Pharm LyseBD Bioscience555899
RPMI 1640 培养基，HEPESGibco，赛默飞世尔科技 52400025
β-巯基乙醇Gibco，赛默飞世尔科技 31350010
50 mL 锥形管Greiner bio-one227261
96孔组织培养板Greiner bio-one655180
离心机：VWR Mega Star 600RVWR
细胞筛 40 µmBD Bioscience352340
Infinite M200 Pro 微孔板读板机Tecan
一次性无菌注射器 1 mLHenry Schein 动物健康9003016
无菌手术器械（镊子、载玻片）
高通量腹腔注射模型
麻醉：氯胺酮（Ketamidor），赛拉嗪（Rompun）Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
冷灭菌剂：SafeSept MaxHenry Schein Animal Health9882765
乙醇（70% vol/vol）VWR Chemicals93003.1006
眼膏：VitA POS 5 gUrsapharm
小鼠 IL-1β ELISA Ready-SET-Go!Invitrogen，Thermo Fisher Scientific88-7013-88
小鼠 IL-2 ELISA MAX 标准品BioLegend431001
小鼠 IL-4 ELISA MAX 标准品BioLegend431101
磷酸盐缓冲液 1x (PBS) pH 7.4Gibco，Thermo Fisher Scientific 10010023
聚维酮碘溶液：Braunol 1000 mLB. Braun3864154
Shandon Rapid-Chrome Kwik-Diff 染色试剂盒赛默飞世尔科技9990700用于细胞分类计数。
加热板：PhysitempRothacher MedicalTCAT-2LV
血细胞计数板：Neubauer 计数室Carl RothPC72.1
不可吸收缝合线：Ethibond Excel 4-0Ethicon6683H
可吸收缝合线：PolysorbCovidienSL-5628
Shandon 离心机用于细胞涂片Thermo Scientific
一次性无菌注射器 1 mLHenry Schein Animal Health9003016
无菌纱布拭子Henry Schein 动物健康220192
无菌针头：27 号 RW 27 G × 3/4″ 和 25 G 皮下注射针头Henry Schein 动物健康9003340, 420939
无菌手术器械（手术刀、剪刀、镊子、持针器）
0.4% 台盼蓝溶液Gibco，赛默飞世尔科技 15250061
亚慢性皮下模型
麻醉剂：氯胺酮（Ketamidor），赛拉嗪（Rompun）Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
冷灭菌剂：SafeSept MaxHenry Schein Animal Health9882765
乙醇（70% vol/vol）VWR Chemicals93003.1006
眼膏：VitA POS 5 gUrsapharm
磷酸盐缓冲液 1x (PBS) pH 7.4Gibco，Thermo Fisher Scientific 10010023
聚维酮碘溶液：Braunol 1000 mLB. Braun3864154
Roti-Histofix 4.5% 缓冲甲醛Carl Roth2213.6
加热板：PhysitempRothacher MedicalTCAT-2LV
不可吸收缝合线：Ethibond Excel 4-0Ethicon6683H
个人防护装备：外科手套、帽子和口罩、防护服Henry Schein Animal Health1045073, 1026614, 9009062, 370406
一次性无菌注射器 1 mLHenry Schein Animal Health9003016
无菌纱布拭子Henry Schein Animal Health220192
无菌器械（手术刀、剪刀、镊子、持针器）
无菌针头：27 号 3/4 英寸一次性使用注射针 Henry Schein Animal Health9003340, 420939

参考文献

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骨再生用生物材料的生物学相容性评价
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