本文介绍了一种在离体灌注小鼠心脏上进行多聚核糖体分析的实验方案。我们描述了心脏灌注、多聚核糖体分析的方法，以及针对多聚核糖体组分中mRNA、miRNA和多聚核糖体蛋白质组的分析方法。
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本文内容
摘要
摘要
研究蛋白质翻译的动态变化需要专门的方法。本文利用离体灌流小鼠心脏结合多聚核糖体分析技术，检测了在缺血和再灌注过程中新合成蛋白质的变化。为了进一步理解蛋白质翻译的动态变化，我们对负载在细胞质核糖体（多聚核糖体或多聚体）上的 mRNA 进行了表征，同时还分离了线粒体多聚核糖体，并比较了在高效翻译组分（mRNA 上结合多个核糖体）、低效翻译组分（结合较少核糖体，也包括线粒体多聚核糖体）以及非翻译组分中 mRNA 和蛋白质的分布情况。microRNA（miRNA）也可与正在翻译的 mRNA 结合，从而降低翻译效率；因此，我们还分析了 miRNA 在各组分中的分布。我们在基础灌流状态、30 分钟全无灌注缺血末期以及再灌注 30 分钟后，分别检测了 mRNA、miRNA 和蛋白质的分布情况。本文展示了完成该分析所使用的方法，特别是蔗糖梯度中蛋白质提取的优化策略——此前尚未见相关报道——并提供了一些代表性结果。
引言
心脏以动态方式对缺血（I）和再灌注（R）损伤作出反应。然而，目前对这一反应过程中蛋白质合成的急性变化仍缺乏深入了解。为解决这一问题，我们采用了已建立的多聚核糖体谱分析方法1，以鉴定反映核糖体和翻译调控因子从细胞质重新分布至多聚核糖体、以及新合成蛋白质（NSPs）增加所导致的蛋白质丰度变化。在缺血/再灌注（I/R）条件下，新蛋白质合成的增加发生在与新mRNA转录时间不一致的时间范围内2；此外，已有研究报道mRNA表达水平与蛋白质丰度之间存在不一致性3。基于这些原因，我们选择分析由蛋白质翻译所反映的动态蛋白质组的变化。为此，我们定量多聚核糖体组分中的mRNA，并分析多聚核糖体组分中的蛋白质组成。最后，由于微小RNA（miRs）可调控mRNA的翻译可用性，并可能干扰蛋白质翻译效率4,5，我们进一步检测了miRs在多聚核糖体组分中的分布情况，重点关注其对I/R的响应。
我们选择采用离体小鼠Langendorff灌流模型，在持续灌流的基础条件下、30分钟全心无血流缺血后，以及30分钟缺血再加30分钟再灌注后分别采集组织。随后将心脏组织溶解，并通过蔗糖梯度离心分离多聚核糖体，继而进行蛋白质组学分析，并分别通过PCR和微阵列技术选择....
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方案
所有动物实验均按照机构指南进行，并经西达斯-西奈医学中心机构动物护理和使用委员会批准。
1. 小鼠心脏的兰格多夫灌注
- 小鼠心脏的缺血再灌注Langendorff灌流
- 对成年小鼠（8周龄，雄性，C57BL6/j）腹腔注射戊巴比妥钠70 mg/kg。通过脚趾夹捏无回缩反应确认深度麻醉。
- 腹腔注射肝素500 U/kg进行抗凝。
- 通过胸骨切口打开胸腔，切开膈肌并沿肋缘切至腋前线，随后沿腋前线切至前肢以完全打开胸廓。暴露心脏后，用镊子夹住升主动脉并迅速取出心脏。动物因失血而死亡。将心脏置于冰冷的Krebs溶液（NaCl 6.9 g/L，KCl 0.35 g/L，NaHCO3 2.1 g/L，KH2PO4 0.16 g/L，MgSO4 0.141 g/L，葡萄糖2 g/L，CaCl2 0.373 g/L）中。
- 用钝头针插管主动脉，并以恒定压力模式逆行灌注Krebs溶液。
- 经过15分钟的稳定期后，对心脏施加30分钟的全心无流缺血，随后进行30分钟的再灌注。
- 在基线灌注15分钟后、缺血30分钟后或再灌注30分钟后取材。去除心房组织，将心室组织在液氮中速冻。
- 于-80 °C保....
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结果
mRNA 分析
mRNA 结果可以表示为特定 mRNA 在各组分中的分布情况（图 3A）；为了进行定量分析，可将多核糖体翻译组分合并，与非翻译组分进行比较（图 3B），并以翻译组分与非翻译组分中 mRNA 丰度的比值形式呈现。通过将高效多核糖体组分与低效多核糖体组分（以及非翻译组分）分别分析，可以获得更多信息。在分析 miRNA 时这一点尤为重要，因为 miRNA 富集于低效组分中（在此处干扰其靶 mRNA 的蛋白质翻译）。
与假手术组相比，在小鼠心脏经历缺血以及缺血/再灌注处理后，某种特定mRNA在翻译组分与非翻译组分间的分布发生变化，其代表性结果如图4所示。
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讨论
多核糖体图谱分析可通过研究特定mRNA或整个转录组的翻译状态，来分析蛋白质翻译过程6,7。当需要研究局部翻译时（例如突触体），该方法也具有重要价值8。传统上，该方法涉及在蔗糖梯度中分离单核糖体和多核糖体及其相关的mRNA，并可结合基因组学或蛋白质组学技术以获得预期结果6,9。例如，我们课题组近期的一项研究揭示了在经历体外循环（CPB）的患者心脏中存在一种模拟缺血/再灌注损伤的转录后调控机制。利用多核糖体图谱分析，我们发现CPB术后心脏中核编码的线粒体蛋白翻译水平升高2。
本文介绍的动态蛋白质组多聚核糖体分析方法可以揭示与多聚核糖体相关联的mRNA群体及其正在被主动翻译的蛋白质的变化。由于mRNA的翻译在一定程度上受miRNA调控，对这些组分中的miRNA进.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
美国国立卫生研究院 P01 HL112730（RAG，JVE）、美国国立卫生研究院 R01 HL132075（RAG，JVE）、芭芭拉·史翠珊女性心脏中心（RAG，JVE）、多萝西与菲利普·莱昂分子心脏病学讲席（RAG）、埃里卡·格拉泽女性心脏健康讲席（JVE）以及捷克科学院机构支持项目 RVO: 68081715（MS）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 戊巴比妥 | Vortech Phamaceuticals | 9373 | 用于安乐死 |
| 肝素 | Sagent | 103424 | 用于兰格多夫灌流装置 |
| 镊子 | Fine Science Tools | 91110-10 | 用于悬挂心脏 |
| 兰格多夫系统 | Radnoti + 自制 | n/a | 由定制吹制玻璃、导管和水浴组成的“四心脏”系统 |
| NaCl | Sigma | S7653-5KG | 克雷布斯缓冲液和蔗糖梯度 |
| KCl | Sigma | P5405 | 克雷布斯缓冲液和裂解缓冲液 |
| KH2PO42 | Sigma | P-5504 | 克雷布斯缓冲液 |
| MgSO4 | Sigma | M7774-500G | 克雷布斯缓冲液 |
| 葡萄糖 | Sigma | G5767 | 克雷布斯缓冲液 |
| CaCl2 | Sigma | C1016-500G | 克雷布斯缓冲液 |
| 蔗糖粉末 | Sigma | S0389-1KG | 蔗糖梯度 |
| MgCl2 | Sigma | 208337 | 蔗糖梯度和裂解缓冲液 |
| Tris-base | Sigma | T1503-1KG | 蔗糖梯度和裂解缓冲液 |
| 二甲苯青 | Sigma | X-4126 | 蔗糖梯度 |
| 放线菌酮 | Sigma-aldrich | 239763 | 蔗糖梯度和裂解缓冲液 |
| RNaseOUT | Life Technologies | C00019 | 裂解缓冲液中的RNA酶抑制剂 |
| Igepal CA-360 (NP40) | Sigma | I3021 | 裂解缓冲液 |
| 蛋白酶抑制剂混合片剂，不含EDTA | Roche | 5056489001 | |
| 超透明薄壁离心管，13.2 mL，14 mm × 89 mm | Beckman Coulter | 344059 | |
| 超速离心机 | Beckman | LE-80K | 用于梯度的超速离心 |
| 转子 | Beckman | SW41 | 用于梯度的超速离心 |
| Biologic LP（泵） | Biorad | 731-8300 | 梯度的分级收集 |
| BioFrac | Biorad | 741-0002 | 梯度的分级收集 |
| Eppendorf RNA/DNA LoBind 微量离心管，2 mL | Sigma | Z666513-100EA | 梯度组分分离和RNA提取 |
| TRIzol试剂 | Life technologies | AM9738 | RNA提取 |
| 荧光素酶对照RNA | Promega | L4561 | RNA提取 |
| 氯仿 | Fisher Scientific | C606-4 | RNA提取 |
| 糖原，RNA级 | Thermo Fisher Scientific | R0551 | RNA提取 |
| 异丙醇 | Sigma | I9516 | RNA提取 |
| 乙醇 | Sigma | E7023-1L | RNA提取 |
| iScript cDNA合成试剂盒 | BioRad | 170-8891 | 逆转录 |
| iTaq通用SYBR Green Supermix | BioRad | 175-5122 | 定量PCR |
| miRNeasy Micro试剂盒（50） | Qiagen | 217084 | 总RNA提取试剂盒 |
| miScript II RT试剂盒（50） | Qiagen | 218161 | miRNA逆转录试剂盒 |
| miScript Sybr Green PCR试剂盒（200） | Qiagen | 218073 | miRNA实时PCR表达分析试剂盒 |
| Centrifuge 5424R | Eppendorf | 用于在不同温度下对1.5 mL或2.0 mL离心管进行离心，最高转速为21130 × g | |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | 用于在不同温度下对实时PCR板进行离心，最高转速为2039 × g | |
| My Cycler热循环仪 | Bio-Rad | 用于逆转录 | |
| CFX96实时系统/C1000 Touch热循环仪 | Bio-Rad | 用于实时PCR分析 | |
| miRNeasy血清/血浆内参对照 | Qiagen | 219610 | 用于RNA提取的质量控制 |
| 硬壳96孔PCR板，低轮廓，薄壁，带裙边，绿色/透明 | Bio-Rad | HSP9641 | 用于实时PCR分析 |
| Microseal 'B' PCR板密封膜，带粘合剂，光学透明 | Bio-Rad | MSB1001 | 用于实时PCR板密封 |
| Research plus单通道移液器，灰色；0.5–10 µL | Eppendorf | UX-24505-02 | 用于移液 |
| PIPETMAN Classic移液器，P20 | Gilson | F123600G | 用于移液 |
| PIPETMAN Classic移液器，P200 | Gilson | F144565 | 用于移液 |
| Rainin L-1000XLS Pipet-Lite XLS LTS移液器，100–1000 µL | Gilson | 17011782 | 用于移液 |
| 糖原，RNA级 | Thermo Fisher Scientific | R0551 | 提高总RNA提取效率 |
| Posi-Click 1.7 mL离心管，自然色 | Denville | C2170 | RNA提取与储存；试剂混合 |
| 热循环管 - 0.2 mL，带独立盖，标准0.2 mL管，光学透明 | Denville | C18098-4 (1000910) | 逆转录反应 |
| Sharp 10精密屏障吸头 | Denville | P1096-FR | 用于移液 |
| Sharp 20精密屏障吸头 | Denville | P1121 | 用于移液 |
| Sharp 200精密屏障吸头 | Denville | P1122 | 用于移液 |
| LTS 1 mL带滤芯吸头 | Rainin | RT-L1000F | 用于移液 |
| miScript引物检测试剂盒（200） | Qiagen | （根据miRNA不同而变化） | 用于实时PCR分析 |
| Gradient Master ver 5.3 Model 108 | BioComp Instruments | 用于制备蔗糖梯度 | |
| 三氯乙酸 | Sigma Aldrich | T6399 | |
| 丙酮 | Sigma Aldrich | 650501 | |
| Tris盐酸盐 | Amresco | M108 | |
| 二硫苏糖醇 | Fisher Scientific | BP172 | |
| 碘乙酰胺 | Gbiosciences | RC-150 | |
| 测序级修饰猪胰蛋白酶 | Promega | V5111 | |
| 碳酸氢铵 | BDH | BDH9206 | |
| 甲酸，Optima LC/MS级 | Fisher Chemical | A117 | |
| 甲醇，Optima LC/MS级 | Fisher Chemical | A454 | |
| 乙腈，Optima LC/MS级 | Fisher Chemical | A996 | |
| Protein LoBind离心管，0.5 mL | Eppendorf AG | 22431064 | |
| Protein LoBind离心管，1.5 mL | Eppendorf AG | 22431081 | |
| HLB µElution板，30 µm | Oasis | 186001828BA | |
| SpeedVac浓缩仪 | Thermo Scientific | Savant SPD2010 | |
| 超声破碎仪 | Qsonica | Oasis180 | |
| 离心机 | Thermo Scientific | Sorvall Legend micro 21R | |
| LC捕获柱PepMap 100 C18 | Thermo Scientific | 160454 | |
| LC分离柱PepMap RSLC C18 | Thermo Scientific | 164536 | |
| 质谱仪 | Thermo Scientific | Orbitrap Elite离子阱质谱仪 | |
| MSConvert软件 | ProteoWizard Toolkit | ||
| Sorcerer-SEQUEST软件 | Sage-N Research, Inc. |
参考文献
- Pourpirali, S., Valacca, C., Merlo, P., Rizza, S., D’Amico, S., Cecconi, F. Prolonged pseudohypoxia targets ambra1 mrna to p-bodies for translational repression. PLoS ONE. 10, e0129750(2015).
- Andres, A. M., Tucker, K. C., Thomas, A., Taylor, D. J., Sengstock, D., Jahania, S. M., Dabir, R., Pourpirali, S., Brown, J. A., Westbrook, D. G., Ballinger, S. W., Mentzer, R. M. Jr, Gottlieb, R. A.
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