我们描述了从全血中分离犬中性粒细胞的方法，并利用荧光显微镜观察活体中性粒细胞中NET的形成。同时还介绍了使用免疫荧光显微镜定量NET形成及瓜氨酸化组蛋白H3（citH3）表达的实验方案。
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摘要
摘要
面对入侵的病原体，中性粒细胞会释放中性粒细胞胞外诱捕网（NETs），即由DNA骨架与组蛋白及抗菌蛋白共同构成的细胞外网络结构。在败血症期间，过度的NET形成（NETosis）及瓜氨酸化组蛋白H3（citH3）的释放与小鼠和人类的多器官功能障碍及死亡率相关，但其在犬类中的意义尚不清楚。本文中，我们描述了一种从全血中分离犬中性粒细胞以观察和定量NETosis的技术。通过葡聚糖沉降法获得富含白细胞的血浆，再利用市售的密度梯度分离介质分离出粒细胞，并对其进行细胞计数和活力检测。为在活中性粒细胞中实时观察NETosis，向经脂多糖（LPS）或佛波酯12-肉豆蔻酸13-乙酸酯（PMA）激活的中性粒细胞中加入细胞膜通透性和非通透性荧光核酸染料。通过荧光显微镜随时间观察细胞核形态变化及NET的形成。体外 NETosis进一步通过改良的双重免疫标记法，对无细胞DNA（cfDNA）、髓过氧化物酶（MPO）和瓜氨酸化组蛋白H3（citH3）的共定位进行表征。为利用荧光显微镜客观定量NET形成及citH3表达，采用现有软件以盲法对NETs及citH3阳性细胞进行定量分析。该技术是一种特异性检测犬中性粒细胞体外发生NETosis能力的实验方法。
引言
中性粒细胞是寿命较短的粒细胞，负责抵御入侵病原体的初始防御。被募集到感染部位的中性粒细胞通过吞噬作用、脱颗粒以及产生活性氧（ROS）来清除微生物1。在细菌或内毒素存在的情况下，中性粒细胞会释放中性粒细胞胞外诱捕网（NETs），其由细胞外染色质构成，并附着有组蛋白以及弹性蛋白酶和髓过氧化物酶（MPO）等颗粒蛋白2。尽管NETs具有不可或缺的抗菌特性，但越来越多的实验和临床证据表明，在脓毒症期间过度的NET形成可能导致多器官功能障碍甚至死亡3,4,5,6。
由于中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）在犬类中可能发挥类似的病理生理作用，因此预防或减少NET形成的治疗干预措施可能成为脓毒症动物的新型治疗策略。基于这一原因，亟需一种可靠的技术来评估和定量犬类中的NETosis及其组分。此前已有研究评估了临床病犬中性粒细胞和血浆中的NET组分，包括无细胞DNA（cfDNA）和核小体7,8,9。Goggs和Letendre通过荧光检测法发现，脓毒症犬的cfDNA水平高于健康犬8。尽管这些技术具有高度的客观性和定量性，但将cfDNA和核小体作为NETosis标志物进行检测并不具有特异性，因为它们也可能来源于除NETosis中性粒细胞以外的坏死细胞。本文介绍了一种利用荧光显微镜观察活体NETosis中性粒细胞行为的技术。此外，我们还详细描述了一种经过改良的双免疫标记方法，用于主观定量犬类中性粒细胞中的NETs及其组分（如MPO和citH3）10。
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方案
本研究所述所有方法均经加州大学戴维斯分校机构动物护理和使用委员会批准（方案编号：18338）。
1. 血液采集
- 使用21 G针头通过头静脉或颈静脉抽吸，采集10 mL血液。
- 为避免过度剪切应力，在将血液转移至含有肝素钠（75 USP）的试管前，应先将针头从注射器上取下。轻轻倒置试管数次，以确保抗凝剂与血液充分混合。在将样本置于冰上之前，检查是否存在凝块或红细胞聚集现象。
2. 中性粒细胞分离
- 用等体积的冰冻杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）（pH 7.4，不含二价阳离子）稀释抗凝血。将8 mL稀释后的血液转移至含有25 mL 3%右旋糖酐（来源于Leuconostoc spp.，溶于0.9%氯化钠溶液）的50 mL聚丙烯锥形管中。将管子直立放置于室温下30分钟，使红细胞聚集并沉降。
- 在14 mL聚丙烯圆底管中，将5 mL富含白细胞的血浆（图1）小心地铺加到5 mL密度梯度介质上方。注意不要混合这两种溶液11。
- 在室温下以400 × g离心30分钟，加速度/减速度（A/D）设为0（无刹车）。
- 使用5 mL移液管，绕过血浆层和外周血单个核细胞（PBMC）层，收集粒细胞层（图1）。每次使用新的移液管，以尽量减少污染。
- 将4至6 mL多形核（PMN）细胞层放入50 mL聚丙烯锥形管中。由于可能在吸取PMN层时同时吸入少量红细胞聚集体，使用1 mL移液管轻轻去除沉降在管底的红细胞聚集体。
- 用20 mL冷的超纯水裂解残留的红细胞。轻轻倒置管子多次，持续30至60秒，确保充分裂解，然后加入等体积的冰冻1.8%氯化钠溶液。
- 在4 °C下以112 × g离心10分钟，A/D设为0。
- 如果此沉淀仍呈红色，则重复红细胞裂解步骤。小心使用移液管弃去上清液，并将沉淀轻轻重悬于100 µL DPBS（含5 mM葡萄糖、0.9 mM MgCl2、1.9 mM CaCl2和1%牛血清白蛋白，pH 7.3）中。合并所有重悬的细胞，并置于冰上。
- 使用自动细胞计数仪进行细胞计数，并用血细胞计数板验证结果。如有必要，使用细胞离心涂片机（1,000 rpm，5分钟）将PMN浓缩至玻片上，通过计算中性粒细胞占总细胞数的比例来确定中性粒细胞百分比。
- 按照Strober et al.12 所述的台盼蓝排斥法检测中性粒细胞的活力。成功的分离应获得95%至100%的细胞活力，且中性粒细胞比例应高于95%。
- 通过将总细胞数乘以活力百分比和中性粒细胞百分比，计算中性粒细胞浓度。成功的分离应获得1.5至6 × 106/mL的中性粒细胞浓度。
- 用含5 mM葡萄糖、0.9 mM MgCl2、1.9 mM CaCl2和1%牛血清白蛋白（pH调至7.3）的DPBS将中性粒细胞稀释至终浓度为1 × 106/mL。
3. 活中性粒细胞的荧光显微镜观察
- 将200至400 μL的中性粒细胞（1 × 106/mL）加入已包被多聚-L-赖氨酸的12孔培养板的每个孔中。将细胞在37 °C孵育30分钟，使中性粒细胞贴附于孔底。
- 在室温下，使用1 μM的两种核酸染料之一对核酸进行标记，其中一种染料可标记细胞膜完整的细胞，另一种染料可标记细胞膜通透性增加的细胞（参见材料表），染色时间为10分钟。
- 使用100 μg/mL脂多糖（LPS）（E. coli O55:B5）、100 nM佛波酯-12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯（PMA）作为阳性对照，或等体积的DPBS作为阴性对照，在37 °C刺激中性粒细胞180分钟。
- 在荧光显微镜下，于30、90、120和180分钟时间点，以40倍放大倍数，使用GFP通道（激发光：470/22 nm，发射光：525/50 nm）和Texas Red通道（激发光：585/29 nm，发射光：628/32 nm）采集图像。
4. 使用免疫荧光法对中性粒细胞胞外诱捕网进行定量及组分检测
- 将直径为18 mm的聚-D-赖氨酸包被盖玻片小心放入12孔培养板的各孔中，并对各孔进行适当标记。
- 直接将100至200 μL分离得到的中性粒细胞（1 × 106/mL）接种到盖玻片上，于37 °C孵育30分钟，使中性粒细胞贴附于盖玻片。
- 按照3.3节所述方法激活中性粒细胞。如Li et al.13先前所述，在激活前用200 µΜ Cl-amidine预处理中性粒细胞（15分钟，37 °C）以抑制NET形成。实验中需包含适当的溶剂对照组（DMSO）。
- 用精细镊子小心取出盖玻片。将石蜡膜片覆盖在试管架上以形成浅槽，并在每个槽内加入2至3滴4%多聚甲醛（PFA）10。对各槽进行适当标记，然后将盖玻片反面朝下轻轻放置于含PFA的槽中。室温下固定细胞20分钟。
- 用DPBS洗涤细胞3次，每次5分钟，通过将盖玻片从一个槽转移到下一个槽完成洗涤。
- 若在中性粒细胞激活和固定后不能立即进行免疫标记，可将盖玻片正面朝上置于吸水纸上自然风干。盖玻片可在4 °C下正面朝上存放于标记好的12孔培养板中，最长保存1周，直至进一步分析。进行下一步前，使用与4.4节相同的方法，用DPBS洗涤细胞3次，每次1分钟。
- 为通透细胞，采用4.4节所述方法，将盖玻片反面朝下置于1% NP-40液滴上1分钟。随后在摇床上用DPBS洗涤3次，每次1分钟。
- 将每个样本随机分配编号，并使用金刚石笔在盖玻片上相应标记。
- 准备并标记内衬石蜡膜的单个培养皿，在膜上加入100至200 μL 5%山羊血清（封闭缓冲液）。将盖玻片反面朝下放置于封闭缓冲液上。置于摇床上，37 °C孵育1小时。
- 在摇床上用DPBS洗涤3次，每次5分钟。
- 将一抗（1:400稀释的兔多克隆抗瓜氨酸化组蛋白H3（citH3）抗体）用5%山羊血清稀释。将细胞置于内衬石蜡膜的标记培养皿中，每张盖玻片反面朝下置于50至100 μL稀释的一抗溶液上。置于摇床上，37 °C孵育1小时。
- 在摇床上用DPBS洗涤3次，每次5分钟。
- 将与荧光染料偶联的二抗（1:200稀释）用5%山羊血清稀释。将细胞置于内衬石蜡膜的标记培养皿中，每张盖玻片反面朝下置于50至100 μL稀释的二抗溶液上。置于摇床上，37 °C避光孵育1小时。
- 在摇床上避光用DPBS洗涤3次，每次5分钟。
- 如需同时检测髓过氧化物酶（MPO），请按照Li et al.13所述改良的双重免疫标记方案进行以下步骤。
- 将细胞置于内衬石蜡膜的标记培养皿中，在轻柔振荡条件下，每张盖玻片反面朝下置于100至200 μL 10%兔血清中，4 °C避光过夜孵育。
- 在摇床上避光用DPBS洗涤3次，每次5分钟。
- 在室温下，将细胞在50 μg/mL未标记的山羊抗兔IgG Fab片段溶液中避光振荡孵育2小时。
- 在摇床上避光用DPBS洗涤3次，每次5分钟。
- 将一抗（1:200稀释的兔多克隆抗人MPO抗体）用5%山羊血清稀释。将细胞置于内衬石蜡膜的标记培养皿中，每张盖玻片反面朝下置于50至100 μL稀释的一抗溶液上。置于摇床上，37 °C避光孵育1小时。
- 将与荧光染料偶联的二抗用5%山羊血清稀释，并按照4.8节所述条件孵育。
- 在摇床上避光用DPBS洗涤3次，每次5分钟。
- 干扰对照组应在第二次免疫标记步骤中省略任一主抗体的孵育。
- 室温避光条件下，用300 nM的4’,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI）染色DNA 5分钟。
- 在摇床上避光用DPBS洗涤3次，每次1分钟。
- 在载玻片上滴加一滴抗荧光淬灭封片剂（约50 μL）。封片前，将盖玻片边缘轻触吸水纸以去除多余缓冲液，然后将细胞面朝下盖在封片剂上。封片剂应在盖玻片与载玻片之间形成一层薄层。为去除气泡，可用精细镊子非常轻柔地按压盖玻片。
- 将样品置于4 °C避光环境中过夜固化。封片剂应充分硬化，以便使用浸油物镜进行显微分析。样品应于4 °C避光保存。
5. 中性粒细胞胞外诱捕网的定量
- 对进行显微镜图像采集和分析的操作人员设盲，使其不了解实验分组情况。
- 使用荧光显微镜在40倍放大倍数下，针对每张盖玻片在不同区域随机采集10张图像，分别在对应的荧光通道下进行。确保在整个图像采集过程中，各通道的曝光时间、亮度和对比度保持一致。
- 使用ImageJ（NIH）等可用软件分析图像。根据cfDNA、citH3和MPO的共定位来识别NETs（图3A，B）。在每种实验条件下，对10个随机视野中的NETs数量和中性粒细胞总数进行定量。NETs释放数量可表示为每种实验条件下的比例（NETs数量：中性粒细胞总数）。
- 为评估处理因素对细胞内citH3表达的影响，在40倍放大倍数下，于对应通道中在10个随机视野内分别计数具有细胞内citH3的中性粒细胞数量和无细胞内citH3的中性粒细胞数量（图3，红色箭头）。细胞内citH3表达水平可用具有细胞内citH3的中性粒细胞数与无细胞内citH3的中性粒细胞数之比表示。
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结果
通过本活细胞成像方案，研究人员可观察活中性粒细胞的细胞核形态、细胞膜完整性以及游离DNA（cfDNA）的存在情况。一种细胞膜非通透性核染料可使细胞膜受损的细胞内核酸呈红色。另一种细胞膜通透性染料则可标记细胞膜完整的活细胞内的核酸，使其呈绿色。所有完整的中性粒细胞，无论是否经过处理，在刺激后0至30分钟内均应呈现绿色，并表现出典型的分叶状细胞核结构（图2A）。经PMA处理的中性粒细胞的细胞核大约在60分钟时开始失去其分叶形态，并持续发生染色质去浓缩，直至释放cfDNA（图2B）。LPS作为犬中性粒细胞较缓慢且更生理性的刺激物，通常在刺激后90分钟才开始出现染色质去浓缩或NETosis现象（图2B）。至120分钟时，可见LPS和PMA激活的中性粒细胞周围均被cfDNA包围。与LPS相比，PMA激活的中性粒细胞更多地丧失细胞膜完整性，因而被细胞膜非通透性染料染成红色（
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讨论
本文介绍了一种利用细胞膜通透性染料和细胞膜非通透性染料，观察活体犬中性粒细胞核形态变化及游离DNA（cfDNA）释放的实验方案。该检测方法的主要优势在于，无需固定细胞，即可通过高分辨率显微镜实时监测活中性粒细胞中中性粒细胞胞外诱捕网（NET）的形成，从而为观察NET动态过程提供一种简便且有价值的工具。 体外 NET的形成。由于该检测方法在检测NET组分时无需使用抗体，因此非常适合用于研究因物种特异性抗体难以获得而受限的其他物种中的NETosis。通过该检测方法，作者证明了在LPS或PMA刺激下，犬中性粒细胞在发生NETosis之前会出现染色质去浓缩现象。13该技术的一个主要缺点是其对NETosis不具有特异性。由于细胞非渗透性染料同样可染色坏死细胞中的核酸或来自裂解中性粒细胞的游离核酸，因此游离DNA（cfDNA）或细胞非渗透性染料阳性的细胞可能被错误解读为中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）或正在发生NETosis的中性粒细胞。另一种提高NETosis特异性的方式是，将经PMA或LPS激活的中性粒细胞预先用PAD4抑制剂Cl-amidine处理作为对照。本文中我们展示了在整...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
通讯作者由莫里斯动物基金会（D15CA-907）提供资助。本研究得到了加州大学戴维斯分校马类健康中心和伴侣动物健康中心基金（2016-24-F）的支持。 作者谨此感谢 Geena Ng 在图表制作方面的协助，以及 Nghi Nguyen 在视频制作方面的协助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 来自Leuconostoc spp. 的葡聚糖 | Sigma | 31392 | 分子量 450,000 – 650,000 |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Life Sciences | 17144002 | |
| Dulbecco’s 磷酸盐缓冲液 | ThermoFisher Scientific | A1285801 | 含二价阳离子 |
| Dulbecco’s 磷酸盐缓冲液 | ThermoFisher Scientific | 14190136 | 不含二价阳离子 |
| E. coli O55:B5 | InvivoGen | ||
| SYTOX Orange 荧光核酸染料 | ThermoFisher Scientific | S11368 | 5 mM 溶于 DMSO；可对细胞膜通透性增加的细胞进行染色 |
| SYTO Green 16 荧光核酸染料 | ThermoFisher Scientific | S7578 | 1 mM 溶于 DMSO；可对细胞膜完整的细胞进行染色 |
| Surface-Amps NP-40 | Pierce | 28324 | |
| 聚-D-赖氨酸包被的盖玻片 | neuVitro | H-12-pdl | 直径 12 mm |
| 抗瓜氨酸化组蛋白 H3 抗体 | Abcam | Ab5103 | |
| 未标记的山羊抗兔 Fab 片段 | Jackson ImmunoResearch | 111-007-003 | 特异性：IgG (H+L) |
| 抗髓过氧化物酶抗体 | Dako | A0398 | |
| 4,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI） | Life Technologies Corporation | D1306 |
参考文献
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