我们描述了从全血中分离犬中性粒细胞的方法，并利用荧光显微镜观察活体中性粒细胞中NET的形成。同时还介绍了使用免疫荧光显微镜定量NET形成及瓜氨酸化组蛋白H3（citH3）表达的实验方案。
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本文内容
摘要
摘要
面对入侵的病原体，中性粒细胞会释放中性粒细胞胞外诱捕网（NETs），即由DNA骨架与组蛋白及抗菌蛋白共同构成的细胞外网络结构。在败血症期间，过度的NET形成（NETosis）及瓜氨酸化组蛋白H3（citH3）的释放与小鼠和人类的多器官功能障碍及死亡率相关，但其在犬类中的意义尚不清楚。本文中，我们描述了一种从全血中分离犬中性粒细胞以观察和定量NETosis的技术。通过葡聚糖沉降法获得富含白细胞的血浆，再利用市售的密度梯度分离介质分离出粒细胞，并对其进行细胞计数和活力检测。为在活中性粒细胞中实时观察NETosis，向经脂多糖（LPS）或佛波酯12-肉豆蔻酸13-乙酸酯（PMA）激活的中性粒细胞中加入细胞膜通透性和非通透性荧光核酸染料。通过荧光显微镜随时间观察细胞核形态变化及NET的形成。体外 NETosis进一步通过改良的双重免疫标记法，对无细胞DNA（cfDNA）、髓过氧化物酶（MPO）和瓜氨酸化组蛋白H3（citH3）的共定位进行表征。为利用荧光显微镜客观定量NET形成及citH3表达，采用现有软件以盲法对NETs及citH3阳性细胞进行定量分析。该技术是一种特异性检测犬中性粒细胞体外发生NETosis能力的实验方法。
引言
中性粒细胞是寿命较短的粒细胞，负责抵御入侵病原体的初始防御。被募集到感染部位的中性粒细胞通过吞噬作用、脱颗粒以及产生活性氧（ROS）来清除微生物1。在细菌或内毒素存在的情况下，中性粒细胞会释放中性粒细胞胞外诱捕网（NETs），其由细胞外染色质构成，并附着有组蛋白以及弹性蛋白酶和髓过氧化物酶（MPO）等颗粒蛋白2。尽管NETs具有不可或缺的抗菌特性，但越来越多的实验和临床证据表明，在脓毒症期间过度的NET形成可能导致多器官功能障碍甚至死亡3,4,5,6。
由于中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）在犬类中可能发挥类似的病理生理作用，因此预防或减少NET形成的治疗干预措施可能成为脓毒症动物的新型治疗策略。基于这一原因，亟需一种可靠的技术来评估和定量犬类中的NETosis及其组分。此前已有研究评估了临床病犬中性粒细胞和血浆中的NET组分，包括无细胞DNA（cfDNA）和核小体7,8,
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方案
本研究所述所有方法均经加州大学戴维斯分校机构动物护理和使用委员会批准（方案编号：18338）。
1. 血液采集
- 使用21 G针头通过头静脉或颈静脉抽吸，采集10 mL血液。
- 为避免过度剪切应力，在将血液转移至含有肝素钠（75 USP）的试管前，应先将针头从注射器上取下。轻轻倒置试管数次，以确保抗凝剂与血液充分混合。在将样本置于冰上之前，检查是否存在凝块或红细胞聚集现象。
2. 中性粒细胞分离
- 用等体积的冰冻杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）（pH 7.4，不含二价阳离子）稀释抗凝血。将8 mL稀释后的血液转移至含有25 mL 3%右旋糖酐（来源于Leuconostoc spp.，溶于0.9%氯化钠溶液）的50 mL聚丙烯锥形管中。将管子直立放置于室温下30分钟，使红细胞聚集并沉降。
- 在14 mL聚丙烯圆底管中，将5 mL富含白细胞的血浆（图1）小心地铺加到5 mL密度梯度介质上方。注意不要混合这两种溶液11。
- 在室温下以400 × g离心30分钟，加速度/减速度（A/D）设为0（无刹车）。
- 使用5 mL移液管，绕过血浆层和外周血单个核细胞（PBM....
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结果
通过本活细胞成像方案，研究人员可观察活中性粒细胞的细胞核形态、细胞膜完整性以及游离DNA（cfDNA）的存在情况。一种细胞膜非通透性核染料可使细胞膜受损的细胞内核酸呈红色。另一种细胞膜通透性染料则可标记细胞膜完整的活细胞内的核酸，使其呈绿色。所有完整的中性粒细胞，无论是否经过处理，在刺激后0至30分钟内均应呈现绿色，并表现出典型的分叶状细胞核结构（图2A）。经PMA处理的中性粒细胞的细胞核大约在60分钟时开始失去其分叶形态，并持续发生染色质去浓缩，直至释放cfDNA（图2B）。LPS作为犬中性粒细胞较缓慢且更生理性的刺激物，通常在刺激后90分钟才开始出现染色质去浓缩或NETosis现象（图2B）。至120分钟时，可见LPS和PMA激活的中性粒细胞周围均被cfDNA包围。与LPS相比，PMA激活的中性粒细胞更多地丧失细胞膜完整性，因而被细胞膜非通透性染料染成红色（
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讨论
本文介绍了一种利用细胞膜通透性染料和细胞膜非通透性染料，观察活体犬中性粒细胞核形态变化及游离DNA（cfDNA）释放的实验方案。该检测方法的主要优势在于，无需固定细胞，即可通过高分辨率显微镜实时监测活中性粒细胞中中性粒细胞胞外诱捕网（NET）的形成，从而为观察NET动态过程提供一种简便且有价值的工具。 体外 NET的形成。由于该检测方法在检测NET组分时无需使用抗体，因此非常适合用于研究因物种特异性抗体难以获得而受限的其他物种中的NETosis。通过该检测方法，作者证明了在LPS或PMA刺激下，犬中性粒细胞在发生NETosis之前会出现染色质去浓缩现象。13该技术的一个主要缺点是其对NETosis不具有特异性。由于细胞非渗透性染料同样可染色坏死细胞中的核酸或来自裂解中性粒细胞的游离核酸，因此游离DNA（cfDNA）或细胞非渗透性染料阳性的细胞可能被错误解读为中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）或正在发生NETosis的中性粒细胞。另一种提高NETosis特异性的方式是，将经PMA或LPS激活的中性粒细胞预先用PAD4抑制剂Cl-amidine处理作为对照。本文中我们展示了在整.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
通讯作者由莫里斯动物基金会（D15CA-907）提供资助。本研究得到了加州大学戴维斯分校马类健康中心和伴侣动物健康中心基金（2016-24-F）的支持。 作者谨此感谢 Geena Ng 在图表制作方面的协助，以及 Nghi Nguyen 在视频制作方面的协助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 来自Leuconostoc spp. 的葡聚糖 | Sigma | 31392 | 分子量 450,000 – 650,000 |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Life Sciences | 17144002 | |
| Dulbecco’s 磷酸盐缓冲液 | ThermoFisher Scientific | A1285801 | 含二价阳离子 |
| Dulbecco’s 磷酸盐缓冲液 | ThermoFisher Scientific | 14190136 | 不含二价阳离子 |
| E. coli O55:B5 | InvivoGen | ||
| SYTOX Orange 荧光核酸染料 | ThermoFisher Scientific | S11368 | 5 mM 溶于 DMSO；可对细胞膜通透性增加的细胞进行染色 |
| SYTO Green 16 荧光核酸染料 | ThermoFisher Scientific | S7578 | 1 mM 溶于 DMSO；可对细胞膜完整的细胞进行染色 |
| Surface-Amps NP-40 | Pierce | 28324 | |
| 聚-D-赖氨酸包被的盖玻片 | neuVitro | H-12-pdl | 直径 12 mm |
| 抗瓜氨酸化组蛋白 H3 抗体 | Abcam | Ab5103 | |
| 未标记的山羊抗兔 Fab 片段 | Jackson ImmunoResearch | 111-007-003 | 特异性：IgG (H+L) |
| 抗髓过氧化物酶抗体 | Dako | A0398 | |
| 4,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI） | Life Technologies Corporation | D1306 |
参考文献
- Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nature Reviews Immunology. 6 (3), 173-182 (2006).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Beneficial suicide: why neutrophils die, to make NETs. Nature Reviews Microbiology. 5 (8), 577-582 ....
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重印与许可
