本文介绍了一种将初始CD4+ T细胞分化为小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子产生型辅助性T（THGM）细胞的实验方案，包括初始CD4+ T细胞的分离、THGM细胞的分化以及分化后THGM细胞的分析。该方法可用于研究THGM细胞的功能及其调控机制。
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摘要
摘要
分泌粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）的辅助性T细胞（THGM细胞是一种新近发现的辅助性T细胞亚群，主要分泌粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF），而不产生干扰素（IFN）γ或白细胞介素（IL）-17，在自身免疫性神经炎症中发挥关键作用。从脾细胞单细胞悬液中分离初始CD4+ T细胞的方法以及TH从初始CD4+ T细胞生成GM细胞是研究T细胞介导的免疫反应及自身免疫性疾病的一项有用技术。本文介绍一种将小鼠初始CD4+ T细胞分化为T细胞的方法H在IL-7促进下生成的GM细胞。通过多种技术分析细胞因子的表达情况，以评估分化结果，包括胞内细胞因子染色联合流式细胞术、实时定量聚合酶链式反应（PCR）以及酶联免疫吸附测定（ELISA）。利用TH如本文所述的GM分化方案，约55%的细胞表达GM-CSF，而IFNα或IL-17的表达极低。T细胞主要表达GM-CSFH通过在mRNA和蛋白质水平上分析GM-CSF、IFNα和IL-17的表达，进一步证实了GM细胞的生成。因此，该方法可用于将初始CD4+ T细胞诱导分化为T细胞HGM 细胞 体外，这将在T的研究中具有重要作用HGM细胞生物学
引言
CD4+ 辅助性T细胞（TH细胞）是免疫系统的重要组成部分，在宿主抵御微生物病原体、癌症免疫监视以及自身免疫中发挥关键作用1,2,3。在T细胞受体（TCR）激活后，初始CD4+ T细胞可在不同细胞因子环境的影响下分化为TH1、TH2、TH17或调节性T（Treg）细胞2,4,5。最近发现了一种新的TH细胞亚群，其主要产生粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF），被命名为THGM6。THGM细胞的分化由IL-7通过激活信号转导子和转录激活子5（STAT5）所驱动。这类细胞大量表达GM-CSF，但对其他TH细胞特征性细胞因子（如IFNγ和IL-17）的表达水平较低6。研究发现，GM-CSF在CD4+ T细胞介导的神经炎症发生过程中起关键作用7,8。与表达IFNγ或IL-17的自身反应性T细胞相比，将表达GM-CSF的T细胞过继转移至野生型（WT）小鼠后，可导致更早的发病时间和更严重的疾病表型。此外，Csf2-/- T细胞在过继转移至WT受体小鼠后无法诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE），而缺乏IFNγ或IL-17A的T细胞仍保留介导EAE的能力7。此外，使用中和抗体阻断GM-CSF可减轻EAE的疾病严重程度8。进一步研究表明，小鼠T细胞中STAT5的缺失会导致THGM细胞生成减少，从而使小鼠对EAE的发生具有抵抗性6。这些发现凸显了表达GM-CSF的TH细胞在自身免疫性神经炎症疾病中的重要性。因此，建立一种从初始CD4+ T细胞有效分化出表达GM-CSF的TH细胞的方法，对于研究自身免疫性神经炎症的发病机制及T细胞介导的免疫应答具有重要意义。然而，目前尚未建立一种能够高效诱导小鼠初始CD4+ T细胞分化为THGM细胞的实验方案。
本文介绍一种将小鼠初始CD4+ T细胞分化为THGM细胞的方法。该方案详细描述了整个实验流程，包括从小鼠中取出脾脏、制备单细胞悬液、CD4阳性筛选、荧光激活细胞分选（FACS），以及TH细胞的分化与分析。分化后的辅助性T细胞通过胞内细胞因子染色结合流式细胞术在单细胞水平检测细胞因子表达，通过定量实时PCR在mRNA水平检测细胞因子表达，以及通过ELISA在蛋白水平评估细胞因子表达。该方法可用于在多种条件下研究THGM细胞生物学特性，例如在实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）中，其中GM-CSF在发病机制中发挥重要作用。
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方案
本方案中使用的所有小鼠均为C57BL/6遗传背景，饲养于新加坡国立大学的无特定病原体环境中。所有实验均依照新加坡国立大学机构动物护理和使用委员会批准的方案进行。
1. 试剂与材料准备
- 配制含有2%胎牛血清（FBS）和1 mM乙二胺四乙酸（EDTA）的500 mL磷酸盐缓冲液（PBS）。
注意：为获得最佳效果，整个操作过程中应将缓冲液置于冰上。 - 配制50 mL完全RPMI培养基，包含RPMI 1640、10% FBS和1%青霉素-链霉素。在进行THGM细胞分化时，使用含有50 µM β-巯基乙醇的完全RPMI培养基。β-巯基乙醇需在通风橱中添加。
- 通过将抗CD3e抗体浓缩液用PBS稀释至3 μg/mL，配制7.5 mL抗CD3e抗体混合液。向每个孔中加入150 μL抗体混合液以包被48孔板，并将板在37 °C孵育至少1小时，或在4 °C过夜孵育。
- 对剪刀和镊子进行灭菌处理，并在每次解剖操作间隙将其保存在70%乙醇中。
2. 小鼠脾细胞的制备
- 使用机构批准的 CO2 窒息法或颈椎脱位法处死 6–8 周龄的小鼠。用 70% 乙醇喷洒小鼠，并将其仰卧固定在聚苯乙烯板上。将小鼠转移至生物安全柜中，进行后续操作。
- 用镊子夹住皮肤，使用剪刀在左侧肋骨下方约 4 cm 处剪开皮肤。打开腹膜囊以暴露脾脏，并用无菌镊子取出脾脏。
- 将一个 70 μm 细胞筛置于 50 mL 离心管上，并用 2 mL 缓冲液预润湿。将脾脏置于细胞筛上（每个细胞筛放置 2–3 个脾脏），用 5 mL 注射器活塞末端研磨组织。
- 用 1–2 mL 细胞分离缓冲液多次冲洗细胞筛和离心管，直至所有细胞均被冲入离心管中。弃去细胞筛，将细胞在 4 °C 条件下以 350 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。
- 用 5 mL 冷（4 °C）氯化铵-氯化钾（ACK）裂解缓冲液（150 mM NH4Cl，10 mM KHCO3，0.1 mM Na2EDTA；pH 7.2–7.4）重悬细胞沉淀，轻轻混匀 2 分钟。加入 10 mL 完全 RPMI 培养基以中和 ACK 缓冲液，并立即在 4 °C 条件下以 350 × g 离心 5 分钟。离心后弃去上清液。
3. 使用磁性 CD4 微珠和细胞分离柱分离 CD4+ T 细胞
- 将细胞沉淀重悬于 5 mL 细胞分离缓冲液中。使用预分离滤器（30 μm）将细胞悬液过滤至新的 15 mL 离心管中，以去除任何碎片。
- 取 10 μL 细胞悬液，加入 90 μL 缓冲液进行 10 倍稀释。再取 10 μL 稀释后的细胞悬液，与 10 μL 台盼蓝混合用于细胞计数。使用血细胞计数板对细胞进行计数，以确定活细胞的得率。
- 在 4 °C 条件下，以 350 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。
- 按每 107 个细胞加入 90 μL 缓冲液重悬细胞。按每 107 个细胞加入 10 μL 磁性 CD4 微珠。在 4 °C 下孵育 15 分钟。为获得最佳效果，孵育期间每 5 分钟轻轻混匀细胞悬液一次。
- 在细胞孵育期间，将分离柱置于磁力架上，并用 2 mL 缓冲液预润湿柱子。
- 细胞与微珠孵育结束后，用 5 mL 缓冲液洗涤细胞，在 4 °C 条件下以 350 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。
- 将细胞重悬于 1 mL 缓冲液中，将样品加载至细胞分离柱中，使其自然流过。使用 15 mL 离心管收集 CD4- 细胞组分。在储液室变干前，加入 1 mL 缓冲液洗涤。重复洗涤步骤 2 次。
- 将细胞分离柱从磁力架上取下，置于新的 15 mL 离心管上。向细胞分离柱中加入 2 mL 细胞分离缓冲液，并用力插入推杆，将细胞从柱中推出。
- 在 4 °C 条件下，以 350 × g 离心 5 分钟，收集 CD4+ 细胞组分。弃去上清液。
4. 通过荧光激活细胞分选法纯化初始CD4+ T细胞（CD4+CD25-CD44loCD62Lhi）及THGM分化
- 将获得的 CD4+ 细胞沉淀重悬于 500 µL 缓冲液中。用含 CD4-PerCp（2.8 µg/mL）、CD44-APC（2.4 µg/mL）、CD25-PE（2 µg/mL）和 CD62L-FITC（10 µg/mL）的荧光标记抗体混合物对细胞进行染色（表 1）。将细胞置于冰上避光孵育 20–30 分钟。
注意：抗体浓度已在实验室先前优化。所列抗体用量适用于 1–2 只小鼠的细胞。 - 孵育结束后，加入 5 mL 缓冲液洗涤细胞，并在 4 °C 下以 350 × g 离心 5 分钟。
- 弃去上清液，将细胞重悬于 500 µL 缓冲液中。再次使用尼龙网膜过滤细胞。
- 将细胞悬液转移至 FACS 管中用于细胞分选。预先在收集用的 FACS 管中加入 500 µL 缓冲液进行预包被。
- 通过 FACS 分选获得 CD4+CD25-CD44loCD62Lhi 群体（即初始型 CD4+ T 细胞）。首先圈选 CD4+CD25- 群体，再从中选择 CD44loCD62Lhi 细胞。
- 将初始型 CD4+ T 细胞组分收集至新的 15 mL 离心管中。在 4 °C 下以 350 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。
- 将初始型 CD4+ T 细胞重悬于完全 RPMI 培养基中，调整细胞浓度为 106 个细胞/mL，培养基中含 50 µM β-巯基乙醇。
- 吸出 48 孔板中用于预包被的抗 CD3e 抗体。每孔接种 25 万个细胞（250 µL），并加入 IL-7（2 ng/mL）、抗 CD28（1 µg/mL）和抗 IFNγ（10 µg/mL）（表 1）。
注意：细胞因子和抗体的浓度已在实验室先前优化，适用于 THGM 细胞的分化诱导。 - 将细胞置于 37 °C、5% CO2 条件下孵育 3 天。孵育期间不更换培养基。
5. 小鼠T细胞的分析HGM细胞的生成 体外
- 使用显微镜在分化后第3天检查细胞分化情况。收集细胞并在4 °C下以350 × g 离心5分钟。用完全RPMI培养基洗涤细胞2次。
注：分化后的细胞体积大于初始CD4+ T细胞。 - 将细胞重悬于1 mL完全RPMI培养基中。取10 μL细胞悬液与10 μL台盼蓝充分混合，用血细胞计数板测定细胞数量。将分化后的细胞分为三份，用于再刺激和分析。
注：细胞内细胞因子染色和ELISA检测需要≥0.5×10⁶个细胞，qPCR分析需要≥1×10⁶个细胞。 - 进行细胞内细胞因子染色时，使用佛波酯12-十四酰肉豆蔻酸酯13-乙酸盐（PMA）（100 ng/mL）和离子霉素（1 μg/mL）在蛋白转运抑制剂（1 µL/mL）存在下对细胞进行再刺激，持续4–6小时。
- 收集细胞，并用抗CD4抗体（PerCP偶联，0.2 mg/mL，1:100稀释；或FITC偶联，0.5 mg/mL，1:100稀释）在室温下染色30分钟。
- 用200 μL固定缓冲液固定细胞20–60分钟。固定后，用1 mL破膜缓冲液洗涤细胞2次。
- 在避光条件下，使用针对GM-CSF（PE偶联，0.2 mg/mL，1:100稀释）、IL-17A（FITC偶联，0.5 mg/mL，1:100稀释；APC偶联，0.2 mg/mL，1:100稀释）、IL-4（APC偶联，0.2 mg/mL，1:100稀释）和IFNγ（APC偶联，0.2 mg/mL，1:100稀释；PE偶联，0.2 mg/mL，1:100稀释）的抗体对细胞进行细胞内染色，孵育30分钟。
- 为分析分化细胞的细胞因子基因表达，使用包被于培养板的抗CD3e抗体（3 μg/mL）激活细胞（培养板包被方法见步骤1.3）。刺激3小时后，收集细胞，使用酚类RNA提取试剂分离总RNA，并用于制备qPCR所需的cDNA。qPCR所用引物和程序分别列于表2和表3中。
- 为分析分化细胞分泌的细胞因子蛋白，使用包被于培养板的抗CD3e抗体（3 μg/mL）对细胞再刺激24小时（培养板包被方法见步骤1.3）。收集细胞培养上清液，进行IL-17和GM-CSF的ELISA检测，以确定其浓度。
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结果
从两只8周龄雄性C57BL/6小鼠中分离出的初始CD4+ T细胞被分为三部分。其中一部分细胞按照所述方案诱导分化为THGM细胞；另一部分细胞在抗IL-4抗体（10 µg/mL）存在下，于THGM诱导条件下培养，以检测IL-4阻断对THGM分化的影响；最后一部分细胞则在TH17分化条件下培养（3 µg/mL抗CD3e、1 µg/mL抗CD28、10 ng/mL TGFβ、30 ng/mL IL-6、10 µg/mL抗IFNγ和10 µg/mL抗IL-4）。分化3天后，收集细胞并重新刺激，通过细胞内细胞因子染色、qPCR和ELISA分析细胞因子表达。细胞内细胞因子染色与FACS分析结果显示，在THGM分化条件下培养的细胞中约有55%为表达GM-CSF的细胞（图1A），而在TH17分化条件下分化的细胞中仅有约2%表达GM-CSF。此外，与TH17分化条件诱导出8.17...
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讨论
在此，我们描述了一种实验方案 体外 TH从小鼠初始CD4+ T细胞诱导GM分化，随后对分化细胞进行分析以验证该方法。值得注意的是，脾脏和淋巴结均可用于初始CD4+ T细胞的分离与纯化HGM分化。通过胞内细胞因子染色结合流式细胞术检测细胞因子表达，结果显示在T条件下约55%的细胞被诱导为表达GM-CSF的细胞HGM 条件（图1A）。与T条件下的细胞相比H17 种分化条件下，在 T 分化条件下的细胞HGM 条件下含有基础水平的 IL-17 表达细胞群；然而， il17 通过qPCR无法检测到基因表达（图 2A).
有趣的是，尽管添加了IFNγ中和抗体，我们仍检测到TH17和THGM细胞中存在低水平的Ifng mRNA表达，且表达IFNγ的TH...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究获得了新加坡国立大学卫生系统基金（T1-2014 Oct-12 和 T1-2015 Sep-10）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| RPMI 1640 | Biowest | L0500-500 | |
| 经热灭活的胎牛血清（FBS Heat Inactivated） | Capricorn | FBS-HI-12A | |
| 青霉素-链霉素（Penicillin-Streptomycin） | Gibco | 15140122 | |
| 10x PBS | 1st Base | BUF-2040-10 | 用无菌水稀释至1x PBS |
| EDTA | 1st Base | BUF-1053-100ml-pH8.0 | |
| 10x ACK 裂解缓冲液（10x ACK buffer） | Biolegend | 420301 | 用无菌水稀释 |
| 细胞滤筛（Cell strainer） | SPL Life Sciences | 93070 | |
| CD4 微珠（CD4 microbeads） | Miltenyi Biotec | 130-049-201 | |
| 2-巯基乙醇（2-Mercaptoethanol） | Sigma | M7522 | |
| LS 分离柱（LS column） | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| 磁力架（magnetic stand） | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| 1 mL 注射器（1 mL syringe） | Terumo | SS+01T | |
| 离心机（Centrifuge） | Eppendorf | Eppendorf 5810R | |
| Sony SY3200 细胞分选仪（Sony SY3200 cell sorter） | Sony | Sony SY3200 cell sorter | |
| 50 mL 圆锥形离心管（50 mL conical centrifuge tube） | Greiner Bio-One | 210261 | |
| 15 mL 圆锥形离心管（15 mL conical centrifuge tube） | Greiner Bio-One | 188271 | |
| FACS 管（FACS tube） | Corning | 352054 | |
| 24 孔细胞培养板（24 well cell culture plate） | Greiner Bio-One | 662160 | |
| 抗小鼠 CD4 PerCP-eFluor 710（anti-mouse CD4 PerCP-eFluor 710） | eBioscience | 46-0041-82 | |
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| 抗人/小鼠 CD44 APC（anti-human/mouse CD44 APC） | eBioscience | 17-0441-82 | |
| 抗小鼠 CD62L FITC（anti-mouse CD62L FITC） | eBioscience | 11-0621-85 | |
| 改进型 Neubauer 计数板（Neubauer-improved counting chamber） | Marienfeld | 640010 | |
| Hyclone 台盼蓝溶液（Hyclone Trypan Blue Solution） | GE healthcare Life Sciences | SV30084.01 | |
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参考文献
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- Zhang, J., et al. A novel subset of helper T cells promotes immune responses by secreting GM-CSF. Cell Death and Differentiation. 20, 1731-1741 (2013).
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重印与许可
