本文介绍了一种将初始CD4+ T细胞分化为小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子产生型辅助性T（THGM）细胞的实验方案，包括初始CD4+ T细胞的分离、THGM细胞的分化以及分化后THGM细胞的分析。该方法可用于研究THGM细胞的功能及其调控机制。
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摘要
摘要
分泌粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）的辅助性T细胞（THGM细胞是一种新近发现的辅助性T细胞亚群，主要分泌粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF），而不产生干扰素（IFN）γ或白细胞介素（IL）-17，在自身免疫性神经炎症中发挥关键作用。从脾细胞单细胞悬液中分离初始CD4+ T细胞的方法以及TH从初始CD4+ T细胞生成GM细胞是研究T细胞介导的免疫反应及自身免疫性疾病的一项有用技术。本文介绍一种将小鼠初始CD4+ T细胞分化为T细胞的方法H在IL-7促进下生成的GM细胞。通过多种技术分析细胞因子的表达情况，以评估分化结果，包括胞内细胞因子染色联合流式细胞术、实时定量聚合酶链式反应（PCR）以及酶联免疫吸附测定（ELISA）。利用TH如本文所述的GM分化方案，约55%的细胞表达GM-CSF，而IFNα或IL-17的表达极低。T细胞主要表达GM-CSFH通过在mRNA和蛋白质水平上分析GM-CSF、IFNα和IL-17的表达，进一步证实了GM细胞的生成。因此，该方法可用于将初始CD4+ T细胞诱导分化为T细胞HGM 细胞 体外，这将在T的研究中具有重要作用HGM细胞生物学
引言
CD4+ 辅助性T细胞（TH细胞）是免疫系统的重要组成部分，在宿主抵御微生物病原体、癌症免疫监视以及自身免疫中发挥关键作用1,2,3。在T细胞受体（TCR）激活后，初始CD4+ T细胞可在不同细胞因子环境的影响下分化为TH1、TH2、TH17或调节性T（Treg）细胞2,4,5。最近发现了一种新的TH细胞亚群，其主要产生粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF），被命名为THGM6。THGM细胞的分化由IL-7通过激活信号转导子和转录激活子5（STAT5）所驱动。这类细胞大量表达GM-CSF，但对其他TH细胞特征性细胞因子（如IFNγ和IL-17）的表达水平较低6。研究发现，GM-CSF在CD4+ T细胞介导的神经炎症发生过程中起关键作用7
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方案
本方案中使用的所有小鼠均为C57BL/6遗传背景，饲养于新加坡国立大学的无特定病原体环境中。所有实验均依照新加坡国立大学机构动物护理和使用委员会批准的方案进行。
1. 试剂与材料准备
- 配制含有2%胎牛血清（FBS）和1 mM乙二胺四乙酸（EDTA）的500 mL磷酸盐缓冲液（PBS）。
注意：为获得最佳效果，整个操作过程中应将缓冲液置于冰上。 - 配制50 mL完全RPMI培养基，包含RPMI 1640、10% FBS和1%青霉素-链霉素。在进行THGM细胞分化时，使用含有50 µM β-巯基乙醇的完全RPMI培养基。β-巯基乙醇需在通风橱中添加。
- 通过将抗CD3e抗体浓缩液用PBS稀释至3 μg/mL，配制7.5 mL抗CD3e抗体混合液。向每个孔中加入150 μL抗体混合液以包被48孔板，并将板在37 °C孵育至少1小时，或在4 °C过夜孵育。
- 对剪刀和镊子进行灭菌处理，并在每次解剖操作间隙将其保存在70%乙醇中。
2. 小鼠脾细胞的制备
- 使用机构批准的 CO2 窒息法或颈椎脱位法处死 6–8 周龄的小鼠。用 70% 乙醇喷洒小鼠，并将其仰卧固定在聚苯乙烯板上。将小鼠转移至生物安全柜中，进行后续操作。
- 用镊子夹住皮肤，使用剪....
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结果
从两只8周龄雄性C57BL/6小鼠中分离出的初始CD4+ T细胞被分为三部分。其中一部分细胞按照所述方案诱导分化为THGM细胞；另一部分细胞在抗IL-4抗体（10 µg/mL）存在下，于THGM诱导条件下培养，以检测IL-4阻断对THGM分化的影响；最后一部分细胞则在TH17分化条件下培养（3 µg/mL抗CD3e、1 µg/mL抗CD28、10 ng/mL TGFβ、30 ng/mL IL-6、10 µg/mL抗IFNγ和10 µg/mL抗IL-4）。分化3天后，收集细胞并重新刺激，通过细胞内细胞因子染色、qPCR和ELISA分析细胞因子表达。细胞内细胞因子染色与FACS分析结果显示，在THGM分化条件下培养的细胞中约有55%为表达GM-CSF的细胞（图1A），而在TH17分化条件下分化的细胞中仅有约2%表达GM-CSF。此外，与TH17分化条件诱导出8.17.......
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讨论
在此，我们描述了一种实验方案 体外 TH从小鼠初始CD4+ T细胞诱导GM分化，随后对分化细胞进行分析以验证该方法。值得注意的是，脾脏和淋巴结均可用于初始CD4+ T细胞的分离与纯化HGM分化。通过胞内细胞因子染色结合流式细胞术检测细胞因子表达，结果显示在T条件下约55%的细胞被诱导为表达GM-CSF的细胞HGM 条件（图1A）。与T条件下的细胞相比H17 种分化条件下，在 T 分化条件下的细胞HGM 条件下含有基础水平的 IL-17 表达细胞群；然而， il17 通过qPCR无法检测到基因表达（图 2A).
有趣的是，尽管添加了IFNγ中和抗体，我们仍检测到TH17和THGM细胞中存在低水平的Ifng mRNA表达，且表达IFNγ的TH.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究获得了新加坡国立大学卫生系统基金（T1-2014 Oct-12 和 T1-2015 Sep-10）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| RPMI 1640 | Biowest | L0500-500 | |
| 经热灭活的胎牛血清（FBS Heat Inactivated） | Capricorn | FBS-HI-12A | |
| 青霉素-链霉素（Penicillin-Streptomycin） | Gibco | 15140122 | |
| 10x PBS | 1st Base | BUF-2040-10 | 用无菌水稀释至1x PBS |
| EDTA | 1st Base | BUF-1053-100ml-pH8.0 | |
| 10x ACK 裂解缓冲液（10x ACK buffer） | Biolegend | 420301 | 用无菌水稀释 |
| 细胞滤筛（Cell strainer） | SPL Life Sciences | 93070 | |
| CD4 微珠（CD4 microbeads） | Miltenyi Biotec | 130-049-201 | |
| 2-巯基乙醇（2-Mercaptoethanol） | Sigma | M7522 | |
| LS 分离柱（LS column） | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| 磁力架（magnetic stand） | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| 1 mL 注射器（1 mL syringe） | Terumo | SS+01T | |
| 离心机（Centrifuge） | Eppendorf | Eppendorf 5810R | |
| Sony SY3200 细胞分选仪（Sony SY3200 cell sorter） | Sony | Sony SY3200 cell sorter | |
| 50 mL 圆锥形离心管（50 mL conical centrifuge tube） | Greiner Bio-One | 210261 | |
| 15 mL 圆锥形离心管（15 mL conical centrifuge tube） | Greiner Bio-One | 188271 | |
| FACS 管（FACS tube） | Corning | 352054 | |
| 24 孔细胞培养板（24 well cell culture plate） | Greiner Bio-One | 662160 | |
| 抗小鼠 CD4 PerCP-eFluor 710（anti-mouse CD4 PerCP-eFluor 710） | eBioscience | 46-0041-82 | |
| PE 标记的抗小鼠 CD25（IL-2Ra, p55）（PE conjugated anti-mouse CD25 (IL-2Ra, p55)） | eBioscience | 12-0251-82 | |
| 抗人/小鼠 CD44 APC（anti-human/mouse CD44 APC） | eBioscience | 17-0441-82 | |
| 抗小鼠 CD62L FITC（anti-mouse CD62L FITC） | eBioscience | 11-0621-85 | |
| 改进型 Neubauer 计数板（Neubauer-improved counting chamber） | Marienfeld | 640010 | |
| Hyclone 台盼蓝溶液（Hyclone Trypan Blue Solution） | GE healthcare Life Sciences | SV30084.01 | |
| 显微镜（microscope） | Nikon | Nikon Elipse TS100 | |
| 纯化的 抗小鼠 CD3e 抗体（Purified anti-mouse CD3e antibody） | Biolegend | 100314 | |
| 纯化的仓鼠抗小鼠 CD28 抗体（Purified hamster anti-mouse CD28） | BD Biosciences | 553295 | |
| 纯化的大鼠 抗小鼠 IFNγ 抗体（Purified Rat anti-mouse IFN-γ antibody） | eBioscience | 16-7312-85 | |
| 纯化的抗小鼠 IL-4 抗体（Purified anti-mouse IL-4 Antibody） | Biolegend | 504102 | |
| 重组小鼠 IL-7 蛋白（Recombinant Mouse IL-7 Protein） | R&D system | 407-ML | |
| 重组人 TGF-β（recombinant human TGF-beta） | R&D system | 240-B-010 | |
| PMA | Merck Millipore | 19-144 | |
| 离子霉素（Ionomycin） | Sigma | I0634 | |
| 高尔基体阻断剂蛋白转运抑制剂（GolgiPlug protein transport inhibitor） | BD Biosciences | 51-2301KZ | |
| 胞内固定和透化缓冲液试剂盒（Intracellular Fixation&Permeabilization buffer set） | eBioscience | 88-8824-00 | |
| 抗小鼠 GM-CSF PE（anti-mouse GM-CSF PE） | eBioscience | 12-7331-82 | |
| FITC 标记的抗小鼠 IL-17A（FITC anti-mouse IL-17A） | Biolegend | 506908 | |
| APC 标记的抗小鼠 IFN-γ（APC anti-mouse IFN-gamma） | Biolegend | 505810 | |
| GO Taq qPCR 预混液（GO Taq qPCR master mix） | Promega | A6002 | |
| 小鼠 GM-CSF ELISA 即用型试剂盒（mouse GM-CSF ELISA Ready-SET-Go!） | invitrogen | 88-7334-88 | |
| 小鼠 IL-17A 未包被 ELISA 试剂盒（Mouse IL-17A Uncouted ELISA） | invitrogen | 88-7371-22 |
参考文献
- Zhu, J., Paul, W. E. CD4 T cells: fates, functions, and faults. Blood. 112, 1557-1569 (2008).
- Kara, E. E., et al. Tailored immune responses: novel effector helper T cell subsets in protective immunity. PLoS Pathogens. 10, e1003905(2014).
- B....
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重印与许可
