我们报告了用于表征坏死性凋亡中由MLKL介导的质膜破裂的方法，包括常规和共聚焦活细胞显微成像、扫描电子显微镜以及基于核磁共振的脂质结合分析。
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本文内容
摘要
摘要
坏死性凋亡是一种程序性细胞死亡通路，由受体相互作用蛋白激酶3（RIPK3）的激活所触发。RIPK3可磷酸化并激活混合谱系激酶样结构域假激酶MLKL，导致细胞膜破裂或通透化。坏死性凋亡是一种与多种病理过程相关的炎症性通路，包括自身免疫、感染性疾病、心血管疾病、中风、神经退行性疾病以及癌症。本文描述了可用于鉴定MLKL在坏死性凋亡中作为细胞膜破裂执行者的实验方案。我们利用常规荧光和共聚焦荧光活细胞成像技术，对细胞中坏死性凋亡的过程进行可视化观察。 坏死性凋亡，MLKL，RIPK3，活细胞成像，细胞膜破裂，程序性细胞死亡，假激酶，磷酸化 显微镜以及利用电子显微镜观察固定细胞，共同揭示了MLKL在质膜形成大孔洞之前从细胞质溶胶向质膜的重新分布。我们呈现 体外 利用脂质进行核磁共振（NMR）分析以鉴定MLKL介导的坏死性凋亡的潜在调节因子。基于该方法，我们鉴定了MLKL对脂质的定量结合偏好，并发现磷脂酰肌醇磷酸盐（PIPs）是MLKL的关键结合分子，对坏死性凋亡过程中MLKL向质膜的靶向定位及膜通透化至关重要。
引言
鉴定坏死性凋亡的遗传组分促进了利用动物模型来研究坏死性凋亡在生理和疾病中的作用1,2,3,4,5。在小鼠中敲除RIPK3或MLKL对发育和成体稳态影响甚微，提示坏死性凋亡对生命并非必需3,6。此外，某些物种本身缺乏RIPK3或MLKL基因，进一步支持坏死性凋亡在动物中非必需的观点7,8。另一方面，通过在实验室诱导多种病理状态来挑战这些基因敲除动物模型，已揭示坏死性凋亡在炎症、天然免疫和病毒感染中具有重要作用
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方案
1. 克隆与细胞系构建
- 从人 MLKL cDNA 中 PCR 扩增对应于氨基酸残基 1-140 的 NBB 区域（NBB140），用于与二聚化结构域 2x FK506 结合蛋白（2xFKBP 或 2xFV）及 Venus 荧光蛋白进行同框的标准限制性内切酶克隆，插入强力霉素（Dox）诱导型逆转录病毒载体 pRetroX-TRE3G 中，以获得 NBB140-2xFV-Venus（表 1，图 1A-B）。
- 通过瞬时转染表达 SV40 大抗原的质粒，使来自 Green 实验室提供的相应小鼠的原代 mlkl-/- 或 ripk3-/- mlkl-/- 小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）永生化。在约 1–2 周内筛选永生化细胞，并在 DMEM 培养基中培养，该培养基添加 10% 胎牛血清（FBS）、2 mM L-谷氨酰胺、100 U/mL 青霉素和链霉素、1 mM 丙酮酸钠及非必需氨基酸，在标准组织培养箱中 37 °C、5% CO2 条件下维持培养。
- 用含有反向四环素控制的转录激活因子（rtTA）的逆转录病毒（该病毒由含杀稻瘟菌素抗性基因的质粒表达，即我们改造的质粒）转导 SV40 永生化的 mlkl-/- MEFs，并以 5 μg....
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结果
通过可诱导表达一种最小截短的MLKL构建体NBB140-2xFV-Venus，现已能够在活细胞中可视化观察调控性坏死性凋亡（necroptosis）的执行过程。该构建体仍具有诱导质膜通透化的能力，并可通过二甲氧苯基甘氨酸（Dim）诱导FKBP结构域（2xFV）的寡聚化而被激活。我们采用活细胞显微成像技术，通过动力学监测（每5分钟一次）细胞不可渗透的绿色荧光DNA结合染料的摄取情况，来观察并定量坏死性凋亡过程（图6A）。该可诱导系统非常稳健，在经Dox预孵育并表达NBB140-2xFV-Venus的细胞中，通过Dim介导的寡聚化，可在约1小时内观察到mlkl-/- MEFs细胞完全发生坏死性凋亡（图1A）。我们将此条件下的坏死性凋亡称为快速动力学坏死性凋亡。单独表达Venus蛋白（无论是否添加Dim），或在.......
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讨论
我们提供了多种技术的实验方案，这些技术联合使用可证明MLKL是介导细胞膜破裂的假定执行者24。除了用于解析调控MLKL介导的坏死性凋亡的调控网络外，这些技术也可独立应用于其他合适的生物系统的表征。从实际应用角度看，这些技术属于中低通量的发现工具。
我们常规使用NBB140-2xFV-Venus介导的坏死性凋亡的活细胞成像，以及由其他MLKL构建体诱导的坏死性凋亡，通过定点突变和小分子化学探针来系统解析MLKL在坏死性凋亡中的调控机制。特别是，我们及其他研究团队已证实，包含NBB最小区域的人源和鼠源MLKL构建体均能在人源和鼠源细胞系中介导坏死性凋亡。已有报道指出，MLKL介导的坏死性凋亡存在一个限制因素，即RIPK3与MLKL相互作用的物种特异性，这导致在TNF、smac模拟物和caspase抑制剂联合刺激的上游信号激活下，不同物种之间无法发生交叉反应25,35,
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| <强>克隆与细胞系构建 | |||
| pRetroX-TRE3G | Clontech | 631188 | |
| Tet-On 转录激活质粒 | Llambi 等, 2016 | ||
| 小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）mlkl-/- | Dillon 等, 2014 | ||
| 盐酸杀稻瘟菌素S | 赛默飞世尔科技 | BP2647100 CAS#3513-03-9 | |
| <强>细胞死亡定量与活细胞显微成像 | |||
| 多西环素 | Clontech | 631311 CAS# 24390-14-5 | |
| B/B 同源二聚化剂 AP20187 | Takara | 635059 CAS# 195514-80-8 | |
| SYTOX Green | 赛默飞世尔科技 | S7020 | |
| Syto16 | 赛默飞世尔科技 | S7578 | |
| <强>核磁共振（NMR） | |||
| 15 N 氯化铵 | 剑桥同位素实验室 | NLM-467-10 CAS# 12125-02-9 | |
| 氘代DTT | 剑桥同位素实验室 | DLM-2622-1 | |
| 重水 | Sigma Aldrich | 617385-1 CAS# 7789-20-0 | |
| 正十二烷基-β-D-麦芽糖吡喃糖苷 | Anatrace | D310 CAS# 69227-93-6 | |
| L-α磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（脑组织，猪）（铵盐） | Avanti Polar Lipids | 840046X CAS# 383907-42-4 | |
| 1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷脂酰肌醇（铵盐）（18:0 PI） | Avanti Polar Lipids | 850143 CAS# 849412-67-5 | |
| 1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1'-肌醇)（铵盐）（18:1） | Avanti Polar Lipids | 850149 CAS# 799268-53-4 | |
| <强>专用设备 | |||
| IncuCyte FLR 或 ZOOM | Essen BioScience, Inc. | 活细胞显微成像 | |
| Helios NanoLab 660 DualBeam | 赛默飞世尔科技 | 电子显微镜 | |
| <强>软件 | |||
| IncuCyte 2011A Rev2 v20111.3.4288 (FLR) | Essen BioScience, Inc. | http://www.essenbioscience.com | 成像分析 |
| FEI MAPS | 赛默飞世尔科技 | https://www.fei.com/software/maps/ | 透射电镜分析 |
| TopSpin v3.2 | Bruker BioSpin | http://www.bruker.com | 核磁共振数据采集 |
| CARA v1.9.1.7 | http://cara.nmr.ch/ | 核磁共振数据解析 | |
| Slidebook | 3i（Intelligent Imaging Innovations） | https://www.intelligent-imaging.com/slidebook | 共聚焦显微镜 |
参考文献
- Weinlich, R., Oberst, A., Beere, H. M., Green, D. R. Necroptosis in development, inflammation and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (2), 127-136 (2017).
- Kaiser, W. J., et al. RIP3 mediates the embryonic lethality of caspase-8-deficient mice. Nat....
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重印与许可
