人牙小泡干细胞的分离、鉴定及微 rna 遗传修饰

Paula Müller; Katharina Ekat; Anne Brosemann; Anne Köntges; Robert David; Hermann Lang

doi:10.3791/58089

方法文章

人牙小泡干细胞的分离、鉴定及微 rna 遗传修饰

DOI：

10.3791/58089

⸱

2018年11月16日

Paula Müller^*¹^,² , Katharina Ekat^*³ , Anne Brosemann³ , Anne Köntges³ , Robert David¹^,² , Hermann Lang³

¹Reference and Translation Center for Cardiac Stem Cell Therapy (RTC), Department of Cardiac Surgery, Rostock University Medical Center, ²Department Life, Light and Matter of the Interdisciplinary Faculty at Rostock University, ³Department of Operative Dentistry and Periodontology, Rostock University Medical Center

^* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

该协议描述了从人毛囊中提取的牙干细胞的瞬态基因工程。应用的非病毒性修饰策略可以为治疗性干细胞产品的改进奠定基础。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

迄今为止, 不同发育阶段的几种干细胞类型是治疗退行性疾病的重点。然而, 某些方面, 如最初的大规模细胞死亡和低治疗效果, 损害了他们广泛的临床翻译。移植前干细胞基因工程是优化治疗性干细胞效应的一种有前途的方法。然而, 仍然缺乏安全和有效的基因传递系统。因此, 开发合适的方法可以为解决目前干细胞疗法中的挑战提供一种途径。

本协议描述了人类牙囊干细胞 (hdfsc) 的提取和表征及其非病毒遗传修饰。产后毛囊公布, 作为一个有希望的和容易获得的来源, 收获具有高增殖潜力的成人多能干细胞。所述的隔离过程提供了一种简单可靠的方法来从受影响的智齿中获取 hdfsc。该协议还包括定义分离细胞干细胞特性的方法。对于 hdfsc 的基因工程, 提出了一种优化的阳离子脂质转染策略, 可在不产生细胞毒性影响的情况下实现高效的微 rna 导入。微 rna 是瞬态细胞操作的合适选择, 因为这些小的平移调节剂控制干细胞的命运和行为, 而不会受到稳定基因组整合的危害。因此, 该协议代表了 hdfsc 的一个安全和有效的工程过程, 这可能成为重要的优化其治疗效果。

引言

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人牙囊是一个松散的外皮衍生结缔组织^周围的发展中的牙齿 1^,²。除了协调骨分裂和成骨的功能, 牙齿爆发过程中, 该组织窝藏和祖细胞, 特别是为牙周组织 3^,⁴^,⁵的发展。因此, 牙囊被认为是收获人类成人干细胞⁶^,⁷的替代来源。

几项研究表明, 人类牙囊干细胞 (hdfsc) 能够分化为牙周系, 包括成骨细胞、韧带成纤维细胞和骨板⁸^,⁹,¹⁰.此外, 这些细胞被证明符合间充质间质间质细胞 (mscs) 的所有特征, 包括自我更新能力, 塑料粘附, 特定表面标记物的表达 (如 cd73, cd90, cd105), 以及成骨,脂原和软骨分化潜力¹¹^,¹²

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方案

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hdfsc 是从罗斯托克大学医学中心口腔颌面整形外科提供的拔牙智齿毛囊中分离出来的。所有患者均获得了知情同意和书面批准。这项研究得到了罗斯托克大学地方道德委员会的授权 (批准号: 2017-0158号)。

1. hdfsc 的分离

请注意:为了防止细菌污染, 在拔除前不应爆发智齿

准备所需的解决方案
1. 制备磷酸盐缓冲盐水 (pbs)/青霉素-流氧基霉素-谷氨酰胺 (p-s-g) 溶液: 将495毫升的 pbs 与5毫升的 p-s-g 溶液混合。在4°c 下储存50毫升的等价物。
2. 制备 hdfsc 培养基: 将445毫升的基础培养基与5毫升的抗生素剂和50毫升的胎儿牛血清 (fbs) 混合。存放在4°c。
3. 制备胶原酶 i 型库存溶液 (30 mg/ml): 稀释300毫克的胶原酶 i 型在10毫升的基础培养基中补充1% 的抗生素剂。大力混合解决方案。使用0.2μm 过滤器对溶液进行过滤。在-20°c 下储存 500μl i 型胶原酶库存溶液的等价物。
4. 制备放电酶 ii 库存溶液 (40 mg/ml): 在10毫升的基础培养基中稀释40毫克的那普酶 ii, 辅以1% 的抗生素。大力混合解决方案。使用0.2μm 过滤器对溶液进行过滤。在-20°c 下储存5....

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结果

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在这里, 我们提出了一个详细的隔离说明, 以收获 hdfsc 从人类毛囊组织。由于在常规手术中容易获得牙囊, 它是提取成人干细胞的一个很有前途的来源。

分离的 hdfsc 显示了 msc¹³定义所描述的所有特征。事实上, 细胞在描述的培养条件下是塑料-粘附物, 并显示出类似于成纤维细胞的形态 (图 1)。流式细胞仪分析显示, hdfsc 表达了某些表面抗原的面板, 包括 cd29、cd44、cd73、cd90 和 cd105, 而 cd45 和 cd117 则不存在 (图 2)。此外, 通过对脂肪酸结合蛋白 4 (fabp4)、骨钙素和琼脂糖的免疫染色, 证实了细胞在特定体外培养条件下的脂原、成骨和软骨分化潜力 (图 3)。

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讨论

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成人干细胞目前是治疗几种退行性疾病的重点。特别是骨髓 (bm) 衍生干细胞, 包括造血干细胞 (hsc) 和骨髓间充质干细胞, 正在进行密集的临床调查⁴⁷。然而, bm 收获是一种侵入性的程序, 在捐赠地点引起疼痛, 并可能导致不良事件⁴⁸。最近, 产后牙齿组织已成为一种新的、易于获取的干细胞来源。这些牙科干细胞被证明符合 msc 的所有特性, 并显示出更高的增殖能力作为 bm 衍生干细胞⁴⁹。在这里, 我们提出了一个详细的协议, 提取, 表征和工程的 hdfsc。

所述的分离程序已开发的人类牙齿毛囊的受影响智齿, 因为这种组织通常被提取和处置作为医疗废物¹⁹。然而 , 其他牙科组织 , 包括牙髓⁵⁰^,51 , 牙周韧带⁵², 去.......

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者没有什么可透露的。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

这项工作得到了罗斯托克大学医疗中心 forun 方案 (889018) 和 damp 基金会 (2016-11) 的支持。此外, pm. 和 r. d. 还由 bmbf (vip + 00240) 提供支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名	公司	目录编号	评论
小鼠抗人CD105抗体：Alexa Fluor 488	Bio-Rad	MCA1557A488	克隆SN6，小鼠
：Alexa Fluor 488	Bio-Rad	MCA928A488	单克隆
APC小鼠抗人CD29抗体	BD Biosciences	559883	克隆MAR4，单克隆
APC小鼠IgG1κ同种型对照抗体	BD Biosciences	555751	克隆 MOPC-21，单克隆
PE 小鼠抗人 CD73 抗体	BD Biosciences	550257	克隆 AD2，单克隆
PE 小鼠 IgG1 和 kappa;同种型对照抗体	BD Biosciences 555749		克隆 MOPC-21，单克隆
PE-Cy7 小鼠抗人 CD117 抗体	BD Biosciences	339217	克隆 104D2，单克隆
PE-Cy7 小鼠 IgG1，κ同种型对照抗体	BD Biosciences 557872		克隆 MOPC-21，单克隆
PerCP-Cy5.5 小鼠抗人 CD44 抗体	BD Biosciences	560531	克隆 G44-26，单克隆
PerCP-Cy5.5 小鼠 IgG2b，κ同种型对照抗体	BD Biosciences 558304		克隆 27-35，单克隆
PerCP-Cy5.5 小鼠抗人 CD90 抗体	BD Biosciences 561557		克隆 5E10，单克隆
PerCP-Cy5.5 小鼠 IgG1，κ同种型对照抗体	BD Biosciences	55095	克隆 MOPC-21，单克隆
V500 小鼠抗人 CD45 抗体	BD Biosciences 560777		克隆 HI30，单克隆
V500 小鼠 IgG1，κ同种型对照抗体	BD Biosciences 560787		克隆 X40，单克隆
FcR 封闭试剂，人	Miltenyi Biotec	130-059-901
UltraPure EDTA	Thermo Fisher Scientific	15575-020	0.5M，pH 8.0
Steritop	Merck Millipore	SCGPT05RE	0.22 µm，放射性灭菌，聚醚砜
BSA	Sigma-Aldrich	A7906
PFA	Merck Millipore	1040051000
人间充质干细胞功能鉴定试剂盒	R&D Systems	SC006
RNase 去污溶液;RNaseZap RNase 去污溶液	Thermo Fisher Scientific	AM9780
Cy3 标记的前体 miR;Cy3 染料标记的 Pre-miR 阴性对照 #1	Thermo Fisher Scientific	AM17120	5 nmol
Pre-miR miRNA 前体阴性对照 #1	Thermo Fisher Scientific	AM17110	5 nmol
阳离子脂质转染试剂;Lipofectamine 2000 转染试剂	Thermo Fisher Scientific	11668019
减血清培养基;Opti-MEM I 减血清培养基	Thermo Fisher Scientific	31985070
驴抗山羊 IgG （H+L）交叉吸附二抗、Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A-11055	多克隆
驴抗小鼠 IgG （H+L）高度交叉吸附二抗、Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A-21202	多克隆
封固剂;含DAPI的荧光盾	Sigma-Aldrich	F6057-20ML	组织学封固剂
ELYRA PS.1 LSM 780共聚焦显微镜	蔡司
BD FACS LSRII流式细胞仪	BD Biosciences
BD FACSDiva软件 6.1.2	BD Biosciences ZEN2011
软件	蔡司
胰蛋白酶/EDTA溶液（0.05%/0.02%）	PBS 中的 Biochrom	L2143	，无：Ca²⁺、Mg²⁺
胺反应染料;LIVE/DEAD™可固定近红外死细胞染色试剂盒	Fisher Scientific	L10119
PBS （1x）	Thermo Fisher Scientific	10010023	pH：7.4;无：Ca 和
Mg P-S-G （100x）	Thermo Fisher Scientific	10378016
基础培养基;Dulbecco 改良 Eagle 培养基/营养混合物 F-12	Thermo Fisher Scientific	11039021
抗生素、ZellShield	Biochrom	W 13-0050
FBS	Thermo Fisher Scientific	10500064
I 型胶原酶	Thermo Fisher Scientific	17100017
分散酶 II	Thermo Fisher Scientific	17105041
过滤器，Sterifix 针头式过滤器 0.2 µm	布劳恩	4099206
50 mL 锥形离心管	Sarstedt	62,547,254
15 mL 锥形离心管	Sarstedt	62,554,502
细胞培养瓶 75 cm²	Sarstedt	833,910,002
细胞培养瓶，25 cm²	Sarstedt	833,911,002
冻存培养基，Biofreeze	Biochrom	F 2270
冻存管	Thermo Fisher Scientific	377267	1.8 mL
台盼蓝溶液	Sigma-Aldrich	T8154	0.4 %
计数室	Paul Marienfeld
局部麻醉剂，赛洛西丁（盐酸利多卡因）2% 与肾上腺素（肾上腺素）0.001%	Mibe
NaCl 溶液	Braun		0.9 %
Vicryl 饱和度，Vicryl rapide	Ethicon		3 - 0

IgG1单克隆抗体Thermo

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Potdar, P. D., Jethmalani, Y. D. Human dental pulp stem cells: Applications in future regenerative medicine. World journal of stem cells. 7 (5), 839-851 (2015).
Lima, R. L., et al. Human dental follicle cells expres....

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