人牙小泡干细胞的分离、鉴定及微 rna 遗传修饰

摘要

该协议描述了从人毛囊中提取的牙干细胞的瞬态基因工程。应用的非病毒性修饰策略可以为治疗性干细胞产品的改进奠定基础。

摘要

迄今为止, 不同发育阶段的几种干细胞类型是治疗退行性疾病的重点。然而, 某些方面, 如最初的大规模细胞死亡和低治疗效果, 损害了他们广泛的临床翻译。移植前干细胞基因工程是优化治疗性干细胞效应的一种有前途的方法。然而, 仍然缺乏安全和有效的基因传递系统。因此, 开发合适的方法可以为解决目前干细胞疗法中的挑战提供一种途径。

本协议描述了人类牙囊干细胞 (hdfsc) 的提取和表征及其非病毒遗传修饰。产后毛囊公布, 作为一个有希望的和容易获得的来源, 收获具有高增殖潜力的成人多能干细胞。所述的隔离过程提供了一种简单可靠的方法来从受影响的智齿中获取 hdfsc。该协议还包括定义分离细胞干细胞特性的方法。对于 hdfsc 的基因工程, 提出了一种优化的阳离子脂质转染策略, 可在不产生细胞毒性影响的情况下实现高效的微 rna 导入。微 rna 是瞬态细胞操作的合适选择, 因为这些小的平移调节剂控制干细胞的命运和行为, 而不会受到稳定基因组整合的危害。因此, 该协议代表了 hdfsc 的一个安全和有效的工程过程, 这可能成为重要的优化其治疗效果。

引言

人牙囊是一个松散的外皮衍生结缔组织^周围的发展中的牙齿 1^,2。除了协调骨分裂和成骨的功能, 牙齿爆发过程中, 该组织窝藏和祖细胞, 特别是为牙周组织 3^,4,5的发展。因此, 牙囊被认为是收获人类成人干细胞^6,7的替代来源。

几项研究表明, 人类牙囊干细胞 (hdfsc) 能够分化为牙周系, 包括成骨细胞、韧带成纤维细胞和骨板^8,9,¹⁰.此外, 这些细胞被证明符合间充质间质间质细胞 (mscs) 的所有特征, 包括自我更新能力, 塑料粘附, 特定表面标记物的表达 (如 cd73, cd90, cd105), 以及成骨,脂原和软骨分化潜力^11,12,13。其他研究还揭示了 hdfsc^{2、14、15、16}、17^{、18的神经}分化潜力。

由于其具有广阔的特性和易于访问, hdfsc 最近与组织工程^{19、20、21 相关.}第一批研究集中于 dfsc 再生骨、牙周和牙根的潜力^{19、22、23、24、25、26、 27,28,29,30}。自从了解 hdfsc 的神经源性能力以来, 对其作为神经退行性疾病潜在治疗方法的应用进行了 31^、32、33项研究。hdfsc 在其他组织 (如角膜上皮) 的再生方面也变得越来越重要,^34,35。hdfsc 的治疗潜力不仅取决于其直接分化潜力, 还取决于其副分泌活性。最近, hdfsc 已被证明分泌了大量的生物活性因子, 如基质金属蛋白酶 (mmp)、胰岛素样生长因子 (igf)、血管内皮生长因子 (vegf)、碱性成纤维细胞生长因子 (bfgf) 和肝细胞生长因子 (hgf), 在血管生成、免疫调节、额外细胞基质重塑和修复过程中起着至关重要的作用³⁶。

然而, 干细胞治疗的广泛临床翻译仍然受到几个挑战的损害, 如大规模初始细胞死亡和低有益干细胞效应^37,38。基因工程为应对这些挑战提供了一个很有希望的策略, 因此可以大大提高干细胞的治疗效果 38^、39、40.对于瞬态细胞操作, 微 rna (miRs) 是合适的候选, 因为这些小的平移调节剂控制干细胞的命运和行为, 而不会受到稳定基因组整合^的危险 41^,42,43. 迄今为止, 已确定了若干有益的 miRs, 以促进干细胞增殖、存活、归巢、辅助治疗活动以及它们被分化为几个血统⁴⁴。例如, 与未经修饰的 mscs 45 相比, miR-133a 工程 mscs^在梗死大鼠心脏中的存活率和植入物增加, 从而改善了心功能。同样, miR-146a 过度表达骨髓间充质干细胞被证明会分泌更多的 vegf, 这反过来又提高了缺血组织46的治疗效率。

本文详细介绍了 hdfsc 的选择性提取和基因工程。为此, 我们描述了人类毛囊的收获和酶消化, 以及随后 hdfsc 的分离。为了确定分离细胞的特征, 根据国际细胞治疗协会¹³的准则, 列入了核查海安会特性的重要说明。此外, 我们还应用阳离子脂质转染策略, 并对转染效率和细胞毒性进行评价, 对 mirr 改性 hdfsc 的产生进行了详细的描述。

方案

hdfsc 是从罗斯托克大学医学中心口腔颌面整形外科提供的拔牙智齿毛囊中分离出来的。所有患者均获得了知情同意和书面批准。这项研究得到了罗斯托克大学地方道德委员会的授权 (批准号: 2017-0158号)。

1. hdfsc 的分离

请注意:为了防止细菌污染, 在拔除前不应爆发智齿

1. 准备所需的解决方案
   1. 制备磷酸盐缓冲盐水 (pbs)/青霉素-流氧基霉素-谷氨酰胺 (p-s-g) 溶液: 将495毫升的 pbs 与5毫升的 p-s-g 溶液混合。在4°c 下储存50毫升的等价物。
   2. 制备 hdfsc 培养基: 将445毫升的基础培养基与5毫升的抗生素剂和50毫升的胎儿牛血清 (fbs) 混合。存放在4°c。
   3. 制备胶原酶 i 型库存溶液 (30 mg/ml): 稀释300毫克的胶原酶 i 型在10毫升的基础培养基中补充1% 的抗生素剂。大力混合解决方案。使用0.2μm 过滤器对溶液进行过滤。在-20°c 下储存 500μl i 型胶原酶库存溶液的等价物。
   4. 制备放电酶 ii 库存溶液 (40 mg/ml): 在10毫升的基础培养基中稀释40毫克的那普酶 ii, 辅以1% 的抗生素。大力混合解决方案。使用0.2μm 过滤器对溶液进行过滤。在-20°c 下储存500μl 的分散 ii 库存溶液。
2. 手术
   1. 注射足够量的局部麻醉剂 (最大: 2 毫升)。
   2. 创建和提高三面粘液皮瓣。不需要提高舌瓣。
   3. 用骨膜电梯保护语言方面。
   4. 用圆形的硬质金属毛刺轻轻磨口腔和远端骨。
   5. 用骨膜提升机松开毛囊的组织。用后 (第三磨牙) 钳拔出牙冠 (和毛囊), 小心地取出完整的牙齿 (胚芽) 和毛囊。
   6. 用 ncl 溶液彻底冲洗插座。
   7. 用副角膜缝合线代替粘液膜瓣 (见材料表)。
   8. 从口腔中取出牙囊, 并将其放入50毫升的 pbssep-s-g 溶液中。
      请注意:样品可在4°c 下保存, 直至进一步处理。
3. 牙囊的酶消化
   1. 预热 hdfsc 培养基和 pbssep-s-g 溶液室温 (rt)。
   2. 解冻每个胶原酶类型 i 和 dispase ii 库存解决方案的一个。在含有1% 抗生素的基础介质中加入每一种 i 型胶原酶 i 型和溶液 ii 类的 500μl, 制备 i 型和 4 mgml 扩散酶 ii 的消化液。
   3. 将提取的卵泡放入无菌培养皿中, 加入10毫升的 pbssep-s-g 溶液清洗提取的组织。重复此清洗步骤两次。
   4. 在含有10毫升 pbsse-s-g 溶液的培养皿中, 用无菌手术刀将提取出来的卵泡切成约1毫米 x 1 毫米的片。
   5. 将碎组织和 pbssep-s-g 溶液从培养皿中转移到50毫升锥形离心管中。用10毫升的 pbssep-s-g 溶液清洗培养皿, 并将溶液转移到同一管中。
   6. 在 rt 353 x克离心机管 10分钟, 并丢弃上清液。
   7. 在颗粒组织中加入5毫升的消化液。轻轻混合溶液和组织。在振动孵化器中, 在37°c 和 5% co2 下孵育混合物2小时。
   8. 离心消化细胞组织悬浮在 353 x克 10分钟在 rt. 丢弃上清液, 并重新悬浮获得的颗粒在6ml 的 hdfsc 培养基。
   9. 种子细胞悬浮液在25厘米²细胞培养瓶和孵育细胞在 37°c, 5% co 2 和 20% _o2。
      请注意:如果组织没有完全消化, 也将剩余的组织转移到细胞培养瓶中。
   10. 细胞播种后24小时小心更换培养基。之后每三天更换一次, 直到融合。
       请注意:hdfsc 应在细胞播种后24小时进行塑粘, 只需改变培养基即可从非粘附细胞和血液成分中分离出来。
4. 细胞采集
   1. 预热 hdfsc 培养基、pbssep-s-g 溶液和胰蛋白酶-乙二胺四乙酸 (edta) 溶液对 rt。
   2. 从培养瓶中丢弃上清液, 用5毫升的 pbssep-s-g 溶液清洗融合细胞。
   3. 在培养瓶中加入1毫升的 trinmsa/edta 溶液, 在37°c 孵育3分钟。在培养瓶中加入3毫升的 hdfsc 培养基, 停止消化过程。
   4. 将细胞悬浮液转移到15毫升的锥形离心管中, 在 rt 的 353 x克处将悬浮液离心 10分钟, 去除上清液, 并在适当数量的 hdfsc 培养基中重新悬浮颗粒。
   5. 计数细胞: 将10μl 细胞悬浮液与10微米的色氨酸蓝色溶液轻轻混合。将10μl 应用到计数室中, 计算 hdfsc 电池量。

2. hdfsc 的特性

1. 免疫
   1. 流式细胞仪分析用细胞的制备
      1. 准备所需的解决方案
         1. 准备 pbsedta (2mm): 将996毫升的 pbs 与4毫升 edta (0.5 m) 混合。
         2. 准备染色缓冲液: 将995毫升的 pbsedta (2mm) 与5克 bsa 混合。使用0.22μm 过滤单元对溶液进行过滤, 并将其存储在 4°c, 直至使用。
         3. 制备聚甲醛 (pfa) 库存溶液 (4%): 在100毫升 pbs 中稀释4克 pfa, 并将溶液加热至80°c。混合溶液并将 ph 值调整为7.3。alquot 获得了不同数量 (1.5 ml) 的 pfa 溶液, 并在-20°c 下储存, 直到使用。
            注意: 由于 pfa 烟雾有毒, 请在通风的烟罩中制备 pfa 溶液。
      2. 细胞采集 (1.4) 后, 将 5个 x 10 4个细胞的 14个样本转移到 1.5 ml 微离心管中。在4°c 条件下, 以 300 x g离心悬浮液10分钟。放弃上清液。
         请注意:在阴影化的房间中执行以下操作。除非另有说明, 否则将细胞和试剂放在冰上。
      3. 如表 1所示, 在一定数量的染色缓冲液 (4°c) 中重新悬浮细胞, 并添加 fcr 阻滞剂 (4°c)。
      4. 如表1所示, 在相应样品的内侧添加以下抗体: 叶绿素 (apc) 小鼠抗人类 cd29;apc 小鼠 igg1 等型对照;培碱叶绿素蛋白 (percp)-氰化物5.5 小鼠抗人类 cd44;整氯-氰基5.5 小鼠 igg2b 等型对照;v500 小鼠抗人类 cd45;v500 小鼠 igg1 等型对照;小鼠抗人类 cd73;pe 小鼠 igg1 等型对照;经 cp-氰化物5.5 小鼠抗人 cd90;整氯-氰基5.5 小鼠 igg1 同型对照;老鼠反人类 cd105: 亚历克沙·福陆 (AF)488;小鼠 igg1 负控制: af488;pe-cyinine7 小鼠抗人类 cd117;聚-氰化物7小鼠 igg1, 同型对照。在每个样本中添加抗体后, 将抗体向下旋转, 轻轻混合。在4°c 下将溶液孵化10分钟。
      5. 加入1毫升的 pbs (4°c), 并在4°c 时以 300 x g 离心样品10分钟。放弃上清液。
      6. 在100μl 的 pbs (4°c) 中重新悬浮细胞, 并添加33μl 的 pfa (4%)。混合溶液, 储存在冰上或 4°c, 直到流动细胞学分析。
   2. 细胞的流动细胞学测量
      请注意:在阴影化的房间中执行以下操作。将细胞保持在冰上, 直到测量。
      1. 为了检查表面抗原的表达, 将样品转移到适合流式细胞仪测量的管中。
      2. 使用流式细胞仪测量至少 2 x^{10 4个}事件。如图 2所示进行分析。
2. hdfsc 的多效分化潜力
   1. 使用市售的人骨髓间充质干细胞功能鉴定试剂盒来确认 hdfsc 的脂肪生成、成骨和软骨源分化潜力。应用驴抗山羊 af488 二级抗体染色脂肪酸结合蛋白 4 (fabp4) 和琼脂糖以及驴抗小鼠 af488 二级抗体染色骨钙素。对于细胞核染色, 请使用 4 ', 6-二胺-2-苯二酚 (dapi) 的安装介质。
      请注意:准备没有原代抗体的样品作为阴性对照进行微观分析。
   2. 用激光扫描共聚焦显微镜分析蛋白质的表达。显微镜设置: 40x 目标, 油浸;激发激光 488 nm (用于 af488) 和 488 nm (用于 dapi)。

3. hdfsc 的转染

1. 细胞采集 (1.4) 后, 在转染前24小时在24孔细胞培养板上播种 hdfsc。
   请注意:起始细胞密度约为每口 4 x^{10 4个}细胞。转染日细胞应达到 ~ 80% 融合。
   注: 添加一个额外的细胞样本作为流式细胞仪分析的控制。
2. 转染复合物的制备
   请注意:为了防止来自 rnase 的污染, 请在使用 rnase 去污液制备转染复合物之前, 直接清洁工作区。仅使用不含 rnase 的材料和解决方案。
   请注意:在阴影化的房间中执行以下操作。
   1. 制备 mir 库存溶液 (50μm): 在100μl 无核水中重新悬浮 cy3 标记的前体 mir (5 nmol)。alitot 获得了不同数量 (5μl) 的 mir 库存溶液, 并在-20°c 时储存在黑暗中, 直到使用。
   2. 在66.7 μl 的减少血清培养基中稀释 40 pmol mir (50μm mr 库存溶液的0.8 微米升)。将溶液轻轻混合
   3. 在66.7 μl 的降低血清培养基中稀释0.67 微米的阳离子脂基转染试剂。轻轻混合溶液, 在 rt 孵育5分钟。
   4. 孵育后, 将预稀释转染试剂加入预稀释的 mir 中。轻轻混合溶液, 在 rt 孵育15分钟。
3. 将制备的转染复合物直接滴入细胞上的培养基。通过来回摇晃24口细胞培养板, 轻轻混合。
4. 将细胞在37°c、5% co₂和 20% o2 下培养 24小时.

4. 转染分析

请注意:在阴影化的房间中执行以下操作。

1. 转染后的细胞采集
   请注意:在同一个15毫升锥形离心管中收集一个样品的所有细胞溶液。
   1. 转染24小时后, 在各自的离心管中采集样品的上清液。
   2. 用1毫升的 pbs 清洗细胞, 将 pbs 转移到相应的离心管中, 并在细胞中加入 500μl trypsin/edta (rt)。在37°c 下将溶液培养3分钟。
   3. 通过在细胞中加入1毫升培养基 (rt) 来停止胰蛋白酶化, 并将溶液转移到相应的离心管中。在4°c 条件下, 以 300 x g离心细胞10分钟。
      请注意:从这段时间开始, 除非另有说明, 否则将细胞和试剂保持在冰上。
2. 流式细胞仪分析用细胞的制备
   1. 放弃上清液。将细胞重新悬浮在100μl 的染色缓冲液 (4°c) 中, 并将细胞溶液转移到 1.5 ml 的微离心管中。
   2. 在样品中加入0.5μl 的胺活性染料, 以区分活细胞和死细胞。在4°c 下轻轻混合溶液, 孵育10分钟。
   3. 在电池和离心机中加入1毫升 pbs (4°c), 在 400xg 的电池和离心机中, 在4°c 下10分钟。放弃上清液。
   4. 在100μl 的 pbs (4°c) 中重新悬浮细胞, 并添加33μl 的 pfa (4%)。混合溶液, 储存在冰上或 4°c, 直到流动细胞学分析。
3. 细胞的流动细胞学测量
   请注意:在阴影化的房间中执行以下操作。将细胞保持在冰上, 直到测量。
   1. 将样品转移到适合流式细胞仪测量的管中。
   2. 使用流式细胞仪检测细胞活力和 mir 吸收效率。测量至少 2 x^{10 4个}事件。使用图 4中描述的门控策略。
      请注意:使用未转染的细胞作为阴性对照, 安排 cy3 阳性细胞的门控, 并计算转染引起的细胞死亡。

结果

在这里, 我们提出了一个详细的隔离说明, 以收获 hdfsc 从人类毛囊组织。由于在常规手术中容易获得牙囊, 它是提取成人干细胞的一个很有前途的来源。

分离的 hdfsc 显示了 msc¹³定义所描述的所有特征。事实上, 细胞在描述的培养条件下是塑料-粘附物, 并显示出类似于成纤维细胞的形态 (图 1)。流式细胞仪分析显示, hdfsc 表达了某些表面抗原的面板, 包括 cd29、cd44、cd73、cd90 和 cd105, 而 cd45 和 cd117 则不存在 (图 2)。此外, 通过对脂肪酸结合蛋白 4 (fabp4)、骨钙素和琼脂糖的免疫染色, 证实了细胞在特定体外培养条件下的脂原、成骨和软骨分化潜力 (图 3)。

讨论

成人干细胞目前是治疗几种退行性疾病的重点。特别是骨髓 (bm) 衍生干细胞, 包括造血干细胞 (hsc) 和骨髓间充质干细胞, 正在进行密集的临床调查⁴⁷。然而, bm 收获是一种侵入性的程序, 在捐赠地点引起疼痛, 并可能导致不良事件⁴⁸。最近, 产后牙齿组织已成为一种新的、易于获取的干细胞来源。这些牙科干细胞被证明符合 msc 的所有特性, 并显示出更高的增殖能力作为 bm 衍生干细胞⁴⁹。在这里, 我们提出了一个详细的协议, 提取, 表征和工程的 hdfsc。

所述的分离程序已开发的人类牙齿毛囊的受影响智齿, 因为这种组织通常被提取和处置作为医疗废物¹⁹。然而 , 其他牙科组织 , 包括牙髓^50,51 , 牙周韧带⁵², 去...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
小鼠抗人CD105抗体：Alexa Fluor 488	Bio-Rad	MCA1557A488	克隆SN6，小鼠
：Alexa Fluor 488	Bio-Rad	MCA928A488	单克隆
APC小鼠抗人CD29抗体	BD Biosciences	559883	克隆MAR4，单克隆
APC小鼠IgG1κ同种型对照抗体	BD Biosciences	555751	克隆 MOPC-21，单克隆
PE 小鼠抗人 CD73 抗体	BD Biosciences	550257	克隆 AD2，单克隆
PE 小鼠 IgG1 和 kappa;同种型对照抗体	BD Biosciences 555749		克隆 MOPC-21，单克隆
PE-Cy7 小鼠抗人 CD117 抗体	BD Biosciences	339217	克隆 104D2，单克隆
PE-Cy7 小鼠 IgG1，κ同种型对照抗体	BD Biosciences 557872		克隆 MOPC-21，单克隆
PerCP-Cy5.5 小鼠抗人 CD44 抗体	BD Biosciences	560531	克隆 G44-26，单克隆
PerCP-Cy5.5 小鼠 IgG2b，κ同种型对照抗体	BD Biosciences 558304		克隆 27-35，单克隆
PerCP-Cy5.5 小鼠抗人 CD90 抗体	BD Biosciences 561557		克隆 5E10，单克隆
PerCP-Cy5.5 小鼠 IgG1，κ同种型对照抗体	BD Biosciences	55095	克隆 MOPC-21，单克隆
V500 小鼠抗人 CD45 抗体	BD Biosciences 560777		克隆 HI30，单克隆
V500 小鼠 IgG1，κ同种型对照抗体	BD Biosciences 560787		克隆 X40，单克隆
FcR 封闭试剂，人	Miltenyi Biotec	130-059-901
UltraPure EDTA	Thermo Fisher Scientific	15575-020	0.5M，pH 8.0
Steritop	Merck Millipore	SCGPT05RE	0.22 µm，放射性灭菌，聚醚砜
BSA	Sigma-Aldrich	A7906
PFA	Merck Millipore	1040051000
人间充质干细胞功能鉴定试剂盒	R&D Systems	SC006
RNase 去污溶液;RNaseZap RNase 去污溶液	Thermo Fisher Scientific	AM9780
Cy3 标记的前体 miR;Cy3 染料标记的 Pre-miR 阴性对照 #1	Thermo Fisher Scientific	AM17120	5 nmol
Pre-miR miRNA 前体阴性对照 #1	Thermo Fisher Scientific	AM17110	5 nmol
阳离子脂质转染试剂;Lipofectamine 2000 转染试剂	Thermo Fisher Scientific	11668019
减血清培养基;Opti-MEM I 减血清培养基	Thermo Fisher Scientific	31985070
驴抗山羊 IgG （H+L） 交叉吸附二抗、Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A-11055	多克隆
驴抗小鼠 IgG （H+L） 高度交叉吸附二抗、Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A-21202	多克隆
封固剂;含DAPI的荧光盾	Sigma-Aldrich	F6057-20ML	组织学封固剂
ELYRA PS.1 LSM 780共聚焦显微镜	蔡司
BD FACS LSRII流式细胞仪	BD Biosciences
BD FACSDiva软件 6.1.2	BD Biosciences ZEN2011
软件	蔡司
胰蛋白酶/EDTA溶液（0.05%/0.02%）	PBS 中的 Biochrom	L2143	，无：Ca2+、Mg2+
胺反应染料;LIVE/DEAD™可固定近红外死细胞染色试剂盒	Fisher Scientific	L10119
PBS （1x）	Thermo Fisher Scientific	10010023	pH：7.4;无：Ca 和
Mg P-S-G （100x）	Thermo Fisher Scientific	10378016
基础培养基;Dulbecco 改良 Eagle 培养基/营养混合物 F-12	Thermo Fisher Scientific	11039021
抗生素、ZellShield	Biochrom	W 13-0050
FBS	Thermo Fisher Scientific	10500064
I 型胶原酶	Thermo Fisher Scientific	17100017
分散酶 II	Thermo Fisher Scientific	17105041
过滤器，Sterifix 针头式过滤器 0.2 µm	布劳恩	4099206
50 mL 锥形离心管	Sarstedt	62,547,254
15 mL 锥形离心管	Sarstedt	62,554,502
细胞培养瓶 75 cm2	Sarstedt	833,910,002
细胞培养瓶，25 cm2	Sarstedt	833,911,002
冻存培养基，Biofreeze	Biochrom	F 2270
冻存管	Thermo Fisher Scientific	377267	1.8 mL
台盼蓝溶液	Sigma-Aldrich	T8154	0.4 %
计数室	Paul Marienfeld
局部麻醉剂，赛洛西丁（盐酸利多卡因）2% 与肾上腺素（肾上腺素）0.001%	Mibe
NaCl 溶液	Braun		0.9 %
Vicryl 饱和度，Vicryl rapide	Ethicon		3 - 0